葉孟亮，聶繼云，徐國(guó)鋒，閆 震，鄭麗靜，李志霞

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部果品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(興城)，農(nóng)業(yè)部果品及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(興城)，遼寧 興城 125100)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高，人們對(duì)果品質(zhì)量安全的要求也越來(lái)越高。農(nóng)藥殘留是果品質(zhì)量安全中比較敏感且備受關(guān)注的話題。二硫代氨基甲酸鹽(酯)類(DTCs)殺菌劑(如代森錳鋅、代森鋅、丙森鋅、福美雙等)因具有高效、廣譜殺菌的效果而在水果生產(chǎn)中廣泛使用［1－2］，其主要代謝物為乙撐硫脲。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)評(píng)估乙撐硫脲僅對(duì)動(dòng)物存在致癌作用［3－4］，但食用含有乙撐硫脲殘留的水果是否會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害，已引起公眾關(guān)注［5－6］。準(zhǔn)確高效的檢測(cè)方法是開(kāi)展乙撐硫脲殘留風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與評(píng)估的基礎(chǔ)。目前關(guān)于乙撐硫脲殘留的檢測(cè)方法有氣相色譜法［7－10］、高效液相色譜法［3，11－12］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［13－16］等，但這些方法存在前處理復(fù)雜、溶劑消耗量大、耗時(shí)、繁瑣、檢出限高、回收率偏低等不足，限制了其應(yīng)用，因此建立快速、準(zhǔn)確的測(cè)定水果中乙撐硫脲殘留的分析方法具有重要意義。

本文在前人研究的基礎(chǔ)之上，對(duì)乙撐硫脲的檢測(cè)方法進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，建立了快速、準(zhǔn)確、高效測(cè)定水果中乙撐硫脲殘留的檢測(cè)方法。采用堿性乙腈(1.5%氨水乙腈)兩次提取，弗羅里硅土進(jìn)行凈化，利用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC－MS/MS)在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行檢測(cè)。該方法有效去除了干擾，提高了靈敏度，定性與定量準(zhǔn)確，能夠很好地滿足水果中乙撐硫脲殘留的快速檢測(cè)和確證要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC－MS/MS Xevo TQ，美國(guó)Waters公司);立式大容量高速離心機(jī)(日本Hitachi公司);Milli-Q全自動(dòng)超純水制水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

甲醇、乙腈、甲酸銨、乙酸銨、甲酸、乙酸、氨水(色譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);C18(ODS，50 μm，60)、石墨炭黑粉(GCB，Agela Technologies Inc);中性氧化鋁(Alumina－N)、弗羅里硅土(Florisil，200 μm，100 g)、PSA(40 μm，100 g)均購(gòu)于美國(guó)Varian公司;無(wú)水MgSO4(優(yōu)級(jí)純，天津市津科精細(xì)化工研究所);NaCl(優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

乙撐硫脲(ETU)標(biāo)準(zhǔn)品(CAS No.96－45－7，德國(guó)Sigma－Aldrich公司)，0.25 g，純度≥99%。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取ETU標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配成1 000 mg/L的儲(chǔ)備液，置于－20℃冰箱保存。準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按照梯度稀釋的原則，配成5，20，50，100，200 μg/L的ETU標(biāo)準(zhǔn)工作液系列。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g勻漿樣品于50 mL具塞離心管中，加入5 mL提取液(1.5%氨水乙腈)，搖勻2 min，靜置10 min，9 000 r/min離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一支離心管中，再向殘?jiān)屑尤? mL提取液，重復(fù)以上操作，合并兩次上清液，加入1 g氯化鈉、2 g無(wú)水硫酸鎂，振蕩混勻2 min，9 000 r/min離心3 min，吸取上層有機(jī)相1 mL于10 mL離心管中，加入0.05 g弗羅里硅土，渦旋振蕩1 min，靜置2 min，上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜，待測(cè)。

1.4 UPLC－MS/MS條件

1.4.1 超高效液相色譜條件 HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)Waters公司);柱溫:40℃;流動(dòng)相:A為乙腈，B為0.2%甲酸水溶液;梯度洗脫程序:0～2 min，5%～95%A;2～4 min，95%～5%A;4～5.5 min，5%A;流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣體積:5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子模式;毛細(xì)管電壓:3.0 kV;檢測(cè)方式:MRM(多反應(yīng)監(jiān)測(cè));離子源溫度:150℃;去溶劑氣溫度:350℃;去溶劑氣和錐孔氣均為高純氮?dú)?，流速分別為650 L/h和50 L/h;碰撞氣:高純氬氣，流速0.14 mL/min。質(zhì)譜參數(shù):錐孔電壓30 V，定量離子對(duì)m/z 103/44.1，碰撞能量16 V;定性離子對(duì)m/z 103/86，碰撞能量14 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化 乙撐硫脲的提取溶劑主要有乙腈［6，16］、甲醇［5，15，17－18］。本研究以蘋(píng)果為例，考察了這兩種提取溶劑對(duì)乙撐硫脲的回收率。結(jié)果表明，以乙腈作為提取溶劑時(shí)，乙撐硫脲的回收率在50%左右，比甲醇作為提取溶劑時(shí)的回收率高10%，但回收率仍較低。Ekman等［6］的研究表明，堿性環(huán)境可以提高乙撐硫脲在乙腈中的溶解性，二者存在共軛效應(yīng)，且乙撐硫脲在pH 5.0～9.0的環(huán)境下較穩(wěn)定［16］。因此，實(shí)驗(yàn)嘗試在乙腈中添加適量氨水(0.5%，1.0%，1.5%和2.0%)，考察提取液pH值對(duì)乙撐硫脲回收率的影響。結(jié)果表明，1.5%氨水乙腈(pH 8.7)的提取效果最好，加標(biāo)回收率達(dá)90%以上，因此最終選擇1.5%氨水乙腈作為提取溶劑(圖1)。

2.1.2 凈化劑的優(yōu)化 本研究以較復(fù)雜的柑橘和含色素較豐富的葡萄為例，采用分散固相萃取即 QuEChERS 方法［19－20］，考察了 ODS、PSA、GCB、Alumina－N和Florisil 5種凈化劑對(duì)水果中色素、有機(jī)酸、脂肪等雜質(zhì)的凈化效果以及對(duì)乙撐硫脲回收率的影響(見(jiàn)表1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了ODS、Alumina－N對(duì)色素的吸附效果較差外(溶液顏色較深)，其余3種凈化劑的凈化效果均良好;而經(jīng)GCB凈化后，葡萄中乙撐硫脲的回收率偏低，為75.2%;經(jīng)PSA凈化后目標(biāo)信號(hào)附近有雜峰干擾。因此，綜合回收率、目標(biāo)信號(hào)峰形、試劑成本等方面，最終選用Florisil為凈化劑。

圖1 不同濃度的氨水乙腈對(duì)蘋(píng)果中乙撐硫脲回收率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of acetonitrile and ammonia solution on recovery of ETU in apple

表1 經(jīng)不同凈化劑吸附后乙撐硫脲的回收率Table 1 Recovery of ETU absorbed by different cleaning agents

2.2 色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相中緩沖鹽的類型和離子強(qiáng)度對(duì)目標(biāo)離子的色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜電噴霧離子的電離程度均有影響。甲酸、乙酸、甲酸銨和乙酸銨具有高揮發(fā)性和高溶解性，常用作液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析的緩沖鹽。對(duì)比了乙腈－甲酸、乙腈－乙酸、乙腈－甲酸銨和乙腈－乙酸銨4種流動(dòng)相體系對(duì)乙撐硫脲峰形及響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，以乙腈－甲酸作為流動(dòng)相時(shí)，乙撐硫脲的峰形較好，響應(yīng)值較高(圖2)。為達(dá)到更高的檢測(cè)靈敏度，本研究進(jìn)一步對(duì)甲酸濃度(0.05%，0.1%，0.2%和0.3%)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)甲酸濃度為0.2%時(shí)，乙撐硫脲的信號(hào)響應(yīng)值最高;當(dāng)濃度超過(guò)0.2%后，乙撐硫脲的響應(yīng)值反而下降，原因在于離子源中離子濃度過(guò)高時(shí)會(huì)抑制待測(cè)組分的電離，從而導(dǎo)致離子化效率下降［21］。因此，實(shí)驗(yàn)確定以乙腈－0.2%甲酸作為最佳流動(dòng)相。

圖2 4種不同流動(dòng)相條件下乙撐硫脲的總離子流色譜圖Fig.2 TIC chromatograms of ETU with four different kinds of mobile phase conditions

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effects)是指色譜分離時(shí)共洗脫的物質(zhì)改變了目標(biāo)分析物的離子化效率，從而引起信號(hào)的抑制或增強(qiáng)［22］?；|(zhì)效應(yīng)影響大時(shí)將降低方法的靈敏度和準(zhǔn)確性，進(jìn)而影響儀器定性及定量分析。關(guān)于液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析中的基質(zhì)效應(yīng)已有大量研究，通常認(rèn)為色譜分離過(guò)程中共流出物質(zhì)對(duì)目標(biāo)組分的響應(yīng)值有很大影響［23］。共流出物質(zhì)主要指樣品前處理后仍保留在待測(cè)樣液中的各類有機(jī)物(如脂肪酸類、糖類、色素等)［18］。選取蘋(píng)果、桃、葡萄、柑橘和香蕉5種代表性水果進(jìn)行研究，考察了乙撐硫脲在不同水果中的基質(zhì)效應(yīng)。分別篩選出不含乙撐硫脲殘留的5種水果作為空白基質(zhì)，用溶劑標(biāo)準(zhǔn)樣液和5種水果空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)樣液，在相同前處理和色譜條件下分別進(jìn)樣，按照公式Matrix effect(Me)=(A－B)/B×100%(A:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)樣液響應(yīng)值，B:溶劑標(biāo)準(zhǔn)樣液響應(yīng)值)計(jì)算乙撐硫脲在不同水果中的基質(zhì)效應(yīng)［20］。結(jié)果表明，乙撐硫脲在5種水果中均表現(xiàn)出基質(zhì)減弱效應(yīng)，且在柑橘和香蕉中的基質(zhì)減弱效應(yīng)較大(表2)。這可能是由不同水果中有機(jī)酸和果膠的含量不同所致［23］。按照農(nóng)藥殘留檢測(cè)結(jié)果相對(duì)偏差不超過(guò)10%的要求［24］，當(dāng)Me的絕對(duì)值大于10%時(shí)，即判定為有基質(zhì)效應(yīng)。因此，為保證方法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)樣液對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行補(bǔ)償。

表2 乙撐硫脲在不同水果樣品中的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects of ETU in different fruits

2.4 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限

用不同水果空白基質(zhì)分別配制5，20，50，100，200 μg/L質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。以乙撐硫脲的峰面積(y)對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x，μg/L)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，乙撐硫脲在5～200 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算方法的檢出限(LOD)，以S/N=10計(jì)算方法的定量下限(LOQ)。5種水果基質(zhì)中乙撐硫脲的LOD為0.08～0.26 μg/L，LOQ為0.28～0.86 μg/L(表3)，均遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的殘留限量(目前國(guó)內(nèi)尚未制定水果中乙撐硫脲最大殘留限量值，按照歐洲國(guó)家規(guī)定的植物性食品中乙撐硫脲的最大殘留限量為50 μg/L計(jì)［8］)，方法的靈敏度可滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。

表3 乙撐硫脲在不同水果樣品中的標(biāo)準(zhǔn)方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 3 Standard regression equations，correlation coefficients(r)，LODs and LOQs of ETU obtained from different fruits

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

分別對(duì)5種不同水果基質(zhì)進(jìn)行5，20，50 μg/L 3個(gè)加標(biāo)水平的回收率實(shí)驗(yàn)。按照本方法進(jìn)行提取、凈化及測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。經(jīng)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)樣液校正后，乙撐硫脲在5種水果中的平均回收率為79.5%～101.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7%～9.4%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，完全滿足水果中乙撐硫脲殘留分析的要求。

表4 乙撐硫脲在不同水果樣品中的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Recoveries and RSDs of ETU obtained from different fruits(n=6)

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的蘋(píng)果、桃、葡萄、柑橘、香蕉5種水果各5個(gè)共25個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，11個(gè)水果樣品(其中蘋(píng)果4個(gè)，桃3個(gè)，葡萄3個(gè)，柑橘1個(gè))中檢出乙撐硫脲殘留，檢出率為44%，殘留量為0.36～5.74 μg/L。陽(yáng)性蘋(píng)果樣品的色譜圖見(jiàn)圖3。

3 結(jié)論

本文建立了水果中乙撐硫脲殘留的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，采用1.5%氨水乙腈兩次提取，弗羅里硅土凈化后，超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC－MS/MS)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均滿足國(guó)家規(guī)定的要求［25］，可用于水果中乙撐硫脲殘留的快速檢測(cè)和確證分析。

圖3 蘋(píng)果中乙撐硫脲殘留的總離子流色譜圖Fig.3 TIC chromatogram of ETU residue in an apple sample

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