鄭武，谷峰溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院，眼視光學和視覺科學國家重點實驗室培育基地，衛(wèi)生部視覺科學研究重點實驗室，溫州 325027

CRISPR/Cas9的應(yīng)用及脫靶效應(yīng)研究進展

鄭武，谷峰
溫州醫(yī)科大學附屬眼視光醫(yī)院，眼視光學和視覺科學國家重點實驗室培育基地，衛(wèi)生部視覺科學研究重點實驗室，溫州 325027

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在生命科學領(lǐng)域掀起了一場全新的技術(shù)革命，該技術(shù)可以對基因組特定位點進行靶向編輯，包括缺失、插入、修復(fù)等。CRISPR/Cas9比鋅指核酸酶 (ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)技術(shù)更易于操作，而且更高效。CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的向?qū)NA(Single guide RNA, sgRNA)是一段與目標DNA片段匹配的RNA序列，指導(dǎo)Cas9蛋白對基因組進行識別。研究發(fā)現(xiàn)，設(shè)計的sgRNA會與非靶點DNA序列錯配，引入非預(yù)期的基因突變，即脫靶效應(yīng)(Off-target effects)。脫靶效應(yīng)嚴重制約了 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用。為了避免脫靶效應(yīng)，研究者對影響脫靶效應(yīng)的因素進行了系統(tǒng)研究并提出了許多降低脫靶效應(yīng)的方法。文章總結(jié)了 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用及脫靶效應(yīng)研究進展，以期為相關(guān)領(lǐng)域的工作提供參考。

基因組編輯；CRISPR/Cas9；脫靶效應(yīng)；向?qū)NA

CRISPR/Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas9)系統(tǒng)是目前基因組編輯領(lǐng)域最受歡迎的新方法。CRISPR/Cas9來源于簡單的細菌免疫系統(tǒng)，經(jīng)過人為改造后，可在真核細胞中實現(xiàn)高度靈活且特異的基因組編輯(圖1)。該系統(tǒng)通過設(shè)計特異性向?qū)?RNA(Single guide RNA, sgRNA)序列與靶序列進行堿基配對，從而引導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合到靶序列處，行使DNA切割功能，然后利用細胞的非同源性末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源重組(Homologous recombination, HR)修復(fù)機制對斷裂的DNA進行插入缺失(Indel)、修復(fù)(Repair)或替換(Replacement)[1]。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)概述

CRISPR /Cas9系統(tǒng)是一種后天免疫防御系統(tǒng)，用以保護細菌或古細菌免受外來質(zhì)粒或噬菌體的侵入。這類細菌或古細菌基因組的 CRISPR序列能表達與入侵者基因組序列相識別的RNA。當噬菌體等入侵時，該防御系統(tǒng)的 CRISPR序列會表達這類RNA并通過互補序列結(jié)合識別入侵者的基因組序列，然后CRISPR相關(guān)酶(Cas)在序列識別處切割外源基因組DNA，達到抵制入侵的目的。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)基因編輯示意圖

1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)展史

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1987年，研究者在大腸桿菌的基因組中首次發(fā)現(xiàn)了這一奇特的重復(fù)間隔序列[2]，但當時并未引起很大的反響。隨后，在其他細菌和古細菌中也發(fā)現(xiàn)了這一特殊的序列[3]。2005年，研究者發(fā)現(xiàn)這些間隔序列和噬菌體的基因序列匹配度很高，暗示著 CRISPR可能參與了微生物的免疫防御[4～6]，之后有研究者提出了一種假設(shè)機制：CRISPR通過一種類似于真核生物的RNAi機制來行使免疫功能[7]。直到 2011年，才揭示了CRISPR/Cas系統(tǒng)的分子機制：當病毒首次入侵時，細菌會將外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的間隔區(qū)；病毒二次入侵時，CRISPR轉(zhuǎn)錄生成crRNA前體(pre-crRNA)，pre-crRNA經(jīng)過加工形成含有與外源基因匹配序列的crRNA，該crRNA與病毒基因組的同源序列識別后，介導(dǎo) Cas蛋白結(jié)合并切割，從而保護自身免受入侵[8～10]。2013年，研究者報道了CRISPR/Cas9系統(tǒng)可高效地編輯基因組。其中分別在人類細胞和小鼠細胞中成功對部分基因?qū)崿F(xiàn)了編輯[11,12]。至此開始，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在生命醫(yī)學研究領(lǐng)域掀起了一場革命。

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用

在醫(yī)學領(lǐng)域，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，有多項革新式的報道。Fah基因突變會導(dǎo)致遺傳性酪氨酸血癥，研究者利用CRISPR/Cas9在肝細胞中成功修復(fù)了該基因，減緩了疾病小鼠體重下降的臨床表現(xiàn)[13]。這一研究證明了該技術(shù)在人類遺傳病治療上的前景。此外，將sgRNA和Cas9注射到帶有白內(nèi)障致病基因CRYGC突變的小鼠受精卵中，發(fā)現(xiàn)有1/3小鼠的白內(nèi)障得到了治愈[14]。在此基礎(chǔ)上，以精原干細胞為材料進行基因修復(fù)，隨后也得到基因修復(fù)的小鼠[15]。研究者利用CRISPR/Cas9基因修復(fù)技術(shù)，首次成功地在感染有 HIV-1病毒的細胞中滅活HIV-1病毒基因，該研究為HIV的治療探索了新的臨床治療方法[16]。

腫瘤細胞基因組測序可以發(fā)現(xiàn)大量與癌癥相關(guān)的候選基因。但是，要從大量的候選基因中篩選到真正與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因，卻是一項艱巨的工程。而利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在小鼠體內(nèi)實現(xiàn)了這些特定基因的敲出。相對于過去通過逐個敲除小鼠特定基因的方法來說，該方法大大加速了研究的進程[17]。CRISPR/Cas9技術(shù)在規(guī)?；芯炕蚬δ艿确矫嬲l(fā)揮著重要作用[18]。筆者所在團隊利用AAV-CRISPR/Cas9對人類胚胎干細胞的基因組進行了定點編輯，將RFP基因成功插入到視網(wǎng)膜光感受器特異表達的基因NRL位點，該基因敲入的人類胚胎干細胞系將對干細胞介導(dǎo)的人類視網(wǎng)膜疾病的治療具有重要意義(文章待發(fā)表)。

在動物科學領(lǐng)域，CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功對小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)以及秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)等基因組進行編輯[19～22]，需要指出的是利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功對食蟹猴(Macaca fascicularis)基因組的編輯，并培育出個體[23]。這一工作打破了長期以來無法實現(xiàn)高效地對靈長類生物基因組進行修飾的桎梏，為腦科學的進一步發(fā)展奠定了重要基礎(chǔ)。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，也可以實現(xiàn)約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii)基因組的編輯[24]。

在植物科學領(lǐng)域，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也已成功應(yīng)用到擬南芥(A. thaliana)、煙草(Nicotiana tabacum L.)和水稻(O. sativa)等植物中[25, 26]。對水稻基因組的定向編輯，通過后續(xù)的全基因組重測序及檢測與靶序列高度同源的序列，僅在只有一個堿基不同的潛在脫靶位點檢測到了脫靶效應(yīng)。該研究為作物品種改良提供了新的思路[27]。

在微生物領(lǐng)域，利用該技術(shù)對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因組進行編輯[28]。另外，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)還與微生物的耐藥性相關(guān)[29]。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)

CRISPR/Cas9系統(tǒng)雖然能夠高效快速地進行基因編輯，為基礎(chǔ)研究提供了強大的平臺。但是隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)該技術(shù)的重要缺點是脫靶效應(yīng)。因此CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶的影響因素和如何解決成為該技術(shù)研究的熱點。

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的特異性決定于sgRNA上的識別序列(～20nt)。然而，在復(fù)雜的生物基因組中，sgRNA的識別序列可能會與非靶點DNA發(fā)生局部匹配(Partial match)。這種局部匹配，目前可歸結(jié)為兩類：(1) sgRNA與脫靶位點DNA序列長度相同，但存在堿基錯配。針對U2OS.EGFP細胞的VEGFA基因的3個不同位點以及EMX1、FANCF和RNF2基因的一個位點，共設(shè)計了6條sgRNA，經(jīng)篩選檢測后發(fā)現(xiàn)，除了FANCF和RNF2基因外，其他對應(yīng)的sgRNA均導(dǎo)致不同數(shù)量的脫靶效應(yīng)[30]。另外，通過體外篩選與高通量測序相結(jié)合的方法來檢測CRISPR/Cas9系統(tǒng)在HEK293T細胞的脫靶情況，發(fā)現(xiàn)Cas9系統(tǒng)在4個靶位點切割中在基因組其他位置有5個脫靶位點[31]。(2) 脫靶位點 DNA 序列長度比sgRNA多或少幾個堿基，通過形成DNA凸起(DNA bulge) 或RNA凸起(RNA bulge)來完成其他堿基的正確配對。sgRNA的識別序列與脫靶位點DNA序列長度相差5 bp時，仍能通過形成多個 bulge來進行配對并介導(dǎo)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行切割[32]。為降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，研究者對脫靶的影響因素進行了探討，并提出了一系列弱化或消除脫靶效應(yīng)的對策。

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的影響因素

2.1.1 前間區(qū)序列鄰近基序(Protospacer adjacent motif, PAM)

PAM序列區(qū)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)行使切割功能的基本條件。如果靶序列3’端沒有PAM序列，即使靶序列與sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不會切割該序列位點[33]。PAM 序列主要影響 CRISPR/Cas9 的 DNA切割效率。有研究表明，在細胞水平上，NGG(既定PAM序列，canonical PAMs)介導(dǎo)的切割效率是最高的，而其他的15個非NGG序列(非既定PAM序列，non-canonical PAMs)中，NAG的切割效率要高于NGA。然而筆者所在團隊利用綠色熒光報告系統(tǒng)，系統(tǒng)地研究了 PAM序列對切割效率的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在HEK-293細胞中，NGA的切割效率在部分位點反而高于NAG[34]。另外，基于非既定 PAM的雙切口酶在CRISPR/Cas9介導(dǎo)的DNA切割效率仍然很高(文章待發(fā)表)。這些都提示，研究者需要更多地關(guān)注由于非既定 PAM 序列所導(dǎo)致CRISPR/ Cas9的脫靶。

2.1.2 向?qū)NA(Single guide RNA, sgRNA)序列

sgRNA與目標基因組相結(jié)合的20nt序列區(qū)決定著 CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶向特異性。但是有研究指出，CRISPR/Cas9與靶位點識別的特異性其實主要依賴于sgRNA與靠近PAM區(qū)的10～12 bp的堿基配對，而其余遠離PAM序列8～10 bp堿基的錯配對靶位點識別的影響并不明顯[11,12,35]。目前研究結(jié)果均提示，可能靠近PAM的8～14 bp序列是決定特異性的關(guān)鍵，其他序列也均在不同程度上影響脫靶效應(yīng)。

此外，sgRNA的長度也與特異性密切相關(guān)。有研究表明，sgRNA的20nt靶標序列縮短為17nt后，脫靶效應(yīng)大幅度降低，但切割效率沒有受到明顯影響[36]。但是另有研究指出，在設(shè)計的 sgRNA的 5’端額外增加兩個鳥嘌呤核苷酸后能夠顯著提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性[37]。這兩個觀點看似相互矛盾，但實質(zhì)上是從不同的角度來提高sgRNA的結(jié)合特異性。

2.1.3 細胞類型

研究人員發(fā)現(xiàn)在HeLa S3細胞中檢測到的19個脫靶結(jié)合位點中，大多數(shù)位點都與在HEK293T細胞中檢測到的脫靶結(jié)合位點不同，這提示Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)可能具有細胞特異性[38]。此外，DNA甲基化一直是限制ZFNs和TALENs應(yīng)用的重要因素[39,40]，而體外和體內(nèi)實驗表明 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的DNA切割功能并不受甲基化的影響[41]。

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的檢測

脫靶效應(yīng)造成了研究中的許多不確定性，這無疑限制了該技術(shù)的應(yīng)用。因此，研究者希望能開發(fā)有效的方法來檢測脫靶效應(yīng)。染色體免疫共沉淀和高通量測序相結(jié)合(ChIP-seq)，可以對CRISPR/ Cas9的可能脫靶位點進行分析，這可以較好預(yù)測脫靶位點[38,42]。另外，還有一種方法為 GUIDE-seq，其原理是利用一種短的雙鏈寡聚核苷酸標記CRISPR/Cas誘導(dǎo)的脫靶斷裂，然后對標簽所在的基因組區(qū)域進行測序，從而確定脫靶位點。利用該技術(shù)可以在基因組范圍內(nèi)檢測 CRISPR脫靶效應(yīng)，從而改變了以往先預(yù)測假定脫靶位點再檢測的思路；而且，與ChIP-seq相比較，GUIDE-seq更精確、更靈敏[43]。也有報道，利用整合酶缺陷的慢病毒載體(IDLV)來檢測CRISPR/Cas9和TALENs對基因組造成的脫靶效應(yīng)，利用IDLV捕獲切割位點[44]。最近，一種名為Digenome-seq的技術(shù)也被用于檢測脫靶，其原理是利用Cas9核酸酶對人類基因組DNA進行消化，然后進行全基因組測序。這種體外消化會根據(jù)脫靶情況產(chǎn)生不同的特定模式，然后利用計算機進行模式分析來檢測脫靶效應(yīng)[45]。

2.3 降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶的策略

2.3.1 提高sgRNA序列設(shè)計的特異性

只要保證sgRNA序列的特異性，就可以大大降低脫靶的發(fā)生。目前，在設(shè)計sgRNA時需要遵守以下標準[41]：(1)盡量減少 sgRNA與預(yù)測的脫靶位點序列的配對堿基數(shù)；(2)設(shè)計的sgRNA與預(yù)測的脫靶位點在靠近 PAM 區(qū)至少有 2個堿基不配對；(3)sgRNA與預(yù)測的脫靶位點序列要避免有連續(xù)的或間隔的4個堿基配對。

為了使sgRNA的設(shè)計更加便捷，科學家們又研究出了專門用于sgRNA設(shè)計的軟件。用戶在使用的過程中，只要根據(jù)自己的需要來限定相關(guān)的參數(shù)即可迅速獲得符合要求的 sgRNA。第一款在線的sgRNA設(shè)計軟件：http://www.genome-engineering.org/；此后，其他研究者也陸續(xù)推出了一系列設(shè)計軟件，并對參數(shù)和界面等進行了優(yōu)化，如 CasOT，CHOPCHOP等[46,47]。

2.3.2 采用雙切口措施(Double-nicking strategy)策略

為降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，科學家們從 Cas9蛋白改造入手，得到了其突變型 D10A Cas9切口酶(Cas9n)(圖2)[48,49]。野生型的Cas9蛋白有兩個內(nèi)切酶活性結(jié)構(gòu)域，Cas9n的其中一個結(jié)構(gòu)域被失活，因此Cas9n只能切割DNA單鏈，產(chǎn)生一個切口(Nick)。這一改造的系統(tǒng)中，成對sgRNA的設(shè)計是最為關(guān)鍵的，兩條sgRNA結(jié)合不同的DNA鏈，其 PAM 序列要以尾對尾的形式出現(xiàn)，兩個sgRNA結(jié)合的位點之間的距離要適中。Cas9n會在每個sgRNA結(jié)合的地方造成單鏈缺口，兩個相鄰的單鏈切口會形成一個DNA雙鏈斷裂(DSB)，DSB的形成會激起細胞以非同源末端連接(NHEJ)的方式進行修復(fù)，進而引入插入、缺失或者突變。而在脫靶位點處，單個sgRNA只能造成單鏈缺口，無法形成DSB，只能通過同源模板修復(fù)方式精確修復(fù)該區(qū)域。利用改造過的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在不降低基因切割效率的前提下，可大幅度降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小鼠基因組上的脫靶效應(yīng)。該方法也被其他研究組驗證[50]。另有研究指出，將雙切口法和適當縮短sgRNA的靶標序列相結(jié)合，能夠進一步降低脫靶效應(yīng)[36]。2.3.3 fCas9系統(tǒng)策略(FokⅠ-dCas9)

將 Cas9改造為失去催化活性的 Cas(dCas9)(圖3)；然后將dCas9與FokⅠ核酸酶結(jié)合形成融合蛋白(FokⅠ-dCas9)，只有當兩個融合蛋白單體彼此靠近形成二聚體時才能行使切割功能。在應(yīng)用中，需要針對靶點序列的兩條鏈設(shè)計1對sgRNA序列，兩條sgRNA會引導(dǎo)兩個FokⅠ-dCas9蛋白復(fù)合體結(jié)合到靶標位點并形成二聚體。這一策略大幅度降低了非靶向位點的DNA切割[51,52]。

圖2 雙切口酶策略示意圖

圖3 fCas9策略示意圖

3 展 望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)被稱為第三代基因編輯技術(shù)。相比于ZFNs和TALENs系統(tǒng)，它有著無可比擬的優(yōu)點。首先，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的可操作性更強。理論上基因組中每8個堿基就能找到一個可以用CRISPR/Cas9進行編輯的位置(PAM序列)，幾乎可以對所有基因進行編輯[11]；其次，CRISPR/Cas9系統(tǒng)更具有可控性。例如可以通過對Cas9蛋白的修飾，讓它不切斷DNA雙鏈，而只是切開單鏈，這樣可以大大降低切開雙鏈后帶來的 NHEJ造成的染色體變異風險；第三，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的使用極為方便，只需要簡單的幾步就能完成，幾乎任何分子生物學實驗室都可以開展。正是這些優(yōu)勢，使其成為科學界的新寵。在CRISPR/Cas9的基礎(chǔ)上，衍生出了許多新的技術(shù)。例如：CRISPRi可通過對位點的識別來可逆地阻止轉(zhuǎn)錄延伸、RNA聚合酶的結(jié)合或轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合[53]；一種名為 CRISPRm的技術(shù)則應(yīng)用于促進生物分子的定向改造[54]。此外，對CRISPR系統(tǒng)進行改造，研究者可以在活細胞中有效激活任何基因。這一改造促進了人類對整個基因組的功能篩選以及特定疾病的基因鑒定[55]。

從CRISPR/Cas9技術(shù)的研究進程來看，解決脫靶效應(yīng)的策略有以下幾點：(1)改良sgRNA的結(jié)構(gòu)。設(shè)計特異性的sgRNA是解決脫靶的最直接的手段。(2)改造Cas9蛋白。來自麻省理工學院的科學家們發(fā)現(xiàn)來自于金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9蛋白(SaCas9)也具有良好的基因編輯功能，且體外實驗表明其具有很好的特異性[56]。目前對該蛋白的認識還處于發(fā)展階段，相信隨著對其結(jié)構(gòu)和功能研究的不斷深入，科學家們可以找到特異性更強的 Cas蛋白。(3)研究其他類型的 CRISRP/Cas系統(tǒng)。CRISPR/Cas9屬于Ⅱ型，是目前最為簡便、最易操作的系統(tǒng)，而其他 2種類型還知之甚少，也許隨著認識的加深，研究者可能找到更為特異的系統(tǒng)來代替CRISPR/Cas9。

目前，科學家們利用CRISPR/Cas9技術(shù)正在對不同的細胞和物種進行基因組改造。近期，中山大學的研究者首次對人類胚胎的基因組進行編輯，引起廣泛的倫理討論[57]。CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)并沒有得到完美的解決，因此許多人擔心該技術(shù)一旦過早地應(yīng)用于人類非治療性的基因編輯，可能會造成無法預(yù)測的后果。美國再生醫(yī)學聯(lián)盟主席Edward Lanphier等建議研究者目前不要對人類生殖細胞/胚胎進行基因編輯[58]。而有些人則認為該技術(shù)在人類生殖細胞的應(yīng)用研究有利于遺傳病的基因治療，總體來講是利大于弊。因此，這就要求相關(guān)監(jiān)管部門制定切實可行的法律法規(guī)，在不影響該技術(shù)發(fā)展進步的基礎(chǔ)上，嚴格監(jiān)控其應(yīng)用的范圍和程度，杜絕出現(xiàn)違規(guī)濫用現(xiàn)象。

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(責任編委: 張博)

Progress of application and off-target effects of CRISPR/Cas9

Wu Zheng, Feng Gu
State Key Laboratory Cultivating Base of Optometry and Visual Science, Key Laboratory of Vision Science, Ministry of Health, The Eye Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027 China

The clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) system mediates genome editing and is revolutionizing genetic researches. Scientists are able to manipulate the gene of interest from any organism with CRISPR/Cas9. Compared with zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) technologies, the CRISPR/Cas9 technology provides an easy and efficient approach to manipulate the genome. In this system, sgRNA (Single guide RNA), a short RNA matching the targeted DNA fragment, guides the CRISPR/Cas9 to interrogate the genome. Because sgRNA can tolerate certain mismatches to the DNA targets and thereby promote undesired off-target mutagenesis, the key limit of this technology is off-target effects. To eliminate the off-target effects, different strategies have been adopted. In this review, we summarize the application of CRISPR/Cas9 and different strategies for addressing off-target effects.

genome editing; CRISPR/Cas9; off-target effects; sgRNA

2015-02-09;

2015-04-10

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(編號：2013CB967502)，國家自然科學基金項目(編號：81201181/H1818)，浙江省衛(wèi)生廳省部共建項目(編號：WKJ2013-2-023)和溫州醫(yī)科大學人才啟動項目(編號：QTJ 12011 和KYQD141106)資助

鄭武，博士，助理研究員，研究方向：基因修復(fù)研究。E-mail: zheng123wu@163.com

谷峰，博士，研究員，研究方向：基因修復(fù)研究。 E-mail: gufenguw@gmail.com

10.16288/j.yczz.15-070

時間:2015-6-10 15:57:06

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150610.1557.002.html