孫佳麗，劉 怡，鄭英帥，宋澤安，石紅梅

(河北醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 石家莊 050017)

磺胺脒(Sulfaguanidine，SG)為臨床上常用的短效磺胺類藥物，具廣譜抗菌作用，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌均有良好的抗菌活性，是預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病的重要藥物，常用于治療細(xì)菌性痢疾和腸炎，或用于預(yù)防腸道手術(shù)后感染等，現(xiàn)經(jīng)常作為飼料添加劑使用，是動(dòng)物源性食品獸藥殘留檢測(cè)中的常見藥物?；前奉愃幬餁埩裟芤鹑梭w中毒或過敏性反應(yīng)，并被懷疑有致癌性。作為一種重要的磺胺類藥物，磺胺脒在磺胺類藥物的使用中占有很大比例。因此，建立一種操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏的磺胺脒檢測(cè)新方法，用于飼料或食品獸藥殘留的檢測(cè)，對(duì)于動(dòng)物源性食品的安全監(jiān)測(cè)具有實(shí)際意義。

目前磺胺脒的檢測(cè)方法主要有分光光度法［1－2］、高效液相色譜法［3－4］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［5］、膠束液相色譜法［6］、伏安測(cè)定法［7］等，但這些方法操作相對(duì)復(fù)雜、分析成本較高，且達(dá)不到快速在線分析的目的。化學(xué)發(fā)光法(Chemiluminescence，CL)憑借其測(cè)定靈敏、儀器簡(jiǎn)單、操作方便、分析成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前在藥物、生物、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［8－14］。本課題組在前期工作中，首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了Ag(Ⅲ)配合物與魯米諾的化學(xué)發(fā)光體系，并已成功用于某些生物分子和藥物的測(cè)定［15－18］。

文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，有關(guān)Ni(Ⅳ)配合物－魯米諾化學(xué)發(fā)光法測(cè)定磺胺脒的研究尚未見報(bào)道。Ni(Ⅳ)配合物與Ag(Ⅲ)配合物均為超高氧化態(tài)金屬配合物，與Ag(Ⅲ)配合物相比，Ni(Ⅳ)配合物(［Ni(HIO6)2］4－，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1)的氧化性能較溫和，與魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)更穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)基于磺胺脒在堿性介質(zhì)中對(duì)Ni(Ⅳ)配合物－魯米諾(Luminol，Lu)化學(xué)發(fā)光體系的抑制作用，首次建立了流動(dòng)注射－Ni(Ⅳ)配合物－魯米諾化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定磺胺脒的新方法。該方法靈敏度高，用于飼料中磺胺脒的測(cè)定，結(jié)果滿意，方法具有一定的實(shí)際應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

圖1 ［Ni(HIO6)2］4－配合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of［Ni(HIO6)2］4－ complex

1.1 儀器及試驗(yàn)方法

儀器采用IFFM－E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司)，流路見圖2，聚四氟乙烯管(PTFE，0.8 mm i.d.)用于連接系統(tǒng)中的所有組件。實(shí)驗(yàn)選擇負(fù)高壓為700 V，Ni(Ⅳ)溶液先與魯米諾溶液經(jīng)三通管混合均勻并充分反應(yīng)，待基線穩(wěn)定后，通過進(jìn)樣閥將磺胺脒溶液注入到Ni(Ⅳ)配合物與魯米諾的混合液流中，記錄Ni(Ⅳ)配合物－Lu化學(xué)發(fā)光體系被磺胺脒抑制的信號(hào)強(qiáng)度，即相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(Ni(Ⅳ)配合物－Lu基線的CL信號(hào)強(qiáng)度減去Ni(Ⅳ)配合物－Lu－SG體系的CL信號(hào)強(qiáng)度)，以峰高定量。每次實(shí)驗(yàn)前后均用去離子水將各塑料軟管沖洗干凈。

圖2 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光流路示意圖Fig.2 Schemmatic diagram of flow injection system forCL detection

1.2 溶液配制

磺胺脒(Sigma公司)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(2.3×10－3mol/L):稱取磺胺脒標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，溶于80～90℃熱水中，以水定容至20 mL。

魯米諾(Sigma公司)儲(chǔ)備液(2.0×10－2mol/L):稱取魯米諾標(biāo)準(zhǔn)品0.886 0 g，溶于7 mL 1.0 mol/L NaOH溶液中，用水定容至250 mL。

Ni(Ⅳ)配合物按文獻(xiàn)方法［19］制備:將3 g高碘酸鉀溶于50 mL沸水中，在攪拌條件下向此溶液中加入2 g Ni(NO3)2·6H2O加熱至微沸，分次加入總計(jì)5 g的過硫酸鉀，繼續(xù)煮沸30 min，冷卻后加入50 mL 3.6 mol/L的KOH溶液，攪拌，于40～50℃反應(yīng)1 h，生成暗紅色的Ni(Ⅳ)配合物 ［Ni(HIO6)24－］。掃描發(fā)現(xiàn)該溶液有兩個(gè)吸收峰，依據(jù)配合物溶液在410 nm處的摩爾吸光系數(shù)(ε=1.06×105L·mol－1·cm－1)，計(jì)算Ni(Ⅳ)配合物儲(chǔ)備液的濃度約為2.4×10－3mol/L。配合物儲(chǔ)備液在冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)用水均為去離子蒸餾水。

1.3 樣品處理

取市售豬飼料樣品1.0 g置于10 mL塑料離心管中，加入5 mL高氯酸溶液(pH 2.0)渦流振蕩5 min，振蕩提取5 min，并超聲萃取10 min，再以6 500 r/min離心10 min后，取上清液。重復(fù)提取3次，合并提取液，用C18固相萃取柱分離富集待測(cè)飼料樣品中的磺胺脒。步驟如下:取1 mL水和1 mL甲醇依次滴加到固相萃取柱上，反復(fù)3次，將飼料提取液滴加到固相萃取柱上，用5 mL冷水淋洗，3 mL甲醇洗脫。收集樣品洗脫液，40℃下用氮?dú)獯抵两?，?0～90℃水稀釋至8 mL，過0.22 μm濾膜后，平均分為4份，1份做空白，其余3份樣品溶液中分別加入磺胺脒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液30，60，100 μL，4份溶液均稀釋定容至100 mL。

2 結(jié)果與討論

魯米諾、Ni(Ⅳ)配合物、樣品及載流的流速對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度有一定影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)液體流速為2.5 mL/min時(shí)，反應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)且穩(wěn)定，故將流速定為2.5 mL/min。

2.1 反應(yīng)介質(zhì)及其濃度的影響

2.1.1 Ni(Ⅳ)配合物溶液濃度及堿度的選擇 在魯米諾濃度為1.0×10－6mol/L(溶液堿度為0.005 mol/L)，磺胺脒濃度為2.4×10－6mol/L，Ni(Ⅳ)配合物溶液堿度為0.01 mol/L條件下，考察了Ni(Ⅳ)配合物溶液濃度在5.0×10－9～5.0×10－6mol/L范圍內(nèi)變化對(duì)該體系相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明:Ni(Ⅳ)配合物溶液濃度為4.0×10－7mol/L時(shí)，體系的發(fā)光強(qiáng)度抑制信號(hào)最大且較穩(wěn)定。故選擇Ni(Ⅳ)配合物的最佳濃度為4.0×10－7mol/L。

在0.01～0.07 mol/L范圍內(nèi)改變NaOH濃度，考察了Ni(Ⅳ)配合物溶液的堿度對(duì)該體系相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響(圖3)。結(jié)果顯示:隨著Ni(Ⅳ)配合物的堿度增加，磺胺脒對(duì)Ni(Ⅳ)配合物－Lu體系化學(xué)發(fā)光信號(hào)的抑制強(qiáng)度先升高后降低，在NaOH濃度為0.02 mol/L，即Ni(Ⅳ)配合物溶液堿度為0.02 mol/L時(shí)，發(fā)光體系抑制信號(hào)最強(qiáng)，故將Ni(Ⅳ)配合物中NaOH濃度定為0.02 mol/L。

圖3 Ni(Ⅳ)配合物溶液堿度對(duì)體系發(fā)光信號(hào)的影響Fig.3 Effect of［OH－］in Ni(Ⅳ)complex solution on CL intensity cNi(Ⅳ)complex=4.0 × 10－7mol/L;cSG=2.4×10－6mol/L;cLu=1.0×10－6mol/L(in 0.005 mol/L OH－)

2.1.2 魯米諾濃度及堿度的選擇 在0.005 mol/L OH－介質(zhì)中，考察了魯米諾濃度在1.0×10－8～1.0×10－5mol/L 范圍內(nèi)對(duì)該體系發(fā)光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，魯米諾濃度為7.0×10－8mol/L時(shí)，發(fā)光體系的信噪比最好，且抑制信號(hào)最強(qiáng)。故將魯米諾的濃度定為7.0×10－8mol/L。

考察了魯米諾溶液中NaOH的濃度在0.01～0.08 mol/L范圍內(nèi)對(duì)該化學(xué)發(fā)光體系的影響(圖4)。結(jié)果表明，當(dāng)NaOH濃度為0.05 mol/L時(shí)，化學(xué)發(fā)光的抑制強(qiáng)度最佳。

圖4 魯米諾溶液堿度對(duì)發(fā)光信號(hào)的影響Fig.4 Effect of［OH－］in luminol solution on CL intensity cNi(Ⅳ)complex=4.0 × 10－7mol/L(in 0.02 mol/L OH－);cSG=2.4×10－6mol/L;cLu=7.0 × 10－8mol/L

2.2 工作曲線、檢出限與精密度

在上述優(yōu)化條件下，對(duì)磺胺脒系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，磺胺脒在6.0×10－7～6.0×10－6mol/L濃度范圍內(nèi)與相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(ΔI)呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為ΔI=115.3×107c+3 859.2，相關(guān)系數(shù)(r)為0.994。以信噪比大于3的最小峰所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為檢出限，得到該方法的檢出限為2.4×10－10mol/L。在優(yōu)化條件下，對(duì)2.4×10－6mol/L的磺胺脒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行11次平行測(cè)定，根據(jù)峰高計(jì)算得到其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.4%。

2.3 樣品分析

在優(yōu)化條件下，將4份飼料樣品溶液按“1.3”方法處理，取1份做空白溶液測(cè)定，其余3份進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)?？瞻讟悠废♂屢簾o明顯抑制信號(hào)，表明未檢出磺胺脒。在另3份空白樣品處理液中分別加入磺胺脒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液30，60，100 μL，稀釋定容至 100 mL，制得低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，取平均值，計(jì)算得平均回收率為102.2%～104.3%，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加標(biāo)回收合理但回收率在100%以上，可能是由樣品處理液中含有對(duì)該化學(xué)發(fā)光體系同樣有抑制信號(hào)的其它極微量雜質(zhì)引起的。

表1 樣品溶液中磺胺脒的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery results of sulfaguanidine from real samples

2.4 討論

2.4.1 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理推斷 在Ni(Ⅳ)配合物與魯米諾組成的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系中，Ni(Ⅳ)配合物既可氧化魯米諾產(chǎn)生發(fā)光(基線信號(hào))，又可氧化磺胺脒，從對(duì)Ag(Ⅲ)配合物與魯米諾化學(xué)發(fā)光體系的前期研究［16］結(jié)果推斷，可能的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)機(jī)理為:Ni(Ⅳ)配合物和魯米諾及磺胺脒的反應(yīng)均為自由基反應(yīng)，且磺胺脒與Ni(Ⅳ)配合物反應(yīng)較魯米諾與Ni(Ⅳ)配合物的反應(yīng)慢，反應(yīng)過程中魯米諾產(chǎn)生的自由基部分轉(zhuǎn)移給磺胺脒，從而使魯米諾自由基減少，發(fā)光體的量減少，使得體系的發(fā)光強(qiáng)度降低，因此表現(xiàn)為信號(hào)抑制。

2.4.2 Ni(Ⅳ)配合物－魯米諾發(fā)光體系 以魯米諾為還原劑的經(jīng)典化學(xué)發(fā)光體系廣泛用于金屬離子、無機(jī)及有機(jī)物的痕量分析中。已建立的魯米諾發(fā)光體系有H2O2，K3Fe(CN)6，HIO4－Luminol等。本研究首次采用Ni(Ⅳ)配合物作氧化劑，與魯米諾組成新的化學(xué)發(fā)光體系。Ni(Ⅳ)配合物的氧化能力與其濃度、堿度在一定范圍內(nèi)成正相關(guān)。濃度過大，配合物可能聚集;堿度改變，配合物在溶液中的平衡可能改變，可使配合物的氧化能力發(fā)生變化，從而影響體系的相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。Ni(Ⅳ)配合物溶液濃度變化對(duì)體系發(fā)光強(qiáng)度的影響呈增強(qiáng)－降低－再增強(qiáng)－降低趨勢(shì)，其影響的復(fù)雜性，可能與Ni(Ⅳ)配合物在不同條件下配位平衡發(fā)生改變，從而其氧化能力發(fā)生變化有關(guān)。

3 結(jié)論

本文建立了測(cè)定磺胺脒的高靈敏Ni(Ⅳ)配合物流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析新方法，并對(duì)飼料樣品中的磺胺脒進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)化學(xué)發(fā)光可能的機(jī)理進(jìn)行了簡(jiǎn)要說明。該方法簡(jiǎn)單、靈敏、快速，具有一定的應(yīng)用前景。

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