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中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，植物細(xì)胞與染色體工程國家重點實驗室，北京 100101

特別推薦

植物基因組編輯及衍生技術(shù)最新研究進(jìn)展

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中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，植物細(xì)胞與染色體工程國家重點實驗室，北京 100101

高彩霞課題組主要從事重要農(nóng)作物基因組定向編輯技術(shù)方法的研究與應(yīng)用、農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的建立與應(yīng)用，以及小麥、玉米、水稻等重要基因的功能解析及基因組編輯定向設(shè)計分子育種研究。他們率先利用CRISPR/Cas系統(tǒng)實現(xiàn)水稻和小麥的基因組編輯，并利用該技術(shù)首創(chuàng)抗白粉病小麥新材料和改良水稻的香味品質(zhì)，近期他們將該CRISPR切割系統(tǒng)引入植物，在植物中建立了DNA病毒防御體系。相關(guān)成果以通訊作者身份發(fā)表在Nature Biotechnology、Nature Plants、Nature Protocols、PLoS Biology、Molecular Plant、Plant Biotechnology Journal和Journal of Genomics and Genetics等期刊上。

基因組編輯技術(shù)已經(jīng)在多個模式植物、動物以及其他生物中得到成功應(yīng)用?；蚪M編輯是利用序列特異核酸酶(Sequence-specific nucleases, SSNs)在基因組特定位點產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks, DSBs)，從而激活細(xì)胞自身修復(fù)機制——非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源重組(Homologous recombination, HR)，實現(xiàn)基因敲除、染色體重組以及基因定點插入或替換等。鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)、TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9)系統(tǒng)是最主要的3類SSNs。ZFN和TALEN是利用蛋白與DNA結(jié)合方式靶向特定的基因組位點，而最新的CIRISPR/Cas9系統(tǒng)則是利用更簡單的核苷酸互補配對方式結(jié)合在基因組靶位點，其構(gòu)建簡單、效率更高效，因而促進(jìn)了基因組編輯在植物中的廣泛應(yīng)用。利用基因組編輯技術(shù)除了實現(xiàn)植物基因定點突變外，還可以將SSNs的DNA結(jié)合域與其他功能蛋白融合，實現(xiàn)基因的靶向激活、抑制和表觀調(diào)控等衍生技術(shù)。本文從基因組編輯技術(shù)的原理與優(yōu)勢、SSNs組成及構(gòu)建方法、基因組編輯及衍生技術(shù)在植物中應(yīng)用、優(yōu)化SSNs突變效率和減少脫靶突變方法等方面進(jìn)行了系統(tǒng)介紹，并對未來需要迫切解決的一些問題進(jìn)行了分析和展望。

基因組編輯；ZFN；TALEN；CRISPR/Cas9；同源重組；脫靶突變

隨著生命科學(xué)研究進(jìn)入基因組時代，越來越多物種的基因組完成測序，解讀與改造基因組的功能就顯得非常緊迫。以基因組編輯(Genome editing)為基礎(chǔ)的反向遺傳學(xué)技術(shù)是基因組改造與基因功能研究必不可少的手段之一[1]。基因組編輯技術(shù)是一項可以與分子克隆、PCR等技術(shù)相媲美的技術(shù)突破，雖然出現(xiàn)僅僅10余年，但已顯著地促進(jìn)了生物學(xué)研究的迅猛發(fā)展，應(yīng)用前景廣闊。以序列特異核酸酶(Sequence-specific nucleases, SSNs)為工具的基因組編輯技術(shù)已在全世界掀起了研究熱潮。2012年Science將其列入年度10大科學(xué)進(jìn)展，以TALEN為代表的SSNs被譽為“基因組巡航導(dǎo)彈”。2013年Science再次將SSNs技術(shù)的新星CRISPR/Cas9列入年度十大科學(xué)進(jìn)展。2014年Nature Methods將基因組編輯技術(shù)評為過去 10年間對生物學(xué)研究最有影響力的10項研究方法之一。

1 基因組編輯技術(shù)的原理及優(yōu)勢

1.1 基因組編輯技術(shù)的原理及DNA斷裂修復(fù)機制

近幾年，生物學(xué)家們巧妙地利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能領(lǐng)域的研究成果，將特異識別與結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域融合，創(chuàng)造出能夠按照人們意愿特異切割DNA的SSNs，并藉此實現(xiàn)了對基因組特定位點的靶向修飾，即基因組編輯。SSNs主要包括3種類型：鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9, CRISPR/Cas9 system)(圖1，A～C)。它們的共同特征是能夠作為核酸內(nèi)切酶切割特定的DNA序列，創(chuàng)造DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks, DSBs)。在真核生物中，DSBs的修復(fù)機制是高度保守的，主要包括兩種途徑：非同源末端連接(Nonhomologous end joining, NHEJ)和同源重組(Homologous recombination, HR)。通過NHEJ方式，斷裂的染色體會重新連接，但往往是不精確的，斷裂位置會產(chǎn)生少量核苷酸的插入或刪除，從而產(chǎn)生基因敲除突變體；通過 HR方式，在引入同源序列的情況下，以同源序列為模板進(jìn)行合成修復(fù)，從而產(chǎn)生精確的定點替換或者插入突變體[2](圖2)。在這兩種途徑中，NHEJ方式占絕對主導(dǎo)，可以發(fā)生在幾乎所有類型的細(xì)胞以及不同的細(xì)胞周期中(G1、S和G2期)；然而，HR發(fā)生頻率很低，主要發(fā)生在S和G2期[3]。

圖1 3種序列特異核酸酶(SSNs)模式圖

圖2 DNA雙鏈斷裂(DSBs)修復(fù)途徑

1.1.1 NHEJ途徑

根據(jù)具體修復(fù)方式和參與修復(fù)的蛋白因子，可以將NHEJ分為兩類：一類是Classical NHEJ (cNHEJ)；另一類是Alternative NHEJ (aNHEJ)[4]。這兩種機制在所有真核生物中是高度保守的。通過cNHEJ途徑，SSN誘導(dǎo)的DSBs末端首先被具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的Ku蛋白異源二聚體(Ku70、Ku80)結(jié)合以防止 DNA斷裂末端進(jìn)一步降解，最后在特定的DNA連接酶Ⅳ的作用下，將兩個開放的末端重新連接(圖3A)。在連接前可能經(jīng)過末端加工過程，因而產(chǎn)生幾個核苷酸的插入或刪除 (Indel)，但多數(shù)情況下不經(jīng)過加工過程而直接恢復(fù)為原始序列。從基因組編輯的角度看，經(jīng)過末端加工產(chǎn)生少量核苷酸插入或刪除是更有意義的。如果DSBs發(fā)生在編碼基因的ORF區(qū)，插入或刪除非 3整數(shù)倍的核苷酸，可能造成移碼突變使基因功能完全喪失。

如果cNHEJ途徑被抑制或DSBs兩側(cè)含有幾個或十幾個核苷酸的微同源序列，則可能通過aNHEJ途徑修復(fù)。研究表明，DSBs末端分別發(fā)生5′至3′方向的DNA切除，釋放出可局部互補配對的單鏈末端，微同源序列互補配對，再經(jīng)過末端處理和重新連接修復(fù) DSBs缺口。修復(fù)后微同源序列恰好位于DSBs的結(jié)合點。由于發(fā)生了核苷酸的刪除，造成遺傳信息丟失，因此在基因組編輯過程中aNHEJ修復(fù)方式很容易產(chǎn)生突變(圖 3B)。研究表明，這兩種NHEJ途徑在細(xì)胞中會相互競爭。與野生型相比，擬南芥ku80突變體Indel突變效率增加2.6倍，并且DSBs位置核苷酸降解長度也有所增加[5]。

圖 3 兩種非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)途徑方式(參考文獻(xiàn)[3]修改繪制)

1.1.2 HR途徑

根據(jù)發(fā)生方式的不同，HR可以分為兩類：單鏈退火(Single-strand annealing, SSA)和合成依賴式鏈退火(Synthesis-dependent strand annealing, SDSA)。DSBs產(chǎn)生后，在這兩種途徑下DNA斷裂末端都會發(fā)生5’至3’方向的DNA切除，形成3’單鏈末端。SSA途徑類似aNHEJ途徑，DSBs兩端各有一段同源序列，同源序列區(qū)域直接退火形成互補雙鏈，再經(jīng)過末端加工和連接修復(fù)DSBs(圖4A)。在基因組串聯(lián)重復(fù)區(qū)域，SSA是主要的DSBs修復(fù)方式[6]。

圖4 兩種同源重組(HR)修復(fù)途徑方式(參考文獻(xiàn)[3]修改繪制)

SDSA途徑是依賴DNA合成的修復(fù)過程，基因組編輯過程中同源重組通常是指這種方式。DSB經(jīng)過5’至3’方向的DNA切除產(chǎn)生的一個3’單鏈末端入侵同源供體DNA模板，形成D-loop環(huán)狀結(jié)構(gòu)，再利用同源DNA的互補鏈作為模板進(jìn)行DNA合成修復(fù)，當(dāng)延伸至可以與DSB另一個單鏈末端互補配對位置時，脫離 D-loop結(jié)構(gòu)，兩個單鏈DSB末端退火形成雙鏈，完成修復(fù)過程(圖 4B)。SDSA途徑最終結(jié)果就是完成從同源DNA至DSB遺傳信息的轉(zhuǎn)換過程。SDSA途徑發(fā)生頻率非常低，相同條件下只有SSA方式的10%～20%[7]。

1.2 基因組編輯技術(shù)優(yōu)勢

當(dāng)前遺傳改良或基因修飾途徑存在許多缺陷。例如：傳統(tǒng)雜交育種法周期長，需要多個世代，耗時費力，且受物種間生殖隔離限制和不良基因連鎖的影響；物理或化學(xué)誘變法雖然可以在基因組上隨機產(chǎn)生大量突變位點，但突變位點鑒定十分困難；傳統(tǒng)基因打靶方法效率極低(通常僅10-6～10-5)，并且只限于少數(shù)物種如酵母(Saccharomyces cerevisiae)、小鼠(Mus musculus)等；RNAi方法下調(diào)基因表達(dá)不夠徹底，其后代的基因沉默效果減弱甚至完全消失，不能穩(wěn)定遺傳。相比于上述方法，基因組編輯技術(shù)優(yōu)勢非常明顯：(1)所有SSNs都可以通過設(shè)計DNA結(jié)合蛋白(或?qū)?RNA)使其靶向編輯基因組的任意位點，精確性非常高；(2)原理簡單易懂，而且技術(shù)操作簡便、成本相對低廉，原則上適用于任意物種；(3)利用SSNs定點突變目的基因具有非常高的效率，通常從幾個或十幾個轉(zhuǎn)化株系中就能篩選到符合要求的基因突變材料，對于活性高的SSNs在T0代就可以得到純合突變體。目前，基因組編輯技術(shù)已成功應(yīng)用于酵母、線蟲(Caenorhabditis elegans)、果蠅(Drosophila melanogaster)、斑馬魚(Danio rerio)、小鼠、人類(Homo sapiens)細(xì)胞、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、煙草(Nicotiana tabacum)、大豆(Glycine max)、水稻(Oryza sativa)、小麥(Triticum aestivum)、大麥(Hordeum vulgare)和玉米(Zea mays)等多種模式生物及經(jīng)濟作物中[8]。

2 SSNs組成及構(gòu)建方法

2.1 ZFNs組成及構(gòu)建方法

ZFNs是通過基因工程方法將鋅指蛋白DNA結(jié)合域(ZFA)和核酸內(nèi)切酶FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域融合而成，DNA結(jié)合域通常由3～6個Cys2His2類型的鋅指單元串聯(lián)而成[9]。每個鋅指單元含有 1個 α螺旋和2個β折疊結(jié)構(gòu)，并且螯合1個鋅原子。1個鋅指單元能特異識別DNA單鏈上3個連續(xù)的核苷酸；由多個鋅指單元串聯(lián)形成的ZFA結(jié)構(gòu)域則可識別更長的靶序列，同時增加了DNA靶向修飾的特異性。當(dāng)兩個ZFN單體按照一定的距離和方向同各自的目標(biāo)位點特異結(jié)合，兩個 FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域恰好可形成二聚體的活性形式，在兩個結(jié)合位點的間隔區(qū)(Spacer，通常為5～7 bp)切割DNA (圖1A)。

理論上每個鋅指單元識別 3個核苷酸，1個包含 64個鋅指的文庫就可以識別所有的串聯(lián)三聯(lián)體核苷酸。在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)單個鋅指的識別特性在不同的串聯(lián)鋅指單元ZFA中差異非常大，是由于相鄰鋅指造成的上下文背景起了重要影響。當(dāng)前主要有 4種設(shè)計方案，包括：模塊組裝方案(Modular assembly MA)[10]、基于文庫篩選的OPEN方案[11]、Sangamo公司私有的雙鋅指模塊組裝方案(Two-finger modules)[12]和上下文依賴組裝方案(CoDA)[13]。MA方案雖然簡便，但完全不考慮上下文背景作用，其成功率最低。另外3種方案都考慮了上下文的背景影響。當(dāng)前有幾種程序可以輔助設(shè)計ZFN靶位點，具體見表1。

2.2 TALEN組成及構(gòu)建方法

類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物(Transcription activator-like effector, TALE)是黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)植物病原菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌到宿主細(xì)胞中的一種毒性蛋白，可以識別植物特定基因啟動子序列，啟動感病基因表達(dá)。TALE核酸酶(TALENs)就是利用TALE的DNA結(jié)合域和FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域合成的人工核酸酶[14](圖1B)。TALE的DNA結(jié)合域包含1個由數(shù)量不等的重復(fù)單元串聯(lián)組成的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)，這些重復(fù)單元通常由33～35個高度保守的氨基酸組成，第12和13位氨基酸可變，被稱為重復(fù)可變雙殘基(Repeat variable diresidue, RVD)。每個RVD與核苷酸A、T、C、G存在簡單對應(yīng)的關(guān)系，即NI識別A、HD識別C、NG識別T和NN識別G[15,16]。TALE蛋白以這種“一個重復(fù)單位一個核苷酸”的對應(yīng)方式特異識別并結(jié)合DNA。2012年，TALE蛋白晶體結(jié)構(gòu)被解析出來，結(jié)構(gòu)顯示 TALE的重復(fù)單元組成Helix-loop-helix的結(jié)構(gòu)圍繞DNA雙螺旋主溝呈右手螺旋狀排列，結(jié)構(gòu)還顯示RVD的兩個殘基中第一位氨基酸穩(wěn)定RVD loop作用，第二位氨基酸與堿基特異識別相關(guān)[17,18]，這些信息為改造 TALE蛋白提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

表1 SSNs資源及在線程序

由于TALE蛋白DNA結(jié)合域的高度串聯(lián)重復(fù)特性，使TALE表達(dá)載體的合成和搭建具有一定困難。科研人員開發(fā)了多種方法，包括簡單直接的模塊組裝法[19]、Golden Gate組裝方法[20]、高通量合成TALE的固相組裝[21]和不依賴連接的克隆方法[22]等。Golden Gate組裝方法利用IIS型限制性內(nèi)切酶切割位點位于識別序列外部的特性，各個TALE重復(fù)單元質(zhì)粒經(jīng)酶切后產(chǎn)生不同的 4nt粘性末端，具有兼容粘性末端的 DNA片段可按照正確順序連接成完整的多RVD模塊。表1匯總了當(dāng)前各種TALEN輔助設(shè)計程序。

2.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)組成及構(gòu)建方法

CRISPR/Cas系統(tǒng)是在細(xì)菌的天然免疫系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，廣泛存在于細(xì)菌及古生菌中，主要功能是抵抗入侵的病毒及外源 DNA。CRISPR/Cas系統(tǒng)由CRISPR序列與Cas基因家族組成，其中CRISPR由一系列高度保守的重復(fù)序列(Repeat)與間隔序列(Spacer)相間排列組成。在CRISPR序列附近存在高度保守的 CRISPR相關(guān)基因(CRISPR-associated gene, Cas gene)，這些基因編碼的蛋白具有核酸酶功能，可以對DNA序列進(jìn)行特異性切割[23,24]。

根據(jù)Cas基因核心元件序列的不同，CRISPR/Cas可以分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型系統(tǒng)[23]。這3類系統(tǒng)又可以根據(jù)其編碼Cas蛋白而分為更多的亞類。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)需要多個Cas蛋白形成的復(fù)合體切割DNA雙鏈，而Ⅱ型只需要1個Cas9蛋白。Cas9蛋白包含氨基端的RuvC-like結(jié)構(gòu)域及位于蛋白中間位置的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域，HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域切割與單導(dǎo)向RNA (Single guide RNA, sgRNA)互補配對的模板鏈，RuvC-like結(jié)構(gòu)域?qū)α?條鏈進(jìn)行切割。切割位點位于原型間隔序列毗鄰基序(Protospacer adjacent motif, PAM)上游3nt處。自2012年起，人們優(yōu)化了Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)，利用Cas9蛋白和sgRNA構(gòu)成簡單的sgRNA/ Cas9系統(tǒng)[25, 26]，使其能夠在真核生物中發(fā)揮類似 ZFN 和TALEN那樣靶向切割DNA的作用(圖1C)。Cas9蛋白與sgRNA結(jié)合形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，共同完成識別并切割DNA靶序列的功能。其中，Cas9蛋白作為核酸酶切割雙鏈DNA，而sgRNA則通過堿基互補配對決定靶序列的特異性。

2014年，鏈球菌(Streptococcus pyogenes)和放線菌(Actinomyces naeslundii) Cas9蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)被解析出來[27,28]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cas9家族的成員具有相同的核心結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)可以裂開兩瓣形成鉗狀，一瓣負(fù)責(zé)目標(biāo)識別，另一瓣具有核酸酶活性能切斷DNA。兩瓣中間有1個帶正電的溝槽，可以容納sgRNA:DNA異源雙鏈分子。目標(biāo)識別瓣對于結(jié)合sgRNA和DNA是必須的，而核酸酶瓣包含HNH 和 RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域，它們所處位置恰好可以分別切開一條DNA鏈。Cas9蛋白單獨存在時處于非活性狀態(tài)，但與sgRNA結(jié)合后，它的三維結(jié)構(gòu)會經(jīng)歷劇烈的改變，允許Cas9與目標(biāo)DNA結(jié)合。這一結(jié)構(gòu)可以幫助改良Cas9核酸酶，設(shè)計不影響其功能的小Cas9變體，使其更適合基礎(chǔ)研究和基因工程。目前已積累了大量的CRISPR靶位點設(shè)計網(wǎng)絡(luò)程序，詳見表1。

2.4 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)的比較及選擇

3種SSNs技術(shù)相比較，在效率、特異性及設(shè)計上各有不同。由于鋅指單元同其靶序列的對應(yīng)性并不特異，ZFN表現(xiàn)出較明顯的脫靶效應(yīng)(Off-target effect)，并且獲得有效的 ZFN相當(dāng)困難，這兩點嚴(yán)重妨礙了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。TALEN和 CRISPR/ Cas9系統(tǒng)相互補充，各具優(yōu)點：TALEN優(yōu)勢是特異性高，脫靶效應(yīng)較低，但TALEN蛋白較大，并且序列重復(fù)性強，表達(dá)載體構(gòu)建較為繁瑣；CRISPR/Cas9系統(tǒng)在設(shè)計和構(gòu)建上更為簡單，突變不同的靶位點時僅需重新設(shè)計、合成與靶序列互補的sgRNA，而不需要更換Cas9核酸酶，為CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用提供了極大便利。由于sgRNA與靶位點通過核苷酸配對相互識別，個別核苷酸位點改變并不會對該系統(tǒng)的突變活性造成顯著影響，因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性較TALEN稍差。目前ZFN基本上被TALEN和CRISPR/Cas9替代。TALEN的優(yōu)勢是特異性高，脫靶效應(yīng)較低；而CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢則是使用簡便、成本低(表2)。

在動物或人類的基因治療等應(yīng)用中，SSNs脫靶效應(yīng)可能造成致命后果。然而在植物中脫靶效應(yīng)不是主要制約因素，可以通過全基因組測序檢測是否存在脫靶，或者通過與親本多次回交的方法去除脫靶突變。另據(jù)報道，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中沒有嚴(yán)重的脫靶突變[29,30]，而且目前已有多種方法可以在一定程度上減少 CRISPR脫靶，提高靶向特異性。因此，從簡便、效率和多基因編輯角度考慮，3 種SSNs中首選CRISPR/Cas9，TALEN次之。在基因組編輯以外的其他領(lǐng)域，TALE效應(yīng)因子相對更容易與其他功能結(jié)構(gòu)域融合，行使靶向激活、抑制和表觀修飾等功能；將無核酸酶活性的 dCas9(dead Cas9)與功能蛋白融合，也能賦予CRISPR系統(tǒng)多種功能，但sgRNA由RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄，目前沒有可精確調(diào)控的sgRNA啟動子，因此，從可擴展性及精細(xì)調(diào)控方面TALE略勝一籌[31]。

3 基因組編輯技術(shù)在植物生物學(xué)及分子育種研究中的應(yīng)用

3.1 基因敲除

基因敲除是基因組編輯最簡單的應(yīng)用形式，只需要SSNs在靶位點制造1個DSB斷裂。利用SSNs基因敲除的植物種類括擬南芥、煙草、矮牽牛(Petunia hybrida)、水稻、大豆、玉米和小麥等(表3)。

表2 ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9系統(tǒng)比較

表3 植物基因組編輯匯總

續(xù)表

Zhang等[32]用 OPEN(Oligomerized pool engineering)方法設(shè)計ZFN敲除擬南芥ADH1和TT4基因，并利用雌激素誘導(dǎo)啟動子表達(dá)，T1代分別有7% 和 16%的植物含有體細(xì)胞突變，突變能夠穩(wěn)定傳遞到后代，并獲得20%純合突變植物。純合adh1突變體具有預(yù)期丙烯醇抗性，而tt4突變體種皮因缺失花青素而呈現(xiàn)黃色。

Li等[33]利用 TALEN方法突變水稻蔗糖外排轉(zhuǎn)運基因OsSWEET14啟動子區(qū)域，破壞細(xì)菌性病原菌分泌的效應(yīng)蛋白在基因組上的結(jié)合位點，從而提高水稻白葉枯病抗性。Shan等[34]對水稻甜菜堿乙醛脫氫酶基因(OsBADH2)的編碼區(qū)設(shè)計 TALEN，badh2純和突變體稻米2AP含量顯著增加，提高了稻米的香味品質(zhì)。Haun等[35]利用TALEN方法同時敲除大豆脂肪脫氫酶 2基因家族兩個成員 FAD2-1A和FAD2-1B，純合突變體(aabb)油酸含量從20%提高到80%，并同時降低對人體健康有害的亞油酸含量(從 50%到 4%)，因此改善了大豆油的品質(zhì)。Wang 等[36,37]利用TALEN方法同時敲除MLO基因在小麥A、B和D基因組上的3個拷貝，獲得對白粉病具有廣譜和持久抗性的純合小麥突變體tamlo-aabbdd。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有簡捷和高效特性，目前已在多個植物中得到應(yīng)用，如擬南芥、煙草、水稻、玉米、高粱、小麥、甜橙(Citrus sinensis)和番茄(Solanum lycopersicum)等(表3)。在擬南芥和煙草原生質(zhì)體中，NHEJ突變效率分別達(dá)到5.6%和38.5%[38]。此外，利用農(nóng)桿菌侵染方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)化擬南芥，T1植物中有 26%～84%突變效率[39]。Shan等[40]利用水稻偏愛密碼子優(yōu)化Cas9核酸酶基因，并采用水稻小核RNA的U3啟動子和小麥U6啟動子轉(zhuǎn)錄sgRNA，定點敲除水稻PDS和小麥MLO等基因，在T0代就獲得純合基因敲除水稻突變體，突變效率達(dá)到10%。Xie等[41]在水稻原生質(zhì)體中檢測到3.5%～10.6%突變效率，植物中突變效率為 3%～8%。Miao等[42]分別敲除水稻葉綠素A加氧酶基因CAO1和控制分蘗夾角的LAZY1基因，T1代純合cao1和lazy1突變體分別呈現(xiàn)葉片葉綠素含量降低和分蘗夾角增大表型。

3.2 基因插入和定點替換

一般情況下，基因插入或定點替換都可以通過HR方式實現(xiàn)，轉(zhuǎn)化SSNs同時引入一個供體DNA載體或片段，供體DNA包含了待插入或替換的基因或核苷酸序列并在其兩側(cè)分別含有足夠長的同源DNA(同源臂)?；蚨c插入所用的供體DNA通常為雙鏈環(huán)狀載體或雙鏈線性DNA；此外還可以使用單鏈寡核苷酸DNA(ssDNA)，ssDNA的設(shè)計和合成比構(gòu)建雙鏈 DNA載體更簡單方便[43]。由于 NHEJ效率相比HR效率高很多，因此，利用NHEJ途徑定點插入基因或Tag標(biāo)簽成為一種替代方法[44]。植物中基因插入和定點替換的成功例子見表3。

Voytas實驗室最早嘗試用 HR方式精確編輯植物基因組，他們首先在煙草中整合了功能缺失的gus:nptII篩選基因，該基因上含有ZFN(Zif268)識別序列。再把ZFN和供體DNA轉(zhuǎn)入含有g(shù)us:nptII基因的煙草原生質(zhì)體中，從卡那霉素抗性克隆中篩選到有10%發(fā)生同源重組[45]。Townsend等[46]利用ZFN技術(shù)，通過 HR途徑分別定點替換煙草乙酰乳酸合成酶基因(SuRA、SuRB)的3個關(guān)鍵核苷酸位點，得到抗除草劑煙草，基因打靶效率在0.2%～4%之間。Shukla等[47]在玉米中用ZFN定點突變肌醇六磷酸生物合成最后一步的關(guān)鍵酶基因IPK1，同時插入抗除草劑基因 PAT，玉米的肌醇六磷酸含量減少，營養(yǎng)品質(zhì)得到改良，且減少了對環(huán)境的有機磷污染，基因打靶效率在大部分實驗中高達(dá)10%以上。

Zhang等[48]在煙草原生質(zhì)體中轉(zhuǎn)化TALEN和供體DNA，有30%細(xì)胞發(fā)生ALS基因突變，另外高達(dá)14%煙草原生質(zhì)體細(xì)胞ALS基因位點整合了YFP報告基因；另一組不加篩選劑實驗中，煙草ALS基因關(guān)鍵核苷酸替換效率達(dá)到4%。Wang等[36]在小麥原生質(zhì)體細(xì)胞MLO基因位點通過NHEJ途徑整合不含啟動子的 GFP報告基因，流式細(xì)胞儀檢測到 6.5%細(xì)胞有GFP表達(dá)，測序結(jié)果證明GFP按照正確讀碼框整合在MLO位點。在另一項研究中，科研人員將 His-tag和 Myc-tag按照 NHEJ方式整合在小麥MLO位點，效率達(dá)到1.4%和2.6%，并且按照孟德爾分離分離比例傳遞到T1代。

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，Shan等[38]和Li等[40]分別在水稻和煙草的原生質(zhì)體PDS基因上通過HR途徑插入1個或多個限制性內(nèi)切酶位點，并利用酶切和測序方法驗證了 HR效率。Fauser等[49]在擬南芥中利用DGU.US和IU.GUS兩個GUS報告基因系統(tǒng)，證明Cas9核酸酶和Cas9切口酶都能有效誘導(dǎo)HR，且Cas9切口酶效率更高。

3.3 染色體重組及多基因敲除

多個 SSNs同時導(dǎo)入細(xì)胞可以實現(xiàn)染色體片段刪除、倒位、易位等染色體重組突變和多基因同步敲除突變。染色體重組和多基因敲除是反向遺傳學(xué)和現(xiàn)代生物技術(shù)的重要工具，基因大片段刪除技術(shù)對于研究非編碼RNA、基因調(diào)控序列和冗余基因功能具有重要作用；利用多基因敲除技術(shù)研究復(fù)雜性狀或數(shù)量性狀，能夠在較短時間獲得多基因同步敲除突變體，加快研究進(jìn)程。Qi等[50]利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法同時轉(zhuǎn)化兩對ZFNs，在擬南芥中同時刪除了含有8個抗病基因長度為55 kb的RPP4基因簇，體細(xì)胞中突變效率在 1%左右；在另一組實驗中，Qi等獲得了長約為9 Mb染色體片段刪除，同時檢測到染色體倒位和片段重復(fù)的現(xiàn)象。借助于 TALEN技術(shù)，Christian等[51]和 Shan等[52]分別在擬南芥和水稻中實現(xiàn)4.4 kb和1.3 kb基因片段刪除。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于構(gòu)建簡單，因此在染色體重組和多基因編輯領(lǐng)域更有優(yōu)勢，Zhou等[53]利用CRISPR系統(tǒng)在水稻中實現(xiàn)了115～245 kb大片段刪除，其中包含了2～3個不同的基因簇，進(jìn)一步表明SSN在染色體大片段刪除中的有效性。

多基因同步敲除技術(shù)在植物中也有報道，Shan 等[34]通過基因槍法同時導(dǎo)入3對TALENs，分別靶向控制水稻產(chǎn)量和品質(zhì)性狀基因 DEP1、CKX2和BADH2，在T0代獲得一系列單基因、兩基因及三基因共同敲除株系，其中三基因突變效率達(dá)到1.9%(4/207)。Xing等[54]構(gòu)建了一套適合進(jìn)行植物多基因編輯的CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)，在擬南芥的T1代植物中實現(xiàn)三基因同步敲除。最近，Xie等[55]利用內(nèi)源的轉(zhuǎn)運RNA(Transfer RNA，tRNA)加工系統(tǒng)提高了CRISPR/Cas9進(jìn)行多基因編輯的能力，他們將多個tRNA-sgRNA結(jié)構(gòu)串聯(lián)排列，從構(gòu)建的一個多順反子 tRNA-sgRNA基因(PTG)可以轉(zhuǎn)錄并加工成多個sgRNA。利用這一策略在水稻中實現(xiàn)多達(dá)8個位點同時突變，并且個別位點效率高達(dá)100%。而且由于 tRNA及其加工系統(tǒng)在所有生物中都是非常保守的，這一策略有望在其他物種的多基因編輯中廣泛應(yīng)用。

3.4 SSNs與其他生物技術(shù)相結(jié)合的創(chuàng)新研究成果

SSNs技術(shù)與其他先進(jìn)生物技術(shù)相結(jié)合，已經(jīng)產(chǎn)生了很多意想不到的巨大突破。例如，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的簡便和低成本使全基因組水平的定向編輯(Genome-wide editing)變?yōu)楝F(xiàn)實，通過構(gòu)建靶向幾千個甚至上萬個基因的大規(guī)模sgRNA文庫，再結(jié)合功能性篩選平臺和深度測序技術(shù)，以高通量方式研究疾病相關(guān)的基因，這一技術(shù)還有望研究更廣泛的生物學(xué)問題[56～58]。華盛頓大學(xué)的研究團隊將 CRISPR/ Cas9系統(tǒng)與飽和基因組編輯和深度測序技術(shù)相結(jié)合，檢測大量單個核苷酸位點突變帶來的功能性影響，這一研究可能推動對一些順式調(diào)控元件和反式作用因子進(jìn)行高分辨率的功能解析，并大大提高人們解讀未知基因變異的能力[59]。華人科學(xué)家簡悅威院士將CRISPR/Cas9與piggyBac轉(zhuǎn)座子結(jié)合，修改引起β-地中海貧血病的 HBB基因，在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)中實現(xiàn)無痕基因校正[60]。另外，SSNs及其他衍生的轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組靶向修飾工具在合成生物學(xué)領(lǐng)域也已發(fā)揮重要作用[61,62]。

4 SSNs的相關(guān)衍生技術(shù)及應(yīng)用

除基因組編輯技術(shù)以外，DNA結(jié)合蛋白ZFA或TALE可以與多種功能蛋白融合而行使其他靶向修飾作用；同理，無DNA切割活性的dCas9 (dead Cas9)也可以與其他功能蛋白融合，借助sgRNA靶向特定位置進(jìn)行基因修飾。目前，已報道與 ZFA、TALE 或dCas9融合的功能蛋白包括VP64、KRAB和TET1等，它們負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄抑制、表觀調(diào)控和靶向RNA編輯等。這些SSNs相關(guān)衍生技術(shù)為生物學(xué)研究提供了更多的遺傳學(xué)工具(圖5)。

圖5 SSN衍生應(yīng)用技術(shù)

4.1 靶向基因激活

Sanchez等[63]將編碼3個串聯(lián)的鋅指蛋白Zif268與孢疹病毒的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 VP16或 VP64(即4×VP16)基因融合，產(chǎn)生融合蛋白 ZF-VP16或ZF-VP64。擬南芥瞬時表達(dá)實驗和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化實驗中，融合蛋白都可以激活報告基因LUC和GFP的轉(zhuǎn)錄。Morbitzer等[64]利用 AvrBS3的 TALE骨架并將其RVD替換，靶向番茄BS4、擬南芥EGL3和擬南芥KNAT1啟動子上特定位點，所有dTALE都能特異性地激活 3個基因。Liu等[65]在煙草實驗中利用農(nóng)桿菌注射方法瞬時表達(dá)TALE-VP64或TALE-VP16融合蛋白，靶向35S啟動子的TATA-Box旁側(cè)序列，可以顯著增強橙色熒光蛋白報告基因(pporRFP)的表達(dá)。實驗結(jié)果還表明，靶向激活作用具有累加效應(yīng)，即多個不同的TALE融合蛋白共同使用比單個TALE融合蛋白的激活作用更強。此外，利用TALE融合蛋白激活轉(zhuǎn)基因煙草中的AtPAP1基因，煙草葉片注射后合成大量花青素因而呈現(xiàn)深紫色，進(jìn)一步證明人工合成 TALE融合蛋白可以用于植物內(nèi)源基因的靶向激活。Baazim[66]采用 CRISPR/dCas9系統(tǒng)在煙草中進(jìn)行定點激活實驗，通過在dCas9的C-末端融合激活結(jié)構(gòu)域EDLL或TAD (TAL effector激活結(jié)構(gòu)域)，農(nóng)桿菌注射煙草葉片后對煙草葉盤進(jìn)行染色或半定量PCR實驗，表明GUS基因或PDS基因可以被激活。上述靶向激活實驗的效率通常較低，為進(jìn)一步提高效率，Tanenbaum等[67]開發(fā)了一種名為“SunTag”的蛋白標(biāo)簽信號放大系統(tǒng)，可以高效率定向激活靶標(biāo)基因。這一系統(tǒng)通過在 dCas9末端融合能與單鏈抗體 scFv特異性結(jié)合的串聯(lián)多肽鏈GCN4，從而將多個VP64激活結(jié)構(gòu)域募集至靶標(biāo)基因啟動子區(qū)域，對人類細(xì)胞中低表達(dá)豐度基因CXCR4，轉(zhuǎn)錄效果增強10～50倍；對高表達(dá)基因的激活效果也能達(dá)到3倍以上。另外，Konermann等[68]

重新設(shè)計CRISPR-Cas9激活復(fù)合體，采用sgRNA2.0、NLS-dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1蛋白復(fù)合體這個優(yōu)化組合能大幅度提高轉(zhuǎn)錄激活效率，在人類細(xì)胞中實現(xiàn)同時激活十個內(nèi)源基因，并能夠上調(diào)長基因間非編碼RNA(lincRNA)的轉(zhuǎn)錄水平；此外，還構(gòu)建靶向人類全基因組水平的70 290個sgRNA文庫，進(jìn)行大規(guī)模 Gain-of-function(GOF)遺傳篩選抗BRAF蛋白抑制劑的細(xì)胞克隆。

4.2 靶向基因抑制

Mahfouz等[69]利用 dHAX3的 TALE骨架與SRDX轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域構(gòu)建嵌合蛋白 dHax3.SRDX轉(zhuǎn)化擬南芥，該融合蛋白能夠靶向RD29A啟動子區(qū)域，報告基因 RD29A::LUC和擬南芥內(nèi)源基因RD29A的轉(zhuǎn)錄都受到明顯抑制。Baazim[66]在dCas9蛋白的 3′-末端融合 SRDX轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建dCas9-SRDX融合蛋白，在sgRNA引導(dǎo)下，半定量PCR實驗表明可以靶向性抑制煙草PDS基因。在人類細(xì)胞及動物研究領(lǐng)域，Zhang等[70]構(gòu)建了一套基于TALE-KRAB的轉(zhuǎn)錄抑制載體系統(tǒng)，并利用不同的熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)記，可以同時抑制小鼠的多個內(nèi)源基因，例如同時轉(zhuǎn)入靶向兩個基因 c.Kit和 PU.1 的3個TALE-KRAB載體，結(jié)合FACS熒光分選方法和qPCR鑒定，表明小鼠MEFs細(xì)胞兩個基因的表達(dá)水平分別降低 50%和 80%。Gilbert等[71]利用CRISPR系統(tǒng)首先在人類細(xì)胞和酵母中實現(xiàn)靶基因表達(dá)的精確調(diào)控，通過將無切割活性的 dCas9與轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域KRAB融合，可以顯著沉默多個內(nèi)源基因的表達(dá)。RNA測序表明CRISPRi介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制具有很高的靶向特異性。最近，加州大學(xué)的科研人員設(shè)計了一種CRISPR的引導(dǎo)RNA，在上面加入了效應(yīng)蛋白的招募位點，即支架RNA(scRNA)系統(tǒng)。scRNA同時定義了靶位點和調(diào)控功能，能同時對不同的基因進(jìn)行激活或抑制。這種支架RNA可以用來設(shè)計多基因轉(zhuǎn)錄程序，在激活一些基因的同時抑制另一些基因。利用這種方法，成功在酵母中重新編程了一個復(fù)雜的代謝通路。研究還顯示，scRNA在哺乳動物和酵母中均能有效發(fā)揮調(diào)控功能[72]。

4.3 靶向表觀修飾

對表觀基因組的定向修飾是另外一個重要研究方向。基因組的表觀修飾包括DNA和組蛋白的甲基化、去甲基化、乙?；腿ヒ阴；?，在基因的表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。目前在植物領(lǐng)域還沒有靶向表觀修飾研究的報道，只有少數(shù)幾篇文章是在人類細(xì)胞、哺乳動物和細(xì)菌中的研究。Meister等[73]將天然存在的異源二聚體甲基轉(zhuǎn)移酶 M.EcoHK31I的兩個亞基分別與識別9 bp長的鋅指蛋白融合，構(gòu)建鋅指甲基轉(zhuǎn)移酶，可以特異性地對大腸桿菌靶位點進(jìn)行DNA甲基化修飾，而不會造成非靶位點的甲基化。最近有兩個實驗室報道利用 TALE融合蛋白修改哺乳動物內(nèi)源基因的表觀狀態(tài)。Mendenhall等[74]利用TALE與組蛋白去甲基化酶LSD1融合構(gòu)建的TALE-LSD1蛋白研究增強子上的組蛋白印記對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用，表明融合蛋白可以有效地去除靶向增強子位點的染色質(zhì)修飾，而不會影響對照區(qū)域；他們還發(fā)現(xiàn)通過融合蛋白失活增強子往往導(dǎo)致下調(diào)臨近基因的表達(dá)，從而確定了增強子的靶向基因。Konermann等[75]將TALE與光誘導(dǎo)系統(tǒng)結(jié)合構(gòu)建了LITE系統(tǒng)，在串聯(lián)mSin3結(jié)構(gòu)域(SID4X)的作用下，靶標(biāo)基因Grm2的轉(zhuǎn)錄水平下降，同時Grm2基因啟動子區(qū)域 H3K9乙?；浇档蛢杀?，表明轉(zhuǎn)錄作用被抑制。此外，Maeder等[76]開發(fā)了一種可在人類細(xì)胞中有效定點去甲基化的方法，通過采用TALE-TET1羥化酶催化結(jié)構(gòu)域融合蛋白，可以改變啟動子上關(guān)鍵CpG區(qū)域的甲基化狀態(tài)，進(jìn)而顯著增加人類內(nèi)源基因的表達(dá)水平。

4.4 靶向RNA編輯

RNAi是真核生物中一個最重要的RNA水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。此前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被認(rèn)為只能切割雙鏈DNA，不能靶向RNA，然而最近研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)也可以用來對RNA進(jìn)行靶向編輯。O’Connell等[77]研究表明，當(dāng)提供合適的含PAM序列的寡核苷酸(PAMer)DNA時，Cas9核酸酶可以特異性地結(jié)合并切斷與sgRNA互補配對的單鏈RNA (ssRNA)，PAMer DNA的作用類似于PAM序列，它能夠激活Cas9核酸酶活性從而切斷DNA或RNA，研究還表明這一技術(shù)可以用來從細(xì)胞中分離特定的內(nèi)源mRNA轉(zhuǎn)錄本。最近研究發(fā)現(xiàn)，有些古菌的Ⅲ型CRISPR系統(tǒng)能夠切割RNA。例如，Zebec 等[78]發(fā)現(xiàn)嗜熱古菌 Sulfolobus solfataricus能利用CRISPR系統(tǒng)特異性降解入侵病毒的mRNA，qPCR實驗表明超過40%的mRNA可以被降解，利用純化的 CMR復(fù)合體在體外實驗中證實了切割相同的mRNA底物。另外，通過重新設(shè)計crRNA證明這一系統(tǒng)可以靶向其他基因，靶標(biāo)基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低50%左右。此外，Tamulaitis等[79]和Staals 等[80]發(fā)現(xiàn) Streptococcus thermophilus和 Thermus thermophilus中的Ⅲ-A型 CRISPR系統(tǒng)也能特異性降解RNA。

植物中廣泛存在一類稱為PPR的蛋白家族，包括許多序列特異性RNA結(jié)合蛋白，它們參與了細(xì)胞器中RNA代謝的許多方面，包括RNA穩(wěn)定性、加工、編輯和翻譯等過程。PPR蛋白由2～30個串聯(lián)的PPR重復(fù)單元組成，每個重復(fù)單元包含35個氨基酸，它可以特異性地識別一個核糖核苷酸，2～3個特定的氨基酸決定了識別特異性，這與TALE蛋白識別DNA方式非常類似。因此，PPR有可能經(jīng)過人工設(shè)計并作為特異性的RNA結(jié)合蛋白用于靶向RNA編輯。Yagi等[81]在其綜述中系統(tǒng)介紹了PPR蛋白的研究進(jìn)展情況。

5 優(yōu)化SSNs突變效率及減少脫靶效應(yīng)的方法

5.1 提高SSNs切割效率及突變活性的方法

SSNs突變活性的高低決定了能否獲得預(yù)期的定點修飾個體及獲得突變的頻率。目前有以下幾種提高SSNs活性的方法：

第一、在細(xì)胞或生物體內(nèi)高水平表達(dá)SSNs可以提高突變效率，但同時也可能會提高脫靶突變。例如，Ramakrishna等[82]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)人類細(xì)胞時加入蛋白酶抑制劑可抑制 ZFNs蛋白降解，進(jìn)而顯著增加ZFNs誘導(dǎo)的突變效率；在 30℃培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞比 37℃下 SSNs的表達(dá)水平更高，可以提高 ZFNs 和TALENs的突變效率[12]；采用合適的強啟動子表達(dá)SSNs也可以在一定程度上提高突變效率。

第二、通過同時表達(dá)核酸外切酶提高突變效率。Certo等[83]報道轉(zhuǎn)化SSNs同時共同轉(zhuǎn)化DNA斷裂末端加工核酸外切酶(Exo1、Trex2等)，可以避免DSBs通過cNHEJ途徑完好修復(fù)，因而提高aNHEJ途徑的突變效率。

第三、TALE蛋白骨架結(jié)構(gòu)對突變效率影響很大研究報道適當(dāng)截短TALE蛋白N端和C端可提高其在人類細(xì)胞、煙草和家畜中的活性。有實驗表明截短TALE蛋白N端和C端(特別是C端)可以提高蛋白的穩(wěn)定性，并且能幫助蛋白正確折疊[48,83]。而且，由于TALEN蛋白較大，截短后還有利于載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化。

第四、TALE蛋白對靶位點的表觀狀態(tài)比較敏感特別是 DNA的甲基化修飾(5mC)會明顯抑制TALEN的切割活性。研究表明采用兩種RVD(N*或NG; *為第13位缺失)代替HD識別5mC甲基化的DNA位點，可以提高TALE蛋白靶向識別能力[85,86]。另外，在設(shè)計TALEN靶向位點時可以盡量避開富含CG區(qū)域以減少DNA甲基化帶來的影響。

第五、對于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過優(yōu)化sgRNA設(shè)計可以提高該系統(tǒng)的成功率和突變效率。Doench 等[87]利用抗體著色和流式細(xì)胞儀分析方法系統(tǒng)比較了不同 sgRNAs在基因敲除實驗中的活性，發(fā)現(xiàn)一系列能增強 sgRNA活性的序列特征。具體而言，CGGT往往比典型的NGG序列更好。通過研究1841 個sgRNA中活性較高的sgRNA，他們得出了評分規(guī)則，并編寫了在線設(shè)計高活性sgRNA的程序sgRNA Designer(表1)。另外，Ren等[88]發(fā)現(xiàn)緊鄰PAM序列上游的6個核苷酸的GC含量與sgRNA誘導(dǎo)的突變效率有顯著的正相關(guān)性，即 GC含量越高，突變效率越高。

5.2 同源重組機制與提高定點插入或替換效率

提高 HR效率是基因組編輯研究最重要也是最迫切任務(wù)之一。在DSBs修復(fù)的兩種機制中，NHEJ是占絕對主導(dǎo)的，而 HR只發(fā)生在特定細(xì)胞類型和細(xì)胞周期中。

首先通過DSB修復(fù)機制的研究，使天平向HR方向傾斜。Ku和Lig4蛋白是NHEJ修復(fù)中必不可少的，在擬南芥中的實驗表明，ku70或lig4突變體背景下HR與NHEJ修復(fù)比例顯著提高[89]，但很多物種lig4突變體是致死的，因此開發(fā)一種專門針對Lig4蛋白的小分子抑制劑實現(xiàn)瞬時消減其活性，對于提高HR介導(dǎo)的基因定點插入或替換有重要價值[8]。SMC6參與姐妹染色單體間的同源重組過程，有趣的是，擬南芥smc6b背景下NHEJ和HR的效率分別提高了6～8倍和3～4倍，但具體機制需進(jìn)一步闡釋[89]。在人類細(xì)胞實驗中，利用只切開 DNA一條單鏈的ZFN、TALEN和Cas9切口酶(Nickase)，能提高 HR/NHEJ比例[26,90]。DNA單鏈缺刻不經(jīng)過NHEJ修復(fù)，在靶位點的indel突變減少，但可以提高HR效率。所有真核生物HR修復(fù)的起始步驟都是在Exo1等核酸外切酶作用下按照5′→3′方向降解DSB末端，3′單鏈寡核苷酸DNA末端能夠結(jié)合Rad51多聚體蛋白并搜尋同源序列。在水稻中，表達(dá)SSNs同時超表達(dá)OsExo1和(或)OsRecQI4核酸外切酶，能夠促進(jìn)HR和SSA效率[91]；在人類細(xì)胞和大鼠中，超表達(dá)Exo1或另一種核酸外切酶Trex2提高了NHEJ介導(dǎo)的基因敲除效率，但對HR是否有影響并未研究[83]。對DNA修復(fù)機制特別是HR修復(fù)過程的研究將有助于人們采用適當(dāng)方法提高基因組編輯中定點插入或替換的效率。在細(xì)胞周期的不同階段，DSB修復(fù)方式不同，研究表明HR主要發(fā)生在晚S期和G2期；而NHEJ可以發(fā)生在所有的細(xì)胞周期。因此，細(xì)胞周期在很大程度上影響了兩種DSB修復(fù)方式的選擇。Lin等[92]采用了一種化學(xué)誘導(dǎo)的方法首先將培養(yǎng)的人類細(xì)胞同步化至S期，在此時期將體外組裝的 Cas9-sgRNA核糖核蛋白復(fù)合體RNP轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，與非同步化細(xì)胞相比，HR效率提高38%左右。

其次，通過優(yōu)化供體DNA模板(數(shù)量、長度、類型、導(dǎo)入方式等)提高 HR效率是另一條途徑。Baltes等[93]利用雙生病毒(Geminivirus)載體表達(dá)SSNs和DNA模板，已在煙草中表明提高了HR效率。雙生病毒是造成很多植物病害的小分子(3 kb左右)單鏈DNA病毒，如菜豆黃矮病毒(BeYDV)、小麥矮縮病毒(WDV)等。改造的病毒載體保留了復(fù)制子(Replicon)元件，并用SSNs和DNA模板代替致病和病毒運動基因，病毒載體在植物細(xì)胞內(nèi)能夠大量復(fù)制，因此提高 SSNs和 DNA模板數(shù)量，與普通T-DNA載體相比，HR效率提高1～2個數(shù)量級。此外，Replicon復(fù)制起始蛋白的多效性作用進(jìn)一步提高了基因打靶效率。DNA模板同源臂的長度也影響HR效率，雙鏈DNA模板的同源臂長度一般為1～4 kb，即在DSB兩側(cè)等分成大約0.5～2 kb。Byrne等[94]在人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 iPSC中系統(tǒng)研究了基因打靶載體設(shè)計對 HR效率的影響，研究表明在無任何輔助篩選條件下，長度為2.7 kb的THY1基因的純合替換效率最高可以達(dá)到 11%。最優(yōu)化的基因打靶載體參數(shù)為大約2 kb同源臂長度，而且環(huán)狀的載體比線性化載體效率要高。然而，Shin等[95]利用TALEN技術(shù)在斑馬魚中進(jìn)行的 GFP報告基因定點插入實驗表明，較長的同源臂和線性化的供體DNA載體更有利于HR，同時還發(fā)現(xiàn)，在較短的一側(cè)同源臂的內(nèi)部切斷供體DNA載體獲得的HR效率最高，定點插入事件的傳代效率能達(dá)到 10%以上，具體機制尚不清楚。最近發(fā)現(xiàn)較短基因序列的精確修飾，可以采用單鏈寡核苷酸DNA作為模板，同源臂的長度甚至可以僅為 40nt，即兩側(cè)各有 20nt[43]。Puchta實驗室采用一種稱為植物體內(nèi)基因打靶的策略提高同源重組效率[96]，首先在植物基因組上穩(wěn)定整合SSNs及供體DNA模板，SSNs表達(dá)后同時切開基因組靶位點及供體DNA兩側(cè)的識別位點，釋放出線性供體DNA，發(fā)生HR修復(fù)。傳統(tǒng)基因打靶實驗中DNA模板由T-DNA載體提供，而植物體內(nèi)基因打靶在所有細(xì)胞及植物發(fā)育周期中都能發(fā)生，因此 HR發(fā)生頻率可能更高。

另外，NHEJ是DSB的主要修復(fù)方式，多個研究報道在人類細(xì)胞、斑馬魚、擬南芥、煙草和小麥中，利用沒有同源臂的雙鏈或單鏈DNA模板，成功實現(xiàn)基因替換或定點插入[36,44]，有些實驗同時利用抗生素篩選基因(HPT或 PURO)或熒光報告基因(GFP)的作用，進(jìn)一步提高靶向編輯效率。盡管NHEJ方式不能保證與 HR一樣的精確，基因片段可能被反向插入或者在 DSBs連接處產(chǎn)生核苷酸的插入或缺失，但NHEJ的效率要遠(yuǎn)高于HR，因此在精確性要求不高情況下，開啟了基因打靶的一種新方法。

5.3 減少脫靶效應(yīng)

脫靶(Off-target)是指SSNs在其靶位點以外的其他位置切割并產(chǎn)生突變，脫靶突變可能會造成非常嚴(yán)重后果。目前，減少或避免由SSNs引起的脫靶效應(yīng)的方法有以下幾種：

第一、最重要的是在設(shè)計靶位點時選擇特異性較好的位點，由于在全基因組上沒有和其相似性高的序列而可以最大限度減少脫靶。全外顯子組和全基因組測序分析表明靶向特異性位點的 ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9系統(tǒng)不會引起細(xì)胞中明顯的脫靶突變[97,98]。目前已有一些TALEN和CRISPR/ Cas9靶位點設(shè)計及脫靶位點預(yù)測工具，可以幫助使用者選擇高活性、高特異性的靶向位點，例如 The ZFN-Site, PROGNOS Tool和CasOT等(表1)。

第二、FokⅠ核酸酶需要形成二聚體才能切斷DNA，而使用ZFN和TALEN技術(shù)時可能會出現(xiàn)同型二聚體切割造成的脫靶，即兩個 ZFN-L，或兩個TALEN-R形成的二聚體。通過優(yōu)化FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域，使其只有形成異型二聚體，如ZFN-L/ZFN-R或TALEN-L/TALEN-R時，二聚化的FokⅠ才具有切割活性，從而可以避免同型二聚體導(dǎo)致的脫靶突變[99]。

第三、對于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，據(jù)報道可以使用截短的sgRNA(即17、18或19nt導(dǎo)向序列)，將脫靶效應(yīng)降低幾個數(shù)量級，且不影響靶位點處的突變效率[100]。sgRNA截短后可能使 RNA-DNA復(fù)合體對核苷酸錯配更加敏感，因而提高靶向特異性。但對于ZFNs或TALENs，適當(dāng)延長識別序列長度才能提高其靶向特異性[101]。此外，據(jù)報道TALE蛋白C末端特定位點的3個或7個氨基酸(精氨酸或賴氨酸)替換成谷氨酰胺可以將人類細(xì)胞中的脫靶效應(yīng)降低十倍左右，且不影響靶位點切割活性[101]。

第四、SSNs的脫靶效應(yīng)可以通過優(yōu)化核酸酶的表達(dá)水平來降低。高濃度的SSNs可以增加脫靶頻率例如，使用重組蛋白或體外轉(zhuǎn)錄的mRNA直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由于其可以在細(xì)胞內(nèi)快速降解，因此可以減少脫靶頻率[102,103]。另外，采用誘導(dǎo)型啟動子或在特定組織中表達(dá)的啟動子轉(zhuǎn)錄SSNs，這種時空特異性表達(dá)SSNs方式也能減少脫靶效應(yīng)。

第五、利用兩個sgRNA引導(dǎo)Cas9切口酶或Cas9-FokⅠ融合蛋白，在互補雙鏈DNA上分別形成兩個單鏈DNA斷裂，當(dāng)兩個sgRNA靶位點距離較近且方向正確時，可以形成雙鏈 DNA斷裂。由于兩個sgRNA具有加倍的識別序列長度，因此可以極大降低脫靶突變，特異性提高50～1500倍，并且靶位點處基因敲除效率與野生型Cas9核酸酶相當(dāng)[90,104]。

6 基因組編輯在植物分子育種應(yīng)用中的機遇及技術(shù)展望

第一代轉(zhuǎn)基因技術(shù)自20世紀(jì)80年代誕生至今已有30年時間，很多轉(zhuǎn)基因作物如玉米、大豆、油菜和棉花在世界各地都被種植，但轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性問題一直備受關(guān)注?；蚪M編輯技術(shù)的出現(xiàn)為植物分子育種應(yīng)用提供了前所未有的新機遇。由于基因組編輯具有精確靶向基因組特定位點的特性，首先將SSN導(dǎo)入植物細(xì)胞，實現(xiàn)靶標(biāo)基因進(jìn)行定點修飾后，再從后代中篩選只有目標(biāo)基因突變而不含有 SSN表達(dá)載體的株系(圖 6)。根據(jù)其修飾的方式主要分為三類：基因敲除、少數(shù)核苷酸精確替換和基因定點插入。前兩類修飾的結(jié)果與自然突變或人工誘變非常相似，只有少數(shù)核苷酸的改變，無外源DNA導(dǎo)入；而第三類存在外源DNA導(dǎo)入。國際上對基因組編輯技術(shù)創(chuàng)制的植物新品種是否屬于轉(zhuǎn)基因尚無定論，目前歐盟對GMO 調(diào)控比較嚴(yán)格，只要有外源 DNA 轉(zhuǎn)入細(xì)胞就視為轉(zhuǎn)基因，而不論最終產(chǎn)品中是否還有外源DNA存在；美國USDA 根據(jù)最終產(chǎn)品屬性進(jìn)行評價，用ZFN和TALEN方式產(chǎn)生的前兩類基因修飾不受轉(zhuǎn)基因調(diào)控[105]，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)產(chǎn)生的作物是否如此目前還沒有相關(guān)規(guī)定。迄今為止，美國USDA已認(rèn)可至少3項利用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)制的植物產(chǎn)品不屬于轉(zhuǎn)基因范疇：一項是通過ZFN技術(shù)創(chuàng)制的低肌醇六磷酸的玉米品系；另一項是通過TALEN技術(shù)創(chuàng)制的耐冷藏低丙烯酰胺的馬鈴薯；還有一項是通過TALEN技術(shù)創(chuàng)制的高油酸的大豆。2014年3月，加拿大也通過了其第一個基因組編輯油菜品種，該抗除草劑油菜品種是由美國Cibus Global公司研發(fā)，預(yù)計在2016年能夠上市銷售[106]。目前我國對于基因組編輯植物是否屬于轉(zhuǎn)基因尚無相關(guān)規(guī)定，因此，亟待相關(guān)部門出臺政策規(guī)定以正確引導(dǎo)基因組編輯研究。

圖6 基因組編輯技術(shù)應(yīng)用于植物分子育種

自從序列特異核酸酶發(fā)明以來，經(jīng)過短短的十幾年時間，基因組編輯及相關(guān)領(lǐng)域已經(jīng)取得了革命性變化，特別是CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，極大加快了植物功能基因組學(xué)以及分子育種的研究步伐。但目前也存在一些亟待解決的問題：首先是精確基因定點編輯的能力，即通過 HR途徑實現(xiàn)定點插入或替換的效率。不同物種和細(xì)胞類型中 HR頻率差異很大，而且不同文章中報道的基因打靶載體設(shè)計以及提高效率方法也不盡相同。在植物中如何提高效率還需要進(jìn)行深入系統(tǒng)的探索，建立一套適合植物的體系。本文 5.2部分中論述的方法多在動物體系中得到驗證，在植物體內(nèi)是否有效還需要實驗證明。其次，在提高基因編輯效率的同時，還要避免產(chǎn)生脫靶突變，特別是在利用 CRISPR系統(tǒng)時。本文5.3部分多種方法可以提高基因組編輯的特異性，比如利用Cas9切口酶等，這些方法應(yīng)該同樣能夠用于植物基因組編輯研究。另外Cas9蛋白晶體結(jié)構(gòu)研究成果能夠幫助設(shè)計出具有高切割活性和高特異性的小Cas9核酸酶變異體。第三，多基因編輯技術(shù)在植物中目前已能實現(xiàn)3～4個基因同時敲除，更多個基因(10個或以上)同時敲除尚無報道。CRISPR/Cas9系統(tǒng)無疑是多基因編輯最好的選擇，但可能的困難包括特定物種中只有有限的 RNA聚合酶Ⅲ啟動子可以利用，因此需要鑒定多個能高效轉(zhuǎn)錄sgRNA的自身或近緣物種中的啟動子，或者采用其他系統(tǒng)同時表達(dá)多個 sgRNA，例如 Xie等開發(fā)的多順反子tRNA-sgRNA系統(tǒng)利用了tRNA的自身加工機制可以將一個轉(zhuǎn)錄本加工成多個獨立的sgRNA，大大提高了植物多基因編輯的能力[55]；另外一個困難是缺少簡易且高通量的多基因編輯載體構(gòu)建方法。第四，在人類細(xì)胞系中利用全基因組水平 CRISPR文庫進(jìn)行功能基因的遺傳篩選已經(jīng)比較成熟，未來幾年中在植物(或植物細(xì)胞)中建立大規(guī)模 CRISPR遺傳篩選平臺對于加快功能基因鑒定和基因組學(xué)研究都有重要意義。困難在于植物中缺乏合適的細(xì)胞培養(yǎng)及高效轉(zhuǎn)化體系。第五，基因組編輯的衍生技術(shù)如靶向激活、抑制、表觀修飾以及基因組呈像等在植物中研究很少，特別是定點表觀調(diào)控和基因組呈像尚屬空白，未來在這一領(lǐng)域還應(yīng)該有更多的原創(chuàng)研究，建立適合不同植物的靶向基因表達(dá)調(diào)控等研究工具

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(責(zé)任編委: 張博)

Research progress of genome editing and derivative technologies in plants

Qiwei Shan, Caixia Gao
State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Genome editing technologies using engineered nucleases have been widely used in many model organisms. Genome editing with sequence-specific nuclease (SSN) creates DNA double-strand breaks (DSBs) in the genomic target sites that are primarily repaired by the non-homologous end joining (NHEJ) or homologous recombi-nation (HR) pathways, which can be employed to achieve targeted genome modifications such as gene mutations, insertions, replacements or chromosome rearrangements. There are three major SSNs—zinc finger nuclease (ZFN), transcription activator-like effector nuclease (TALEN) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) system. In contrast to ZFN and TALEN, which require substantial protein engineering to each DNA target, the CRISPR/Cas9 system requires only a change in the guide RNA. For this reason, the CRISPR/Cas9 system is a simple, inexpensive and versatile tool for genome engineering. Furthermore, a modified version of the CRISPR/Cas9 system has been developed to recruit heterologous domains that can regulate endogenous gene expression, such as activation, depression and epigenetic regulation. In this review, we summarize the development and applications of genome editing technologies for basic research and biotechnology, as well as highlight challenges and future directions, with particular emphasis on plants.

genome editing; ZFN; TALEN; CRISPR/Cas9; homologous recombination; off-target mutation

2015-04-13;

2015-06-18

國家自然科學(xué)基金項目(編號：31420103912和31271795)和轉(zhuǎn)基因重大專項(編號：2014ZX0801003B)資助

單奇?zhèn)?，博士，研究方向：遺傳學(xué)。E-mail: qwshan@icloud.com

高彩霞，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：遺傳學(xué)。E-mail: cxgao@genetics.ac.cn

10.16288/j.yczz.15-156

時間:2015-9-1 11:14:07

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150901.1114.006.html