王東武，劉志娟，許 峰，劉 斐，侯倩倩，安冬華

(1．迪沙藥業(yè)集團(tuán) 國(guó)家認(rèn)定企業(yè)技術(shù)中心質(zhì)量研究院，山東 威海 264200;2．中國(guó)兵器工業(yè)集團(tuán) 第五三研究所，山東 濟(jì)南 250031;3．迪沙藥業(yè)集團(tuán) 迪素質(zhì)管部，山東 威海 264200)

格列喹酮屬于第二代磺脲類降糖藥，具有高活性胰島β細(xì)胞親和作用，能夠與胰島β細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，誘導(dǎo)產(chǎn)生適量胰島素以降低血糖濃度。該藥品安全有效，毒副作用少，對(duì)于新發(fā)的二型糖尿病有顯著療效，尤適用于糖尿病伴有腎損傷或腎移植的病人［1－4］。格列喹酮按照化學(xué)藥品注冊(cè)分類屬于6類化藥，其工業(yè)化大生產(chǎn)的工藝路徑是:格列喹酮主環(huán)物與對(duì)乙胺苯磺酰胺縮合后，再與N-環(huán)己基甲酰胺進(jìn)行脫氫縮合生成格列喹酮(見圖1)。格列喹酮主環(huán)物作為合成格列喹酮的關(guān)鍵起始物料，按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥審中心頒布的《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，需對(duì)格列喹酮主環(huán)物進(jìn)行雜質(zhì)研究。由格列喹酮主環(huán)物生產(chǎn)工藝可知，合成格列喹酮主環(huán)物過(guò)程中使用了大量的水合氯醛，由于水合氯醛具有一定的毒性，大劑量可引起昏迷、麻醉、肝損傷、呼吸抑制及心血管功能改變，甚至死亡，因此需要建立嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以控制格列喹酮主環(huán)物中水合氯醛的含量［5－9］。

圖1 格列喹酮的合成工藝路線圖Fig.1 Chart of gliquidone synthesis process

目前水合氯醛含量的測(cè)定方法主要為紫外分光光度法和氣相色譜法［10－12］，其中分光光度法易受格列喹酮主環(huán)物的干擾，而氣相色譜法檢測(cè)時(shí)，由于水合氯醛結(jié)構(gòu)中碳?xì)滏I數(shù)目較少，燃燒時(shí)產(chǎn)生的碳?xì)渥杂苫?，?dǎo)致靈敏度低，難以滿足準(zhǔn)確檢測(cè)格列喹酮主環(huán)物中痕量水合氯醛的要求。

氧瓶燃燒法作為一種成熟的樣品前處理方法已廣泛應(yīng)用于有機(jī)溴、氯、磷及硫等元素的含量測(cè)定［13－15］，該方法使有機(jī)溴、氯、磷及硫等元素通過(guò)富氧燃燒轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)元素，然后通過(guò)滴定、離子色譜等方法測(cè)定無(wú)機(jī)元素的含量間接測(cè)定這些有機(jī)元素。離子色譜法在離子檢測(cè)方面具有靈敏度高、專屬性好等優(yōu)點(diǎn)，特別是近年來(lái)離子色譜填料技術(shù)、電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)及離子抑制技術(shù)的快速發(fā)展，使得離子色譜法在分析檢測(cè)領(lǐng)域得到了普遍應(yīng)用［16－21］。以氧瓶燃燒法進(jìn)行樣品處理，離子色譜法進(jìn)行檢測(cè)的分析方法，已廣泛應(yīng)用于化工、生物、醫(yī)藥等樣品中有機(jī)硫、氯等元素的含量測(cè)定［22－25］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Toson IC－2010離子色譜儀(日本Toson公司)，配有高壓二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、自動(dòng)交換凝膠離子抑制系統(tǒng)、電導(dǎo)檢測(cè)器及IC－2010數(shù)據(jù)工作站;色譜柱:日本TSKgec SuperIC－Anion HS陰離子色譜柱(4.6 mm i.d.×10 cm，3.5 μm);TSK suppress IC－A陰離子抑制膠(日本Toson公司);熱電超純水系統(tǒng)EASY pureⅡ(美國(guó)熱電公司);濾紙(杭州特種紙業(yè)有限公司)。

Cl－，F(xiàn)－，I－，SO2－4，NO－2，NO－3，PO3－4，Br－對(duì)照品溶液，濃度均為1 000 mg/L(國(guó)防科技工業(yè)應(yīng)用化學(xué)一級(jí)計(jì)量站);NaOH(成都科龍化工試劑廠，批號(hào)20120416)、無(wú)水NaCO3(天津市鼎盛鑫化工有限公司，批號(hào)20141015)、NaHCO3(天津市巴斯夫化工有限公司，批號(hào)20081103)、水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20110411)均為分析純;格列喹酮主環(huán)物(迪沙藥業(yè)集團(tuán)原料藥研究二院，批號(hào)分別為:141205M1，141205M2，141205M3)。

1.2 溶液制備

供試品溶液:準(zhǔn)確稱取格列喹酮主環(huán)物約10 mg，包裹于濾紙中，放入鉑絲鉗口，用酒精燈引燃，迅速置于盛有20 mL 0.05 mol/L NaOH的燃燒瓶中，瓶中富氧，燃盡后，以超純水封口，待吸收1 h后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，燒瓶多次沖洗，洗液均轉(zhuǎn)入容量瓶中，與吸收液合并，超純水定容至刻度后，搖勻。

供試品溶液加標(biāo):將上述洗液與吸收液合并后，加入一定體積的Cl－標(biāo)準(zhǔn)溶液，超純水定容至刻度，搖勻即得。

濾紙對(duì)照溶液:取濾紙(大小同包裹樣品用濾紙)，放入鉑絲鉗口，用酒精燈引燃，迅速置于盛有20 mL 0.05 mol/L NaOH的燃燒瓶中，進(jìn)行富氧燃燒，燃盡后，超純水封口，待吸收1 h后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，燒瓶多次沖洗，洗液均轉(zhuǎn)移至容量瓶中，與吸收液合并，超純水定容至刻度后，搖勻。

Cl－對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密移取1 000 mg/L的Cl－標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL至100 mL容量瓶中，超純水稀釋后定容至刻度，搖勻即得。

Cl－對(duì)照溶液:精密量取Cl－對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL至100 mL容量瓶中，超純水稀釋后定容至刻度，搖勻即得。

干擾離子對(duì)照溶液:分別精密量取濃度均為1 000 mg/mL的F－，Cl－，NO－3，I－，PO3－4，SO2－4，Br－，NO－2標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL至100 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度，搖勻，精密量取該溶液1 mL至25 mL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻即得。

本研究證實(shí)注射用雷貝拉唑鈉不僅對(duì)急性潰瘍，如醋酸性模型和幽門結(jié)扎法模型有效，還對(duì)消炎痛法模型等慢性潰瘍有效，同時(shí)還對(duì)大鼠反流性食管炎以及半胱胺型十二指腸潰瘍均具有良好的抑制作用，與臨床適用癥一致。

方法開發(fā)溶液的配制:精密稱取格列喹酮主環(huán)物約10 mg，用濾紙包裹，置于鉑絲鉗口，夾緊，引燃，迅速插入盛有20 mL 0.05 mol/L NaOH的富氧燒瓶中，燃盡后，超純水封口。待吸收1 h后，吸收液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，燒瓶多次沖洗，合并洗液與吸收液，加入0.4 mL 10 mg/L的Cl－，超純水定容后，搖勻即得。此時(shí)溶液中氯離子的濃度約為0.056 mg/mL。

加標(biāo)供試品:精密稱取格列喹酮主環(huán)物約20 g加至50 mL二氯甲烷中，加入3種質(zhì)量(12.48，15.60，18.72 mg)的水合氯醛，攪拌至全溶，室溫真空抽干，得樣品。精密稱取該樣品約10 mg，用濾紙包裹，置于鉑絲鉗口，夾緊，引燃后，迅速插入盛有20 mL 0.05 mol/L NaOH水溶液中的500 mL富氧燒瓶中，密閉燒瓶后，倒置燒瓶待樣品熾灼燒盡后，超純水封口。1 h后，吸收液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，燒瓶多次沖洗，合并洗液與吸收液，超純水定容，搖勻后即得加標(biāo)80%供試品，加標(biāo)100%供試品，加標(biāo)120%供試品。

1.3 分析方法

Toson IC－2010離子色譜儀;色譜柱為TSKgec SuperIC－Anion HS陰離子色譜柱(4.6 mm i.d.×10 cm，3.5 μm);流動(dòng)相為7.5 mmol/L NaHCO3－1.1 mmol/L Na2CO3;流速為1.0 mL/min;柱溫40℃;進(jìn)樣量為30 μL;檢測(cè)器為電導(dǎo)檢測(cè)器。

2 結(jié)果與討論

2.1 濾紙選擇

通過(guò)對(duì)比研究杭州特種紙業(yè)有限公司和撫順市民政濾紙廠兩廠家濾紙，發(fā)現(xiàn)杭州特種紙業(yè)有限公司濾紙中的Cl－含量明顯低于后者，故實(shí)驗(yàn)均選用杭州特種紙業(yè)有限公司所生產(chǎn)的濾紙。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

陰離子色譜法中常用的流動(dòng)相有NaOH溶液和NaHCO3－Na2CO3溶液，分別選擇2.5 mmol/L NaOH溶液、5.0 mmol/L NaOH溶液、7.5 mmol/L NaHCO3－1.1 mmol/L Na2CO3溶液為流動(dòng)相，按照“1.3”方法，進(jìn)樣方法開發(fā)溶液。結(jié)果顯示，以氫氧化鈉溶液作流動(dòng)相時(shí)，基線波動(dòng)較大，且樣品峰拖尾嚴(yán)重，峰形對(duì)稱性差;以NaHCO3－Na2CO3溶液為流動(dòng)相時(shí)基線平緩，峰形對(duì)稱性較好，故選擇NaHCO3－Na2CO3溶液作為流動(dòng)相。通過(guò)對(duì)NaHCO3－Na2CO3溶液濃度的考察，最終選擇7.5 mmol/L NaHCO3－1.1 mmol/L Na2CO3水溶液為流動(dòng)相。

以7.5 mmol/L NaHCO3－1.1 mmol/L Na2CO3水溶液為流動(dòng)相，按照“1.3”方法，分別在柱溫25，30，40℃條件下進(jìn)樣方法開發(fā)溶液。結(jié)果顯示柱溫越高，色譜峰展寬越小，峰形越好，分析時(shí)間越短，考慮到TSKgec SuperIC－Anion HS陰離子柱允許使用的最高柱溫為40℃，因此實(shí)驗(yàn)選擇柱溫為40℃。以7.5 mmol/L NaHCO3－1.1 mmol/L Na2CO3水溶液為流動(dòng)相，按照“1.3”方法，分別在流速為0.8，1.0，1.2 mL/min條件下進(jìn)樣方法開發(fā)溶液，結(jié)果顯示，流速越高，色譜峰展寬越小，峰形對(duì)稱性更佳，分析時(shí)間更短，考慮到陰離子柱的耐壓情況及保養(yǎng)維護(hù)，實(shí)驗(yàn)選擇最佳流速為1.0 mL/min。

2.3 供試樣品制備原理

采取氧瓶燃燒法使水合氯醛中的有機(jī)氯轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)氯，經(jīng)NaOH溶液吸收后以Cl－形式存在。選擇體積為500 mL的氧瓶以獲取充足的氧氣容量使樣品燃燒充分，確保有機(jī)氯能夠完全轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)氯。吸收液為20 mL 0.05 mol/L NaOH，相對(duì)樣品中轉(zhuǎn)化的痕量Cl－，該吸收液NaOH足量，以確保能夠完全吸收Cl－。

由于濾紙中不可避免會(huì)引入Cl－，因此在供試品制備時(shí)，要平行制備濾紙對(duì)照溶液，計(jì)算供試品中Cl－含量時(shí)予以扣除。

2.4 分析方法的驗(yàn)證

圖2 方法專屬性實(shí)驗(yàn)色譜圖Fig.2 Chromatograms of specificity of the method

2.4.2 線性及范圍、檢出限與定量下限 分別精密量取Cl－儲(chǔ)備液0.25，0.4，0.5，0.6，0.8 mL至5個(gè)100 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度，搖勻，配成濃度為0.025，0.04，0.05，0.06，0.08 mg/L的線性溶液。按照“1.3”方法進(jìn)樣分析，以Cl－峰面積(y)對(duì)Cl－濃度(x，mg/L)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果顯示，Cl－濃度在0.025～0.080 mg/L范圍線性關(guān)系良好，能夠滿足Cl－含量的測(cè)定要求，回歸方程為y=15.29x－0.1316，r=0.999 9。

精密量取10 mg/L的Cl－儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，按照“1.3”方法進(jìn)樣分析，以儀器信噪比(S/N)為3計(jì)算方法的檢出限，得到Cl－的檢出限為0.01 μg/L。以S/N約為10時(shí)計(jì)算方法的定量下限，得到Cl－的定量下限為0.05 μg/L，相當(dāng)于水合氯醛定量下限為0.078 μg/L。

2.4.3 重現(xiàn)性 按照“1.3”方法進(jìn)樣分析Cl－標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算Cl－色譜峰面積的RSD為1.7%，表明方法的精密度良好。按照“1.3”方法，由不同的實(shí)驗(yàn)人員，在不同的實(shí)驗(yàn)日期，進(jìn)樣分析Cl－標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算Cl－色譜峰面積的RSD為0.50%，12針樣品的RSD為1.4%，表明方法的中間精密度良好。

2.4.4 準(zhǔn)確度 按照“1.3”方法，對(duì)加標(biāo)80%供試品，加標(biāo)100%供試品，加標(biāo)120%供試品分別進(jìn)行測(cè)定，扣除樣品中由濾紙引入的Cl－量，以外標(biāo)法計(jì)算加標(biāo)回收率，得到Cl－的加標(biāo)回收率為92.9%～103.4%，RSD為6.4%(表1)，結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of recovery test

2.4.5 樣品穩(wěn)定性 按“1.2”供試品溶液加標(biāo)的配制方法，加入0.4 mL 10 mg/mL的Cl－，用水定容后，搖勻即得測(cè)試樣品。按照“1.3”方法，分別在0，1，2，4，8，12 h對(duì)測(cè)試液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示Cl－峰面積的RSD為2.8%，表明樣品在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.6 方法耐用性 按“1.2”供試品溶液加標(biāo)的配制方法，加入0.5 mL 10 mg/mL的Cl－，用水定容后，搖勻即得樣品穩(wěn)定性測(cè)試溶液。按照“1.3”方法，分別設(shè)置流速為0.8，1.0，1.2 mL/min;柱溫為38，40，42℃;緩沖液濃度為8.25 mmol/L NaHCO3－1.21 mmol/L Na2CO3、7.5 mmol/L NaHCO3－1.1 mmol/L Na2CO3、6.75 mmol/L NaHCO3－0.99 mmol/L Na2CO3;考察流速、柱溫以及鹽濃度變化時(shí)對(duì)Cl－含量測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示:柱溫、流速、緩沖液濃度在一定范圍內(nèi)變化對(duì)樣品中氯離子的分離和含量測(cè)定無(wú)明顯影響，均能達(dá)到基線分離;Cl－含量測(cè)定結(jié)果的RSD分別為5.9%，2.7%，5.0%(表2)，表明該方法的流速耐用性、柱溫耐用性以及鹽濃度耐用性均良好。

表2 耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of robustness test

(續(xù)表2)

2.4.7 樣品檢測(cè) 按照“1.3”方法，分別進(jìn)樣分析3批供試品溶液，記錄色譜圖，以外標(biāo)法計(jì)算Cl－含量。結(jié)果顯示，3批樣品中的Cl－含量均低于0.02%，折換成水合氯醛，3批樣品中的水合氯醛含量均不大于0.03%，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)格列喹酮主環(huán)物中水合氯醛含量的要求。

3 結(jié)論

該方法通過(guò)氧瓶燃燒法使格列喹酮主環(huán)物中的有機(jī)氯轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)氯離子，經(jīng)氫氧化鈉水溶液吸收后，運(yùn)用離子色譜法測(cè)定供試品溶液中的氯離子含量，從而間接測(cè)定格列喹酮主環(huán)物中水合氯醛的含量。該方法準(zhǔn)確、有效、靈敏，能夠滿足格列喹酮主環(huán)物中水合氯醛的定量檢測(cè)要求。

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