劉怡君，邱 寧，馬美湖*

(1．國(guó)家蛋品加工技術(shù)研發(fā)分中心，華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070;2．大連市食品檢驗(yàn)所，大連市食品藥品監(jiān)督管理局，遼寧 大連 116630)

蛋清中蛋白質(zhì)含量是蛋品品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一［1－3］。蛋以及蛋制品中的蛋白質(zhì)研究是提升其價(jià)值的重要研究方向，一方面，蛋白質(zhì)的功效性研究有利于控制蛋品品質(zhì);另一方面，具有生物學(xué)特性的蛋白質(zhì)提取與純化有利于增加蛋品的附加值［4］。獲取蛋清中低豐度蛋白質(zhì)的信息不僅能夠?yàn)榈捌菲焚|(zhì)分級(jí)提供參考依據(jù)，更可為蛋及蛋制品品質(zhì)評(píng)價(jià)提供檢測(cè)的分析基礎(chǔ)和信息平臺(tái)［5］。蛋清低豐度蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展得益于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入［6－8］，低豐度蛋白質(zhì)組學(xué)是研究蛋白質(zhì)功能的必然方向，蛋清中低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)對(duì)蛋及蛋制品的品質(zhì)評(píng)價(jià)具有重要意義。

蛋清中低豐度蛋白質(zhì)的研究思路大多與蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思路相吻合［9－11］，需要先去除高豐度蛋白質(zhì)，使蛋清中低豐度蛋白質(zhì)得到更高效的分離［12－14］。但去除高豐度蛋白質(zhì)的同時(shí)，很多低豐度蛋白質(zhì)亦被去除。

肽配體庫(kù)技術(shù)(CPLL)能夠滿足低豐度蛋白質(zhì)組學(xué)研究更高效和更便捷的檢測(cè)需求［15－17］。其原理不同于其他低豐度蛋白質(zhì)研究方法［18－20］，CPLL能夠在不去除高豐度蛋白質(zhì)的同時(shí)將低豐度蛋白質(zhì)富集，使蛋清蛋白質(zhì)豐度均衡化［21－24］。這避免了去除高豐度蛋白質(zhì)同時(shí)去除低豐度蛋白質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，也使分析過程中容易受高豐度蛋白質(zhì)影響的低豐度蛋白質(zhì)得以檢測(cè)。

CPLL利用特有的六肽配基，與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性吸附，能夠獲得豐度均衡化的蛋白質(zhì)溶液［17］。這種特異性吸附受益于六肽配體的特殊性質(zhì)，六肽配體由20種氨基酸鍵連接6個(gè)肽配體，大量種類不同的六肽意味著，在理論上，任何蛋白質(zhì)均能夠得到吸附。實(shí)際樣品中，蛋白質(zhì)與肽配體的相互作用很可能受到靜電作用、離子相互作用、親和相互作用、疏水相互作用等的影響［25］。不同結(jié)合方式的蛋白質(zhì)，解離強(qiáng)度的差異會(huì)影響蛋白質(zhì)的均衡化程度。因此，本文研究了鹽濃度、pH值、洗脫液順序?qū)PLL豐度均衡化效率的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

FE20型pH計(jì)、FE30電導(dǎo)率儀(Mettler Toledo，美國(guó));HERAcell 150I恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó));真空冷凍干燥箱(Hidolph，德國(guó));LTQ－Orbitrap質(zhì)譜儀(Thermo Electron，德國(guó));Gel－Pro analyzer(Media Cybernetics，美國(guó));PDQuestc_v8.0.1、iMark酶標(biāo)儀、分光光度計(jì)(Bio－Rad，美國(guó))。

ProteoMinerTMCPLL(Bio－Rad，美國(guó));預(yù)染色蛋白質(zhì)(Marker BR Fermentas，美國(guó));胰酶(Promega);丙酮(99%，Promega，美國(guó));裂解液(LB，Bio－Rad，美國(guó));再水化液(99%，Bio－Rad，美國(guó));碘乙酰胺、乙腈(99.9%)、硫代硫酸鈉(99%)、胎牛血清標(biāo)準(zhǔn)品(BSA)、胰酶溶液、鐵氰化鉀(99%)、甲酸(99.9%)、三氟乙酸(TFA，99%)和二硫蘇糖醇(99%)均購(gòu)自Sigma公司;甲醇(99.9%，F(xiàn)isher);實(shí)驗(yàn)用水均由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。PBS緩沖液:150 mmol/L NaCl，10 mmol/L NaH2PO4(pH 7.4)，尿素CHAPS(3-［3-(膽酰胺丙基)二甲氨基］-1-丙磺酸內(nèi)鹽):8 mol/L尿素，2%CHAPS，5%乙酸，HOS(有機(jī)水溶液):6%乙腈，12%異丙醇，2%氨，80%水。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品采集 樣品均來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。雞蛋品種均為白蘭航，隨機(jī)采樣24 h內(nèi)非受精新鮮雞蛋。隨機(jī)取15個(gè)新鮮雞蛋，將蛋清與蛋黃分離，收集蛋清于燒杯中，利用磁力攪拌器攪拌直至燒杯中的蛋清完全均勻。為抑制蛋清中的蛋白酶活性，全程操作溫度≤4℃。蛋清均分成3等份，每份100 mL，分別記為A，B，C。A加入PBS固體使蛋清pH值為7.4，含150 mmol/L NaCl;B加入固體鹽粉，使蛋清溶液含有緩沖鹽25 mmol/L KH2PO4，150 mmol/L NaCl，pH 8.8;C為蛋清原液，實(shí)測(cè)pH 8.8。

1.2.2 CPLL富集 ProteoMinerTM試劑盒(Bio－Rad，美國(guó))。離心柱裝有500 μL珠漿(20%珠粒，20%含水乙醇)。使用PBS緩沖溶液將柱體活化后，分別將蛋清溶液A，B，C與ProteoMinerTM肽配體于20℃室溫振搖2 h，充分富集。富集過程中，蛋清粘蛋白的聚集體在珠球周圍形成白色沉淀，并消除。使用大量的緩沖液以除去過量的可溶性蛋白，使用不同序列的兩個(gè)連續(xù)的洗脫液:先HOS(C1)，后尿素CHAPS(C2);另一組蛋清溶液先C2后C1洗脫。每個(gè)過程重復(fù)3次。

1.3 蛋白質(zhì)組分析

1.3.1 十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE) 凝膠樣品通過12.5%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。12.5%分離膠，4%濃縮膠。樣品加熱5 min，180 V恒定電位。凝膠染色，考馬斯藍(lán)(Bio－Rad，CA)。對(duì)5個(gè)差異條帶進(jìn)行切帶，脫色(脫色液配制:30 mmol/L K3Fe(CN)6－100 mmol/L NaS2O3=1∶1)，脫水，酶切(1.25 mmol/L NH4HCO3稀釋胰酶至12.5 ng/μL)。每管膠粒加入胰酶3 μL，冰浴15 min，加入3 μL 25 mmol/L NH4HCO3，收集液真空濃縮后進(jìn)行肽段濃縮除鹽，得待測(cè)蛋白質(zhì)溶液。

1.3.2 線性離子阱回旋共振質(zhì)譜(LTQ)條件 多肽首先經(jīng)C18反相柱(100 μm i.d．，長(zhǎng)10 cm，5 μm)，肽段在反向柱上的洗脫梯度為5%～40%乙腈流動(dòng)相(A為0.1%甲酸，B為含0.1%甲酸乙腈)洗脫90 min，流速300 nL/min。從反相柱上洗脫的肽段直接用質(zhì)譜LTQ－Orbitrap檢測(cè):離子傳輸管溫度為200℃;電壓1.9 kV，一級(jí)質(zhì)譜在Orbitrap掃描，掃描范圍350～1 800 Da，分辨率為6 000(m/z 400處)，二級(jí)質(zhì)譜分析在LTQ用CID碰撞模式完成。1個(gè)全掃描后選取最強(qiáng)的6個(gè)母離子做二級(jí)質(zhì)譜;動(dòng)態(tài)排除如下設(shè)置:在30 s內(nèi)串聯(lián)質(zhì)譜掃描重復(fù)2次的母離子，在60 s內(nèi)不再進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜掃描。

數(shù)據(jù)使用BIWORKS軟件處理轉(zhuǎn)換為MGF格式文件，通過搜索MASCOAT數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)。原始文件識(shí)別肽段數(shù)4 170和P＜0.01肽后驗(yàn)誤差概率(PEP)和預(yù)設(shè)的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)為0.01，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽濃度對(duì)蛋清pH值與電導(dǎo)率的影響

圖1為新鮮蛋清加入PBS緩沖鹽后其pH值與電導(dǎo)率的變化情況，新鮮蛋清蛋白質(zhì)溶液呈弱堿性環(huán)境;隨緩沖鹽含量的升高，蛋清溶液的pH值下降、電導(dǎo)率增加，蛋白質(zhì)溶液離子間的相互作用增強(qiáng)。

2.2 C1－C2洗脫結(jié)果

圖1 緩沖鹽對(duì)蛋清pH值和電導(dǎo)率的影響Fig.1 pH values and conductivities corresponding to different salt protein chicken egg white solution buffer:150 mmol/L NaCl with different concentration of NaH2PO4

經(jīng)過活化的CPLL對(duì)A，B，C吸附程度不同(見圖2)。圖2非方框區(qū)域，左為標(biāo)尺(MW)和未經(jīng)CPLL處理過的蛋清原液(Native);方框區(qū)域A為樣品 A經(jīng)過 CPLL富集，C1連續(xù)洗脫兩次(C1E1，C1E2)和C2連續(xù)洗脫兩次(C2E1，C2E2)的SDS－PAGE分析結(jié)果。方框區(qū)域B和C分別為樣品B和樣品C經(jīng)過CPLL富集后，C1－C2連續(xù)洗脫兩次的結(jié)果比較。

圖2 C1－C2洗脫順序?qū)，B，C蛋白溶液豐度均衡化的影響Fig.2 Effect of C1－C2 elution sequence on the A，B and C protein solution abundance equilibrium

從圖2可見，與未經(jīng)處理的蛋清原液相比，CPLL能夠使蛋清中蛋白質(zhì)達(dá)到豐度均衡化的效果。蛋清蛋白質(zhì)原液的蛋白質(zhì)分子量集中在72 kDa(卵轉(zhuǎn)鐵蛋白)、43 kDa(卵清白蛋白)、15 kDa(卵轉(zhuǎn)鐵蛋白)。經(jīng)過CPLL豐度均衡化處理后，A，B，C 3個(gè)樣品中其他分子量蛋白質(zhì)得到了有效富集(見圖2虛線部分)。

通過對(duì)比A，B，C 3個(gè)樣品發(fā)現(xiàn)，鹽濃度不同，其CPLL的富集效率不同。樣品B的富集效率最高。在樣品B鹽濃度的調(diào)節(jié)下，C1連續(xù)兩次洗脫能夠使富集后蛋清蛋白質(zhì)洗脫相對(duì)徹底。

樣品B在C1洗脫完成后，C2洗脫1次可使溶菌酶得到高效分離。這說明，先C1后C2洗脫強(qiáng)度差與溶菌酶在CPLL基質(zhì)吸附強(qiáng)度差相當(dāng)。

2.3 C2－C1洗脫結(jié)果

在相同活化條件、不同洗脫順序下，樣品A，B，C的CPLL富集效率不同(圖3)。圖3非方框區(qū)域，左為標(biāo)尺(MW)和未經(jīng)CPLL處理過的蛋清原液(Native);方框區(qū)域A為樣品A經(jīng)過CPLL富集，C2連續(xù)洗脫兩次(C2E1，C2E2)和C1連續(xù)洗脫兩次(C1E1，C1E2)的SDS－PAGE分析結(jié)果。方框區(qū)域B和C分別為樣品B和樣品C經(jīng)過CPLL富集后，C2－C1連續(xù)兩次洗脫的結(jié)果比較。由圖3可知，C2洗脫液能夠?qū)Ω患疌PLL蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)高效洗脫。樣品B鹽溶液條件下的洗脫效率比樣品A，C的洗脫效率高。

圖3 C2－C1洗脫順序?qū)，B，C蛋白溶液豐度均衡化的影響Fig.3 Effect of C2－C1 elution sequence on the A，B and C protein solution abundance equilibrium

2.4 質(zhì)譜

圖4為蛋清溶液B(pH 8.8的25 mmol/L磷酸鹽緩沖液+150 mmol/L NaCl)，經(jīng)C2洗脫后的蛋白質(zhì)分布。由圖4可知，SDSPAGE凝膠電泳條帶的清晰度隨上樣蛋白質(zhì)凈含量的增大而更顯著。增加蛋清蛋白質(zhì)的凈含量可提高LTQ質(zhì)譜檢出率。本研究中取60 μg對(duì)應(yīng)條帶上5個(gè)區(qū)域的胰蛋白酶經(jīng)酶切后進(jìn)行LTQ質(zhì)譜檢測(cè)。根據(jù)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，通過比對(duì)雞蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBInr)和接受唯一的親蛋白的鑒定，檢出45個(gè)蛋白，結(jié)果見表1。

圖4 蛋白質(zhì)含量對(duì)SDS－PAGE灰度的影響Fig.4 Effect of protein content on SDS－PAGE gray scale

根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，D’Ambrosio等［23］利用CPLL結(jié)合表面增強(qiáng)激光解吸電離質(zhì)譜(SELDI－MS)確定了148個(gè)獨(dú)特的蛋清中蛋白質(zhì)種類;Mann等［7］利用數(shù)字化線性離子阱質(zhì)譜(LTQ Orbitrap Velos)先進(jìn)的計(jì)算方法獲得了158個(gè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果。本研究?jī)?yōu)化了CPLL前處理方法，選取差異條帶進(jìn)行LTQ質(zhì)譜檢測(cè)，獲得了2種尚未見報(bào)道的蛋清蛋白質(zhì)，分別為229 kDa的蛋白和CCDC42假想蛋白。45種蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞位置分析見圖4，其中分泌蛋白和未知蛋白所占比例最大，分別為13個(gè)和12個(gè)，質(zhì)膜蛋白7個(gè)，其他細(xì)胞間蛋白8個(gè)，胞外蛋白5個(gè)。

表1 45個(gè)蛋清蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 1 45 Unique gene products found in egg white by LTQ

(續(xù)表1)

由表1可知，卵清蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白與溶菌酶是蛋清中的高豐度蛋白質(zhì)。在所選取的差異條帶中，檢測(cè)到高豐度蛋白質(zhì)的可能原因分析如下:①高豐度蛋白質(zhì)可能與低豐度蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，使高豐度蛋白質(zhì)與低豐度蛋白質(zhì)同時(shí)被檢測(cè);②降解情況的發(fā)生使高豐度蛋白質(zhì)形成多肽，進(jìn)行SDSPAGE分析時(shí)高豐度蛋白質(zhì)等電點(diǎn)發(fā)生變化，導(dǎo)致其與低豐度蛋白質(zhì)的條帶重合而被檢測(cè)。這種以差異蛋白質(zhì)條帶為目標(biāo)的檢測(cè)，在某種程度上增大了低豐度蛋白鑒定的可靠性，避免了質(zhì)譜鑒定過程中因高豐度蛋白質(zhì)干擾而造成的質(zhì)譜鑒定靈敏度降低。

2.5 蛋清蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)表1中列出的45種蛋白質(zhì)的質(zhì)譜信息，通過UniProtKB/Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，獲得這些蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位結(jié)果(圖5)。45種蛋白質(zhì)中有19種蛋白質(zhì)與雞胚發(fā)育關(guān)系密切，可能參與某些生物活動(dòng)并發(fā)揮功能。此外，其中一些蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位不是蛋清，差異條帶中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)，分泌型蛋白質(zhì)相對(duì)較多。據(jù)推測(cè)，這些蛋白質(zhì)在蛋清中出現(xiàn)很可能是源于雞胚形成過程輸卵管壁等遺留蛋白。同時(shí)有部分是細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)，未知亞細(xì)胞位置的蛋白質(zhì)占較大比重。

圖5 蛋清蛋白亞細(xì)胞定位(描述來源UniProtKB/Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫(kù))Fig.5 Subcellular location of proteins identified in egg white corresponding to Table 1 by description and origin of the protein in UniProtKB/Swiss－Prot

3 結(jié)論

蛋清中低豐度蛋白質(zhì)豐富，利用肽配體庫(kù)技術(shù)可高效、快速地分析蛋清中的低豐度蛋白質(zhì)組。先HOS后尿素CHAPS連續(xù)洗脫能夠獲得高純度溶菌酶，該洗脫方式擴(kuò)大了肽配體庫(kù)的使用范圍。提高CPLL對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的吸附和洗脫效率的最優(yōu)條件為:pH 8.8，25 mmol/L磷酸鹽緩沖液，150 mmol/L NaCl。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，線性離子阱質(zhì)譜檢測(cè)的分析方法，能夠使蛋清中低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)達(dá)到亞細(xì)胞水平。

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