周金偉，徐綺嬪，姚婧，余樹民，曹隨忠. 四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 630；. 中國科學院動物研究所，計劃生育生殖生物學國家重點實驗室，北京 000

CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其在動物基因組定點修飾中的應用

周金偉1，徐綺嬪1，姚婧2，余樹民1，曹隨忠1
1. 四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611130；2. 中國科學院動物研究所，計劃生育生殖生物學國家重點實驗室，北京 100101

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細菌和古生菌中抵抗外源病毒或質(zhì)粒入侵的獲得性免疫系統(tǒng)，利用 CRISPR RNAs (crRNAs)引導Cas核酸酶沉默入侵的核酸。通過分子生物學改造使Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)成為一種高效的基因組定點修飾技術(shù)，并且比鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)和 TALE核酸酶(Transcription activator like effector nucleases, TALENs)結(jié)構(gòu)更簡單，更容易設計和應用。文章主要介紹了CRISPR/Cas9系統(tǒng)成為高效基因組定點修飾技術(shù)的發(fā)展歷程、Ⅱ型CRISPR/Cas的工作原理和改造過程以及在動物基因組定點修飾的應用，剖析了該技術(shù)存在的問題和現(xiàn)有改進方案，并與成功案例相結(jié)合展望了 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應用前景，以期為動物性狀改良和人類疾病動物模型的創(chuàng)立提供新思路。

CRISPR/Cas9；基因組編輯技術(shù)；人類疾病動物模型；基因組定點修飾

Keywords:CRISPR/Cas9; genome editing technique; animal models of human disease; site-directed genome modification

傳統(tǒng)的動物性狀改良是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因插入到受體基因組中，使外源基因整合在染色體基因組上改造基因功能，使其表達優(yōu)良性狀，并穩(wěn)定地傳給下一代。然而轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在如下缺點：如外源基因隨機整合與效率低下，表達可控性差，轉(zhuǎn)基因動物存在生物安全風險，并且不易獲得表型良好且穩(wěn)定遺傳的后代。因此，動物的性狀改良和人類疾病動物模型的創(chuàng)制迫切需要發(fā)展動物基因組定點修飾的精細基因編輯技術(shù)。

基因組定點編輯技術(shù)是實現(xiàn)動物品種改良和構(gòu)建人類疾病動物模型的重要研究工具，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，基因編輯技術(shù)不依賴于胚胎干細胞，能夠應用于更多物種，并且具有效率高、定向修飾精確、所需時間短以及得到的突變可以穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點。近幾年，序列特異性的核酸酶發(fā)展迅速，并且這些核酸酶具有基因組靶向修飾的能力。其中鋅指核酸酶[1](Zinc-finger nucleases, ZFNs)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶[2,3](Transcription activator like effector nucleases, TALENs)都是由序列特異DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與DNA核酸內(nèi)切酶Fok Ⅰ的切割結(jié)構(gòu)域組成。這些核酸酶能夠在特定的基因組位置造成DNA雙鏈斷裂(Double strand break, DSB)，激活細胞內(nèi)固有的同源重組(Homologous-directed repair, HDR)或非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)對斷裂的DNA進行修復，實現(xiàn)基因組的定點修飾，并在一些物種(如小鼠[4]、斑馬魚[5]、牛[6]、豬[7])中成功實現(xiàn)了基因組定點修飾。最近，在基因組定點修飾方面有了突破性的進展，科學家發(fā)現(xiàn)了一種新的基因組定點編輯技術(shù)——Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (CRISPR/Cas9)系統(tǒng)[8]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是利用RNA引導核酸酶對基因組DNA進行定點修飾，現(xiàn)已廣泛地應用于小鼠[9]、斑馬魚[10～12]、豬[13,14]、羊[15]等多個物種，暗示CRISPR/ Cas9基因組編輯技術(shù)能夠擺脫動物無干細胞系的限制，并且可在任何動物中實現(xiàn)定向、精準的基因修飾。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

CRISPR系統(tǒng)是原核生物中一種抵抗外源基因侵入的獲得性免疫系統(tǒng)[16]，在細菌和古生菌中CRISPR系統(tǒng)整合侵入宿主的噬菌體或者質(zhì)粒DNA的片段到 CRISPR位點，然后通過相應的 CRISPR RNAs (crRNAs)引導Cas核酸內(nèi)切酶損壞外源DNA序列，抵抗病毒或者噬菌體的入侵[17]。

1.1 CRISPR/Cas發(fā)展歷程

1987年，日本學者首次在大腸桿菌(E. coli)基因組中發(fā)現(xiàn)一連串短的空間間隔重復序列[18]，2002年科學家才將其命名為成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)[19]，現(xiàn)有測序結(jié)果顯示40%的細菌基因組中含有CRISPR位點。2005年，科學家們發(fā)現(xiàn) CRISPR中的許多間隔序列來源于質(zhì)粒和病毒，CRISPR的基因座能夠被轉(zhuǎn)錄，并且Cas基因編碼的蛋白具有核酸酶和解旋酶結(jié)構(gòu)域，因此推測CRISPR/ Cas是利用無義的 RNAs標記外源核酸序列的防御系統(tǒng)[20]。2008年，CRISPR/Cas被證明具有免疫能力，在E. coli中成熟的crRNAs引導Cas蛋白形成復合體，抑制病毒的增殖[21]。2012年，Jinek等[8]首次利用Ⅱ型的CRISPR/Cas系統(tǒng)實現(xiàn)了目的DNA特定位點雙鏈斷裂，為CRISPR/Cas系統(tǒng)用于基因組定點編輯奠定了基礎。

1.2 CRISPR/Cas的結(jié)構(gòu)

CRISPR是一種特殊的DNA重復序列，由高度保守的重復序列(Repeats)與間隔序列(Spacers)交叉排列組成(圖1)，在CRISPR前段有一些保守的Cas蛋白基因，這些Cas基因在CRISPR的防御體系中起著關鍵作用，并在Cas基因附近有一段幫助crRNAs成熟的轉(zhuǎn)錄活化RNA(Trans-activating crRNA, tracrRNA)。

CRISPR基因座之間都有一個重復序列隔開，轉(zhuǎn)錄這些基因座形成前體crRNA，然后通過處理加工形成成熟的crRNA，crRNA中的間隔序列能夠引導效應核酸酶復合體切割與間隔序列互補配對的雙鏈DNA。細菌固有的RNA引導免疫系統(tǒng)在執(zhí)行免疫過程中包括3個不同的步驟：(1)獲得外源DNA；(2)合成成熟crRNA，并形成RNAs-Cas核酸酶蛋白復合體；(3)通過crRNA識別外源DNA并利用Cas核酸酶損壞外源DNA[22]。

圖1 CRISPR結(jié)構(gòu)示意圖(參考文獻[23]并修改)

1.3 Ⅱ型 CRISPR/Cas系統(tǒng)的工作原理和 CRISPR/ Cas9基因組編輯技術(shù)的形成

在CRISPR/Cas系統(tǒng)的3種類型(Type Ⅰ、TypeⅡ和Type Ⅲ)中，Type Ⅱ系統(tǒng)具有簡單、高效以及功能多樣化等優(yōu)點，是用于基因組修飾技術(shù)最合適的選擇。Ⅱ型系統(tǒng)通過crRNA的引導利用單個Cas9核酸酶充分切割目的DNA的靶位點，并且能夠?qū)蚪M的任何位置進行切割。

Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)由間隔重復CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄出來的pre-crRNA、多功能的Cas9核酸酶和tracrRNA組成，其中tracrRNA促進pre-crRNA的成熟，以及形成具有切割活性的crRNA-tracrRNA-Cas9三元復合體。Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)對外源基因的干擾需要多個步驟：首先，tracrRNA與pre-crRNA的重復序列結(jié)合；第二，內(nèi)源RNase Ⅲ切割pre-crRNA/ tracrRNAs復合體，切除5′末端的間隔序列，形成成熟的crRNA，并與tracrRNA形成被稱為向?qū)NA (Single guide RNA, sgRNA)的嵌合RNA分子；第三，每一個成熟的sgRNA能夠引導Cas9蛋白定位到雙鏈 DNA的靶位點上并在原型間隔毗鄰序列(Protospacer adjacent motif, PAM)的上游3～8 bp位置對結(jié)合的序列進行切割(圖2A)。Cas9的特異性靶點依賴于原型間隔序列3′端PAM序列，不同的Cas9突變體在基因組中擁有不同的PAM序列，來源于釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的 Cas9識別一個 5′-NGG-3′的PAM，而來源于嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的 Cas9分別識別 5′-NNAGAAW-3′的 PAM 和5′-NNNNGATT-3′的PAM[24]。Cas9擁有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，分別是蛋白中間的HNH結(jié)構(gòu)域和蛋白氨基酸末端附近的RuvC-like結(jié)構(gòu)域，其中HNH切割與crRNA互補的鏈，切割位點位于PAM序列上游3 bp，RuvC-like切割非互補鏈，切割位點位于PAM序列上游3～8 bp，從而造成雙鏈的斷裂[8]。CRISPR/ Cas9產(chǎn)生的 DSB能夠激活細胞和生物體自身修復機制，產(chǎn)生兩種不同的修復途徑NHEJ和HDR修復(圖 2B)。NHEJ能夠高效地引入不同長度的插入或者缺失突變，導致轉(zhuǎn)錄閱讀框編碼序列，轉(zhuǎn)錄激活相關的啟動子和增強子的損壞；而HDR的修復通常會引入特定位點的突變或者在外源供體 DNA模板存在時對靶位點進行可預測的插入[25]。

2012年Jinek等[8]在對Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因沉默機制進行研究時發(fā)現(xiàn)，crRNA的原型間隔序列和基因組中原型間隔毗鄰序列決定了 Cas9在基因組中的靶位點，并且只有當crRNA和tracrRNA同時存在形成一種雙鏈二級結(jié)構(gòu)時 Cas9才能對質(zhì)粒DNA或者短的雙鏈DNA進行切割，因此Jinek等將crRNA的3’末端與tracrRNA的5’末端相連，使crRNA: tracrRNA成為單一轉(zhuǎn)錄的融合RNA，此融合RNA具有crRNA與tracrRNA互補配對的發(fā)卡結(jié)構(gòu)從而模仿野生型crRNA: tracrRNA的成對RNA結(jié)構(gòu)引導Cas9對DNA特定位點進行切割。在融合RNA的驗證實驗中發(fā)現(xiàn)tracrRNA 3’末端的長度將影響Cas9對DNA靶位點的識別效率，tracrRNA 3’末端的長度比crRNA:tracrRNA配對區(qū)域長5～12個堿基時Cas9對DNA靶位點的識別效率最高。通過改變crRNA中的原型間隔序列成功實現(xiàn)了Cas9在GFP基因中多個位點的打靶，開啟了CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因組編輯的序幕。

1.4 CRISPR/Cas9打靶區(qū)域和sgRNA打靶位點的選擇

對于sgRNA來說，選擇什么樣的啟動子來表達這一段RNAs可能會限制靶位點的選擇。RNA聚合酶Ⅲ依賴的U6或者T7啟動子在對RNA進行轉(zhuǎn)錄時分別需要在RNA的5′端多一個G或者GG。因此這些 sgRNA的表達就會形成 GN16-19NGG或者GGN15-18NGG的gRNA，導致在隨機的基因組DNA中每32 bp或者128 bp才會出現(xiàn)一個靶位點。為了檢測Cas9造成靶位點的雙鏈斷裂，需要在NGG的5′上游3 bp處設計一個用于限制性片段長度分析的酶切位點。一種策略就是減少靶位點設計的限制條件，比如放棄RNAs 5′端的第一個或者前兩個堿基(此種方式將會使sgRNA在這些位置與基因組出現(xiàn)錯配)。另外一種策略就是先設計出sgRNAs 5′端無G或者GG序列，然后在進行引物合成時sgRNA 5′端加入G或者GG，因此轉(zhuǎn)錄出的gRNA會比設計的長1～2 bp。以上兩種方法都能合成有活性的sgRNA，但是在基因修飾中會使Cas9核酸酶有不同的效率[26]。

圖2 Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)的成熟與工作原理(參考文獻[23]并修改)

CRISPR/Cas9對基因組 DNA的特異切割需要兩個主要的因素：一個是 20 bp的引導序列，另一個是存在于sgRNA結(jié)合位點3′末端的PAM序列。sgRNA中20 bp的序列能夠和基因組的DNA靶位點互補配對，也能夠和基因組中成千上萬的其他序列進行不完美的配對(脫靶)。研究表明，Cas9的活性和切割特異性由靠近PAM序列的8～12 bp決定，并且PAM末端的部分錯配不會影響Cas9的活性，因此必須重視CRISPR/Cas9的脫靶效應[27]。

針對sgRNA的設計策略，在設計基因組靶位點的引導序列時，研究者需要對引導序列的特異性和潛在脫靶位點進行評估。對于靶位點的選擇，研究者可以使用一些在線設計工具，如：ZiFiT Targeter software (http://zifit.partners.org)[28]和麻省理工學院張鋒實驗室建立的CRISPR設計工具(http://crispr.mit.edu/)[29]。其中張鋒實驗室的在線設計工具能夠預測在基因組中的潛在脫靶位點，并根據(jù)脫靶位點錯配堿基數(shù)位置和分布進行脫靶評分(分數(shù)反映脫靶的可能性)，并且能夠給每一個設計的 gRNA進行評分(分數(shù)高的表示脫靶效率低)。通過軟件預測，選擇脫靶位點少并且靶序列在外顯子上的靶位點。在實驗中還應該對5個潛在脫靶序列進行檢測，評估靶序列的脫靶效應。

2 CRISPR/Cas9在基因組編輯中的應用

2013年，Cong等[30]利用Jinek改造的CRISPR /Cas9系統(tǒng)最早在人類細胞和小鼠細胞中成功實現(xiàn)了基因組的定點編輯，開啟了基因組編輯的新時代。之所以稱其開啟了基因組編輯的新時代，是因為CRISPR/Cas9系統(tǒng)一方面同樣具有ZFNs和TALENs的基因編輯可遺傳以及修飾多樣性等優(yōu)點，另一方面還具有其獨特優(yōu)勢：(1) CRISPR/Cas9的靶點在基因組中擁有非常高的分布頻率，在基因組中幾乎每8 bp就有一個靶點；(2) 可以同時對多個靶點進行基因操作；(3) 實驗周期短，設計簡單，節(jié)約大量的時間和經(jīng)濟成本。

到目前為止，CRISPR/Cas9被廣泛地應用于多個物種和多種細胞類型，并且獲得了高效的基因修飾結(jié)果(表1)。

表1 通過CRISPR/Cas9基因定點編輯的細胞類型和生物體

Cong等[30]構(gòu)建了兩種類型的Ⅱ型 CRISPR/ Cas9系統(tǒng)，證明縮短的sgRNA(Truncated gRNA, trusgRNA)能夠提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性；PAM序列3′ 端堿基錯配不會影響剪切效率；并且把多個引導序列集合在一個gRNA上能夠引導Cas9實現(xiàn)基因組多位點的同時編輯，顯示了CRISPR/Cas9系統(tǒng)操作簡單、應用范圍廣的特點。Thomas等[12]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在斑馬魚胚胎中通過顯微注射的方法成功實現(xiàn)了 Gal4定點編輯，并且在注射sgRNA和Cas9 mRNA的同時加入了與目的Gal4突變位點同源的含有eGFP的供體DNA序列，成功實現(xiàn)了 eGFP的插入，效率達到了 22%。Yin等[42]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在斑馬魚眼中實現(xiàn)了ascl1a基因的條件性敲除，對斑馬魚光感受器的再生機制研究提供了新的方向。Wang等[9]在小鼠胚胎中同時注射體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA和多基因sgRNAs實現(xiàn)了(Tet1、Tet2、Tet3、Sry和Uty)多基因同時定點突變。Wu等[43]利用CRISPR/Cas9對一只Crygc顯性突變的小鼠進行基因治療使其獲得了健康的后代，共同注射Cas9 mRNA和靶向Crygc基因的sgRNA到Crygc顯性突變合子中，利用外源的寡聚核苷酸或者內(nèi)源的WT等位基因作為供體通過同源重組修復方式對 Crygc基因進行修復，獲得了能夠生育并且能將修正后的 Crygc基因傳給下一代的健康小鼠，此項成果為CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于遺傳疾病的基因治療提供了依據(jù)。Li等[44]利用多個sgRNAs共同作用于人和老鼠中，成功實現(xiàn)了DNA調(diào)控元件和基因簇的倒位和串聯(lián)，并且能夠高效正確的倒位和串聯(lián)幾十bp甚至幾百kb的DNA片段；在人類細胞中4 個sgRNAs的共同作用實現(xiàn)了Pcdh基因簇的成功倒位和串聯(lián)；在小鼠中利用成對的 sgRNAs實現(xiàn)了基因組任意片段大小的刪除和染色體倒位，突變效率與兩個sgRNAs在染色體中的間隔長度有關。

雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)被改造為基因編輯工具僅兩年多時間，但是CRISPR/Cas9技術(shù)用于動物品種改良和人類疾病動物模型的創(chuàng)制已經(jīng)有了一些可喜的成果。例如，南京大學模式動物研究所黃行許教授課題組首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了內(nèi)源Ppar-γ、Rag1基因突變的靈長類動物食蟹猴(Macaca fascicularis)[41]；Zhou等[14]利用 CRISPR/Cas9技術(shù)與體細胞核移植(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)的有機結(jié)合，獲得了TYR、PARK2、PINK1突變豬；Ni等[15]獲得了MSTN、NUP、PrP與BLG基因突變的山羊；Sato等[45]獲得了 α-1,3-半乳糖苷酶(α-1, 3-galactosyltransferase，α-GalT)雙等位基因缺失的豬胎兒成纖維細胞，為人類異種器官移植研究提供了幫助；Chen等[46]利用 CRISPR/Cas9系統(tǒng)對獼猴(Macaca mulatta)的肌萎縮蛋白基因(Dystrophin gene)進行了嵌合打靶突變，其突變效率達到了87%，人類臨床上杜氏肌萎縮癥疾病(Duchenne muscular dystrophy, DMD)患者都存在肌萎縮蛋白基因突變，該研究發(fā)現(xiàn)肌萎縮蛋白基因缺失的獼猴出現(xiàn)肌營養(yǎng)蛋白明顯減少以及肌肉萎縮的表型與人類早期 DMD臨床表型相似。這些成果為利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對動物進行基因修飾、品種培育和人類疾病動物模型創(chuàng)制提供了重要的參考依據(jù)。

Hai等[13]和 Zhou等[14]以豬為研究對象，應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立了基因修飾的動物疾病模型，將對人類疾病和家畜疫病的發(fā)病機理和治療方法的研究起到推動作用。豬是我國最重要的家畜品種之一，同時也是生物醫(yī)學研究中重要的模式動物。小型豬在心血管、胃腸道等多項生理特征上比嚙齒類更接近人類，其器官大小與功能也與人十分接近，而且其產(chǎn)仔量高易繁殖?；诖耍瑢ωi進行精細的基因組修飾，從而建立用于研究豬的疾病或人類疾病的模型，對于畜牧生產(chǎn)和生物醫(yī)學研究都具有重要價值。賴良學研究組利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得TYR敲除的豬胎兒成纖維細胞(Pig fetal fibroblasts, PFF)，然后通過SCNT 得到成活的TYR敲除豬，TYR敲除導致豬存在典型的白化表型[14]；周琪領導的研究團隊直接向廣西巴馬小型豬的受精卵中注射定點切割vWF的Cas9 mRNA和sgRNA，高效地獲得了雙等位基因突變的廣西巴馬小型豬，人類臨床上Ⅰ型和Ⅲ型血管性血友病患者都存在vWF的突變，該研究還發(fā)現(xiàn)這些vWF敲除豬具有嚴重的凝血功能障礙，與血管性血友病患者的臨床表型相似[13]。最近本研究團隊還應用CRISPR/Cas9技術(shù)與顯微注射技術(shù)獲得小眼畸形相關轉(zhuǎn)錄因子(Microphthalmia-associated transcription factor, MITF)雙等位基因缺失的廣西巴馬小型豬，其體內(nèi)突變效率達到了100%。

2015年CIRSPR/Cas9在致病基因篩選方面有了新的突破。Chen等[47]將含有Cas9-GFP表達質(zhì)粒的原癌細胞通過小鼠全基因組 CRISPR敲除引導文庫處理，并將處理后的細胞皮下注射到小鼠體內(nèi)，5周后發(fā)現(xiàn)這些原癌細胞轉(zhuǎn)移到肺部，通過分離和測序分析肺部癌癥細胞，發(fā)現(xiàn) Nf2、Pten、Trim72、Cdkn2a、Fga、Cryba4、miR-152和miR-345等基因與腫瘤進化和轉(zhuǎn)移有關。這項研究使得利用CIRSPR/Cas9在體內(nèi)鑒別癌癥和其他復雜疾病中的重要基因邁出了關鍵一步。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展趨勢

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展趨勢可分為兩個方面：(1)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)自身的完善；(2)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)新的生物學功能開發(fā)。

3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的自我完善

CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶位點只有20 bp左右，并且在基因組中每8 bp就存在一個靶位點，因此能夠靈活地實行基因定點編輯，可以將多個引導序列串聯(lián)在一起引導 Cas9實現(xiàn)基因組多位點或多基因的同時編輯。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對不同物種和不同基因進行編輯時其效率有較大的差異，因此CRISPR/Cas9系統(tǒng)的穩(wěn)定性還有待于更全面地探索和研究，進而提高該系統(tǒng)的高效性和普遍適用性。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性是由 PAM前 20 bp的RNA與DNA互補配對決定的，在基因組中存在很多與這 20 bp序列不完全匹配的位點，因此理論上CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶的概率會較高。Cong等[30]在人類細胞中檢測CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性，發(fā)現(xiàn)RNA-DNA互補配對時存在5個堿基錯配，該系統(tǒng)仍會對此位點進行非特異性切割。目前，已有科研人員對CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應進行了相應研究。Fu等[48]在細胞中使用17～18 bp縮短的sgRNA能夠降低脫靶效率，并且直接轉(zhuǎn)染合成的sgRNA比轉(zhuǎn)染質(zhì)粒有更高的特異性；Jienk等[8]對sgRNA研究表明，延伸sgRNA的3′端能增加CRISPR/Cas9系統(tǒng)在目的基因位點的突變效率，降低脫靶效率。

3.2 CRISPR/Cas9新的生物學功能開發(fā)

目前CRISPR/Cas9的應用主要集中在基因組修飾，而CRISPR/Cas9還能開發(fā)出更多的生物學功能。由于RNAs粘附在sgRNA末端不會影響sgRNA綁定 Cas9，因此將功能蛋白與無核酸酶活性的Cas9(dCas9)融合，從而實現(xiàn)功能蛋白與 DNA序列的結(jié)合。因此，Cas9攜帶一些融合蛋白或融合RNA到雙鏈DNA序列，可以調(diào)控基因的表達和染色體結(jié)構(gòu)。例如：利用調(diào)控復合體與染色體的精細交互作用調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，可以利用sgRNA將dCas9作為假的轉(zhuǎn)錄因子引入到基因的關鍵位點，可能會影響轉(zhuǎn)錄因子與染色體的結(jié)合；此外，利用 dCas9融合蛋白和sgRNA將未知功能的單個因子綁定到基因組的任何位置，將會為基因功能和細胞信號通路的研究提供新的策略[49]。

首先，CRISPR/Cas9能夠?qū)崿F(xiàn)根據(jù)科研人員的期望直接上調(diào)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄水平。在之前研究中科研人員利用TALE效應將轉(zhuǎn)錄激活效應因子VP64結(jié)合到基因的啟動子區(qū)域能夠促進轉(zhuǎn)錄[50]?？蒲腥藛T利用CRISPR/Cas9在基因組中的定位功能，構(gòu)建了dCas9-VP64融合蛋白，以及sgRNA綁定的MS2-VP64蛋白，這兩種重組蛋白需要多個Cas9-sgRNA活性因子的協(xié)同作用才能夠明顯的提高目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。Polstein 等[51]將光誘導異二聚體蛋白CRY2融合到VP64的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，CIBN融合到dCas9的C端和N端，并將這兩種重構(gòu)蛋白和靶向人類IL1RN啟動子的4個sgRNA同時轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞，發(fā)現(xiàn)在藍光的刺激下細胞IL1RN的表達量提高了10～100倍。Konermann等[52]將轉(zhuǎn)錄因子與dCas9融合或sgRNA綁定，將相應轉(zhuǎn)錄激活因子進行組合篩選出sgRNA-dCas9-VP64與MS2-p65-HSF1協(xié)同作用的組合方式，此種組合將 TINCR、HOTTIP、PCAT、LINC00925、LINC00514和LINC00028基因的表達量提升10～100倍。利用此種方法，建立了70 290個sgRNAs的文庫，將CRISPR元件引入大量體外培養(yǎng)的黑色素瘤細胞，不同細胞對應靶標不同基因的引導RNA，然后用PLX-4720處理這些細胞，最終確定了 13個特殊的基因可以使癌細胞對PLX-4720產(chǎn)生抗藥性。一般而言，只有當多個基因同時進行復雜調(diào)控時，才能夠?qū)е录膊』驀乐厣飳W效應的發(fā)生。因此，為了詳盡地了解疾病或生物學效應的基因調(diào)控網(wǎng)絡，需要利用基因分庫和基因劑量進行實驗，以便確定是哪些基因共同決定了某些性狀。在未來的研究中，能夠?qū)Ω鞣N不同的效應結(jié)構(gòu)域進行多重靶向和多重調(diào)控的CRISPR/Cas9系統(tǒng)將會成為了解基因調(diào)控網(wǎng)絡的萬能工具。

其次，利用ZFN效應蛋白和TALE效應蛋白招募轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域能夠有效地抑制內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄。目前，對 CRSPRi的研究也有了新的成果。Ji 等[53]構(gòu)建了dCas9與相應sgRNA共表達的質(zhì)粒，使大腸桿菌中mRFP的表達量下降了330倍；Gilbert 等[54]將 dCas9與轉(zhuǎn)錄抑制因子 KRAB(Krüppel associated box)結(jié)合組成dCas9-KRAB融合蛋白，并用慢病毒轉(zhuǎn)染使其在HeLa細胞中持續(xù)表達，在轉(zhuǎn)鐵蛋白受體CD71和趨化因子受體CXCR4的轉(zhuǎn)錄起始位點設計了相應的 sgRNAs，將其轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定表達dCas9-KRAB融合蛋白的 HeLa細胞中，CD71和CXCR4表達量下降 60%～80%，并且干擾效率受到sgRNA與靶位點結(jié)合效率的影響；Choudhary等[55]構(gòu)建了一種優(yōu)化的 dCas9，其在結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)中的表達量是普通dCas9的80倍，在sgRNAs的靶向引導下使分支桿菌中engA、ftsZ、clpP2、groEL1、groES、clpC1和yidC的表達量下降80%，證明CRISPRi具有多基因同時沉默的能力。此外，CRISPR/Cas9在轉(zhuǎn)錄抑制方面的作用還可以用于真核生物抗病毒研究，通過阻止外源入侵病毒基因的轉(zhuǎn)錄，將與某些病毒基因特定的sgRNA和Cas9阻遏物的編碼序列整合在生物體中，能夠獲得免疫DNA病毒的生物體。此種構(gòu)想可用于培育出免疫任何 DNA病毒的優(yōu)勢農(nóng)作物或者家畜。

再次，Maeder等[56]將TALE與Tet1的羥化酶催化域融合，使用此種TALE-Tet1融合蛋白使HEK293 和HeLa細胞中RHOXF2(一種只在雄性生殖細胞中表達的印跡基因)基因的去甲基化程度提高了15%，并且在HEK293和HeLa細胞中檢測到了高水平的RHOXF2 基因mRNA。雖然文獻中還未見CRISPR/Cas9的染色體修飾功能，但是其在表觀遺傳修飾方面仍然具有廣闊的發(fā)展空間。原則上，Cas9能夠精確地招募染色質(zhì)-重構(gòu)復合體(Chromatin-remodeling complexes)，包括 Swi-Snf、組蛋白乙?；?Histone acetylases)、組蛋白去乙?；?Histone deacetylases)、甲基化酶(Methylases)和去甲基化酶(Demethylases)、激酶和磷酸化酶，以及 DNA甲基化酶(Methylases)和去甲基化酶(Demethylases)。如果這些構(gòu)想能夠成功實現(xiàn)，科研人員將有能力研究生物體的表觀遺傳調(diào)控，并且能延長任何基因的表達期限[49]。

此外，CRISPR/Cas9還可以用于調(diào)控基因組的結(jié)構(gòu)，通過構(gòu)建Cas9重組酶，引導更加精確的基因修飾，將用于人類基因治療或者靶向藥物的研制。

4 結(jié) 語

綜上所述，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是一種強大的基因工程工具，將會在基因功能解析、人類基因治療、靶向藥物研制、人類疾病動物模型的創(chuàng)制以及家畜育種中大放異彩，有望加速豬、牛、羊等重要家畜性狀改良與分子定向育種。更令人振奮的是，CRISPR/Cas9具有設計簡單、耗時短、節(jié)約成本、實驗操作性強等優(yōu)勢，必將成為普通生物學實驗室的常用技術(shù)。因此，有理由相信該技術(shù)將對生物學領域的發(fā)展起到深遠影響。雖然關于

CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的部分問題有待于進一步解決與發(fā)展，但是隨著科研人員對CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究的不斷深入使其穩(wěn)定性與廣泛應用性的進一步完善，CRISPR/Cas9系統(tǒng)將更好的幫助科研人員研究基因的功能，探索基因組的奧秘。

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(責任編委: 高彩霞)

CRISPR/Cas9 genome editing technique and its application in site-directed genome modification of animals

Jinwei Zhou1, Qipin Xu1, Jing Yao2, Shumin Yu1, Suizhong Cao1
1. College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2. State Key Laboratory of Reproductive Biology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

CRISPR/Cas system, which uses CRISPR RNAs (crRNAs) to guide Cas nuclease to silence invading nucleic acids, is self-defense system against exogenous virus or plasmid in bacteria and archaea. Through molecular modification, the typeⅡCRISPR/Cas system has become a highly efficient site-directed genome editing technique, which is simpler than zinc-finger nucleases (ZFNs) and transcription activator like effector nucleases (TALENs) and easier to be designed and applied. In this review, we summarize the evolutionary history of CRISPR/Cas9 system, the working principle and modification process of type Ⅱ CRISPR/Cas and its application in animal genome modification. We also analyze the existing problems and improvement program of the CRISPR/Cas9 system as well as its application prospect combined with successful cases, which may provide innovative perspectives on improving animal traits and establishing animal models of human diseases.

2015-02-03;

2015-04-22

國家自然科學基金項目(編號：31272400，31172379)和四川農(nóng)業(yè)大學學科建設雙支計劃項目(編號：3570806)資助

周金偉，碩士，專業(yè)方向：大動物遺傳與修飾。E-mail: zhoujinwei08@126.com

曹隨忠，教授，研究方向：獸醫(yī)產(chǎn)科學。E-mail: suizhongcao@126.com

10.16288/j.yczz.15-066

時間:2015-6-17 15:14:43

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150617.1514.001.html