嚴(yán)春梅，劉 鑫，梁 英，殷世民

(桂林電子科技大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

固相熒光光譜法因操作簡單、靈敏度高等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注［1］。1977年Heller等首次采用固相熒光光譜法測定了低濃度的三硝基甲苯(TNT)［2］。20世紀(jì)90年代以來，Muller等［3］用三維固相熒光光譜法表征了固體廢物的成分;Yang等［4］以尼龍膜作為支撐材料，建立了簡單、高靈敏的2-萘磺酸固相熒光檢測法，為降低2-萘磺酸對人類和環(huán)境的危害做出了貢獻(xiàn)。del Olmo等［5］建立了用于測定水樣中痕量西維因的新型固相熒光系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用脈沖氮激光作為激發(fā)光源，以一種電荷耦合器件作為檢測器，將自然水域中的西維因轉(zhuǎn)化為1-萘酚進(jìn)行測定。Alves等［6］用固相分子熒光法測定藥物中的乙酰水楊酸、乙酰氨基酚和咖啡因;Huang等［7］將復(fù)合分子印跡聚合物膜(CIP)與固相熒光光譜法結(jié)合，測定了水樣中的L-苯丙氨酸，該方法無需進(jìn)行洗脫操作，簡單、選擇性好、實(shí)驗成本低。同時，他們還運(yùn)用鋱(Ⅲ)水楊酸印跡膜(CIM)結(jié)合固相熒光光譜法快速分離和檢測了藥物和人體尿液中的水楊酸，避免了基底熒光對熒光法測定水楊酸的影響，建立了一種簡單、高效、快速、低成本的固相熒光光譜法［8］。Hu等［9］將復(fù)合分子印跡聚合物膜(CIP)與固相熒光光譜法結(jié)合，用于測定生物樣品中的槲皮素，方法選擇性強(qiáng)、成本低、測定快速。由此可見，經(jīng)過幾十年的發(fā)展，固相熒光光譜法已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境［3－5］、醫(yī)學(xué)［6－8］、生物［9］等領(lǐng)域，具有簡單、高效等優(yōu)點(diǎn)，但目前尚未見用于氨氮測定的文獻(xiàn)報道。

圖1 反應(yīng)機(jī)理Fig.1 Reaction mechanism of proposed method

1 實(shí)驗部分

1.1 試劑與溶液

實(shí)驗所用化學(xué)藥品均為分析純(阿拉丁公司)，有特別說明的藥品除外。實(shí)驗用水為電阻率大于18.2 MΩ·cm的超純水。氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液:將于110℃干燥至恒重的(NH4)2SO4，配制成氨氮濃度為20 mmol/L的氨氮標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃冷藏保存，使用時稀釋成氨氮濃度為0.10 mmol/L的氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用液，當(dāng)天配制;不同濃度的氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用0.10 mmol/L的氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用液稀釋得到。10.6 g/L鄰苯二甲醛溶液:稱取2.65 g OPA，溶于50 mL甲醇(色譜純，阿拉丁)，再用水稀釋至250 mL，搖勻密封避光冷藏保存。2.50 g/L Na2SO3溶液:稱取1.25 g無水Na2SO3固體，溶于500 mL水后，向其中加入0.20 mL甲醛溶液(防止亞硫酸鈉溶液變質(zhì))，搖勻后冷藏保存。OPA－Na2SO3混合溶液:將一定體積的10.6 g/L OPA溶液和2.50 g/L Na2SO3溶液混合稀釋而成，溶液中OPA和Na2SO3的濃度分別為0.795 g/L和0.250 g/L。EDTA－NaOH緩沖溶液:稱取26.0 g EDTA二鈉和10.0 g NaOH溶于500 mL水中配制而成。

1.2 實(shí)驗方法

將中速定量濾紙裁剪成3.5 cm×3.5 cm的正方形小濾紙片(每張濾紙片必須保證無污損，可置于聚乙烯塑料袋中密封長期保存)，置于適量(以完全浸泡濾紙為宜)OPA－Na2SO3混合溶液中浸泡至少4 h，使濾紙充分吸收混合溶液中的反應(yīng)試劑OPA和Na2SO3，待用。為減少誤差，同一條曲線上各點(diǎn)測定必須使用當(dāng)天同一批制備的濾紙;測定樣品時，工作曲線和樣品測定必須使用當(dāng)天同一批制備的濾紙。

圖2 自制反應(yīng)瓶Fig.2 Self-made reaction bottle

分別取50 mL不同濃度(2.00～12.0 μmol/L)的氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液或水樣于500 mL自制反應(yīng)瓶中(如圖2)，從OPA－Na2SO3混合浸泡液中取出濾紙片置于反應(yīng)瓶中的白色塑料支架上，加入4.0 mL EDTA－NaOH緩沖溶液至反應(yīng)液中，控制反應(yīng)液的pH值為11.5～13.0，蓋好瓶蓋，緩慢搖勻反應(yīng)液，室溫放置165 min，使反應(yīng)液中逸出的氨氣與濾紙片上的OPA與Na2SO3充分反應(yīng)生成熒光物質(zhì)，用鑷子取出濾紙，迅速置于固相熒光測定支架上，設(shè)置儀器的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為3.0 nm，激發(fā)和發(fā)射波長分別為368 nm和426 nm，用RF－5301PC型熒光分光光度計(島津公司)測定濾紙上熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。為減小固相載體不均勻性帶來的測定誤差，對同一個濾紙樣品，通過移動濾紙在測定支架上的位置使激發(fā)光照射在濾紙的不同位置，測得5個不同點(diǎn)的熒光值(圖3)，取其平均值為該樣品的熒光測定值(IF)，根據(jù)熒光測定值與反應(yīng)液中氨氮濃度的關(guān)系確定樣品中的氨氮濃度。

圖3 濾紙熒光值測定點(diǎn)示意圖Fig.3 Measuring points in a filter paper

2 結(jié)果與討論

2.1 激發(fā)光譜與熒光光譜

配制濃度為12.0 μmol/L的氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“1.2”方法測定濾紙上熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，OPA與氨氮反應(yīng)所生成熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長λex=368 nm，最大發(fā)射波長λem=426 nm，與OPA液相熒光法的激發(fā)波長、發(fā)射波長一致［14－17］，說明氨氮與OPA和Na2SO3在濾紙上生成的熒光產(chǎn)物與在液相中的相同，均為熒光異吲哚化合物。因此，本實(shí)驗設(shè)置激發(fā)和發(fā)射波長分別為368 nm和426 nm。

圖4 熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜(a)和熒光光譜(b)Fig.4 Excitation(a)and emission(b)spectra of the products of OPA－NH3－sulfite reaction on the filter paper

2.2 實(shí)驗參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 濾紙浸泡時間的優(yōu)化 濾紙浸泡于OPA－Na2SO3混合液中的目的是使其充分負(fù)載可與氨氮反應(yīng)的熒光試劑，理論上，時間過短，負(fù)載不飽和，可能會影響后續(xù)的固相熒光反應(yīng)。為考察濾紙浸泡時間對實(shí)驗結(jié)果的影響，固定其它實(shí)驗條件如“1.2”所述，采用單因素法考察空白和8.00 μmol/L氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對應(yīng)的熒光測定值與濾紙浸泡時間的關(guān)系。結(jié)果表明，當(dāng)濾紙浸泡時間介于15 min～2.0 h時，隨著浸泡時間的增加，空白和8.00 μmol/L氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對應(yīng)的熒光測定值呈先增后降的趨勢;當(dāng)浸泡時間超過2.0 h時，熒光測定值逐漸趨于穩(wěn)定?？紤]到方法的可重復(fù)性和易操作性，實(shí)驗選擇將濾紙浸泡超過4.0 h后使用。

2.2.2 濾紙浸泡液中OPA與Na2SO3濃度的確定 濾紙浸泡液為OPA－Na2SO3混合溶液，本課題組的前期研究結(jié)果［18］表明，OPA及Na2SO3與氨氮在液相溶液中反應(yīng)的最佳濃度為OPA:0.457～0.913 g/L，Na2SO3:0.081～0.326 g/L。參照該結(jié)果，本實(shí)驗選擇濾紙浸泡液中OPA濃度為0.795 g/L，Na2SO3濃度為0.250 g/L。

2.2.3 反應(yīng)液pH值的優(yōu)化 氨氮在水溶液中通常以NH+4和NH3兩種形態(tài)存在，當(dāng)水溶液pH值大于9.75時，主要以NH3形態(tài)存在［19］。本方法的反應(yīng)原理是水樣中的氨氮在堿性溶液中以NH3形態(tài)逸出反應(yīng)液，與濾紙上的反應(yīng)試劑反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物。因此，反應(yīng)液的pH值會影響NH3形態(tài)在反應(yīng)液中的含量，進(jìn)而影響濾紙上生成的熒光產(chǎn)物量。為了考察反應(yīng)液pH值對實(shí)驗結(jié)果的影響，固定其它實(shí)驗條件如“1.2”所述，通過改變1.0 mol/L NaOH溶液的加入量以改變反應(yīng)液的pH值，考察了空白和8.00 μmol/L氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對應(yīng)的熒光測定值與pH值(10.0～13.0)的關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。在此pH值范圍內(nèi)，空白和8.00 μmol/L氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對應(yīng)的熒光測定值隨著pH值的增大先增加，當(dāng)pH值超過11.5后，熒光測定值趨于穩(wěn)定。因此，本方法反應(yīng)液的適宜pH值為11.5～13.0。另外，在50 mL反應(yīng)液中加入4.0 mL EDTA－NaOH緩沖溶液，可控制河水、地下水、山泉水、純水等水樣的pH值在本方法的適宜pH值范圍內(nèi)，因此，實(shí)驗選擇在反應(yīng)液中加入4.0 mL EDTA－NaOH緩沖溶液以控制反應(yīng)液的pH值。

圖5 反應(yīng)液pH值對空白(a)及8.00 μmol/L氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(b)熒光反應(yīng)的影響Fig.5 Effects of pH values of reaction solution on fluorescence reaction of blank(a)and 8.00 μmol/L ammonium solution(b)

2.2.4 反應(yīng)平衡時間的確定 配制8.00 μmol/L氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，固定其它實(shí)驗條件如“1.2”所述，分別在不同時間點(diǎn)測定其熒光強(qiáng)度。發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時間為30～165 min時，熒光測定值快速增加;反應(yīng)時間為165～210 min時，熒光測定值趨于穩(wěn)定，說明反應(yīng)已達(dá)平衡，因此本方法選擇反應(yīng)平衡時間為165 min。

2.3 工作曲線與檢出限

2.3.1 工作曲線 在優(yōu)化實(shí)驗條件下，分別配制氨氮濃度為2.00，3.00，4.00，8.00，12.0 μmol/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗方法進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，熒光測定值與反應(yīng)液中氨氮濃度在2.00～12.0 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為IF=12.10c(μmol/L)+177.6(n=5，r=0.993 5)。

2.3.2 檢出限 采用本方法平行測定7個空白樣，熒光測定平均值為91.244，標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.53，按照檢出限=3×SD/工作曲線斜率［20］，計算得本方法的檢出限為0.746 μmol/L。當(dāng)天工作曲線的回歸方程為:IF=18.21c(μmol/L)+89.10(n=4，r=0.998 0)。

2.4 方法驗證

2.4.1 加標(biāo)回收率 以泉水、河水作為基底，分別加入不同濃度的氨氮測定基底加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。由表1知，加標(biāo)濃度分別為3.00，6.00 μmol/L時，泉水的基底加標(biāo)回收率分別為(101.6±14.3)%、(96.6±4.8)%，河水的基底加標(biāo)回收率分別為(89.6±6.5)%、(91.7±5.0)%，說明本方法可用于測定泉水和河水中的氨氮，基底均無干擾。

表1 泉水和河水基底的加標(biāo)回收率(n=3)Table 1 The matrix spiked recoveries of spring and river sample(n=3)

2.4.2 與靛酚藍(lán)分光光度方法的比較 靛酚藍(lán)分光光度法［21］是測定氨氮的經(jīng)典方法，采用本方法與靛酚藍(lán)分光光度法對取自桂林市花江的兩個河水樣品進(jìn)行測定，并對兩者的結(jié)果做t統(tǒng)計檢驗，結(jié)果列于表2。表2數(shù)據(jù)表明，兩個河水樣品的統(tǒng)計量t的計算值均小于置信度為95%時的臨界值，說明本法用于河水樣測定與靛酚藍(lán)分光光度法的結(jié)果無顯著差異。

表2 本法與靛酚藍(lán)分光光度法測定結(jié)果的比較(n=3)Table 2 Comparison of analytical results of the proposed method and the indophenol blue method(n=3)

2.5 方法的應(yīng)用

2014年11月22日取自花江上游到下游的14個水樣，立即用本法和靛酚藍(lán)分光光度法［21］進(jìn)行測定。當(dāng)水樣中氨氮的濃度大于12.0 μmol/L，用本法測定時，水樣需稀釋后方可進(jìn)行。以靛酚藍(lán)方法的測定結(jié)果為橫坐標(biāo)，本法的測定結(jié)果為縱坐標(biāo)，作線性相關(guān)圖。結(jié)果表明，花江水樣中氨氮濃度在2.50～34.0 μmol/L范圍內(nèi)，本方法與靛酚藍(lán)分光光度法的測定結(jié)果呈顯著線性相關(guān)，相關(guān)方程為y=1.177x－0.759(n=14，r=0.992 5)，其斜率為1.177，接近1.0，說明本方法測定河水樣與靛酚藍(lán)分光光度法的測定結(jié)果無顯著差異，能準(zhǔn)確測定河水樣中氨氮的含量。

3 結(jié)論

本文基于OPA－NH3－Na2SO3的熒光反應(yīng)，以濾紙為固相載體，建立了操作簡單、試劑消耗少、靈敏度高、成本低的固相熒光分析方法。該方法的線性范圍為2.00～12.0 μmol/L，檢出限為0.746 μmol/L，基底加標(biāo)回收率為89.6%～101.6%。用本法與靛酚藍(lán)分光光度法測定河水樣，兩者的測定結(jié)果無顯著性差異。相對于其它測定氨氮的光譜分析方法，本方法無需對水樣進(jìn)行預(yù)處理，操作簡便，成本較低。

［1］Matsuoka S，Yoshimura K．Anal.Chim.Acta，2010，664(1):1 －18．

［2］Heller C A，McBride R R，Ronning M A．Anal.Chem．，1977，49(14):2251－2253．

［3］Muller M，Milori D M B P，Déléris S，Steyer J P，Dudal Y J．Waste Manage．，2011，31(6):1916 －1923．

［4］Yang X H，Liu B X，Wu T，Du Y P．Anal.Lett．，2013，46(15):2410 －2420．

［5］del Olmo M，Laserna J，Romero D，Rohand J，Vilchez J L．Talanta，1997，44(3):443 －449．

［6］Alves J C L，Poppi R J．Anal.Chim.Acta，2009，642(1/2):212 －216．

［7］Huang J X，Hu Y L，Li G K．Anal.Methods，2013，18(5):4680 －4686．

［8］Huang J X，Hu Y F，Hu Y L，Li G K．Talanta，2013，107(3):49－54．

［9］Hu Y F，F(xiàn)eng T，Li G K．Spectrochim.Acta A，2014，118(1):921 －928．

［10］Dugdale R C．Limnol.Oceanogr．，1967，12(4):685 －695．

［11］Painting S J，Devlin M J，Malcolm S J，Parker E R，Mills D K，Mills C，Tett P，Wither A，Burt J，Jones R，Winpenny K．Mar.Pollut.Bull．，2007，55(1/6):74 －90．

［12］Fukushi K，Ito H，Kimura K，Yokota K，Saito K，Chayama K，Takeda S，Wakida S．J.Chromatogr.A，2006，1106(1/2):61－66．

［13］Kurama H，Poetzschke J，Haseneder R．Water Res．，2002，36(11):2905 －2909．

［14］Genfa Z，Dasgupta P K．Anal.Chem．，1989，61(5):408－412．

［15］Amornthammarong N，Zhang J Z，Ortner P B．Anal.Methods，2011，3(7):1501 －1506．

［16］ Yu X X，Guo W D．Mar.Sci．(余翔翔，郭衛(wèi)東．海洋科學(xué))，2007，31(4):37－41．

［17］Chen X，Tang Y，Li M J，Li W，Zhuang Z X，Wang X R．Chin.J.Xiamen Uuiv.:Nat.Sci．(陳曦，唐勇，李梅金，李偉，莊峙廈，王小如．廈門大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版)，2001，40(1):59－61．

［18］Hu H Z，Liang Y，Li S，Guo Q，Wu C C．J.Anal.Methods Chem．，2014，Article ID728068．

［19］Molins－Legua C，Meseguer－Lloret S，Moliner－Martinez Y，Camp＇i ns－ Falcó P．Trends Anal.Chem．，2006，25(3):282－290．

［20］Gao R M，Liu H G．Chin.J.Anal.Chem．(高若梅，劉鴻皋．分析化學(xué))，1993，21(10):1232－1236．

［21］Kanda J．Water Res．，1995，29(12):2746 －2750．