楊冬冬，張校亮，崔彩娥，譚 慷，李曉春

(太原理工大學 物理與光電工程學院，新型傳感器與智能控制教育部與山西省重點實驗室，山西 太原 030024)

有機磷農(nóng)藥是我國使用量最大的農(nóng)藥之一，作為殺蟲劑被廣泛應用于蔬菜和水果中。農(nóng)藥的過度使用會導致殘留農(nóng)藥不能徹底降解，最終進入人體內。有機磷農(nóng)藥會抑制人體內膽堿酯酶的活性，導致膽堿的大量積累并頻繁刺激神經(jīng)系統(tǒng)，從而對人體神經(jīng)系統(tǒng)造成損害。我國衛(wèi)生部、農(nóng)業(yè)部于2012年發(fā)布了GB2763－2012《食品安全國家標準、食品中最大農(nóng)藥殘留限量》［1］，對食品中有機磷農(nóng)藥的最大殘留量做出了明確規(guī)定。因此有必要開發(fā)一種有效便捷的有機磷農(nóng)殘檢測方法來保障食品安全。

有機磷農(nóng)殘的檢測方法有氣相色譜法(GC)［2］、高效液相色譜法(HPLC)［3］、氣相色譜－串聯(lián)質譜法(GC－MS)［4］、液相色譜－串聯(lián)質譜法(LC－MS)［5］和QuEChERS提取與超高效液相色譜－電噴霧電離串聯(lián)質譜聯(lián)用法［6］等。這些方法具有適用范圍廣、分離效能高、準確、靈敏、重復性好、選擇性強等優(yōu)點，但存在儀器設備昂貴、操作復雜、耗時長等不足，因此難以滿足農(nóng)殘現(xiàn)場快速檢測的要求。Ellman等［7］根據(jù)有機磷農(nóng)藥對酶的抑制作用提出了有機磷農(nóng)藥的酶抑制檢測法?；诒壬治龅挠袡C磷農(nóng)殘的酶抑制檢測方法是近幾年發(fā)展起來的一種分析方法［8］，與傳統(tǒng)色譜法和光譜法相比，基于比色法分析農(nóng)殘更加直觀，普通用戶可以通過肉眼觀察反應溶液的顏色進行定性判斷，或者通過對數(shù)字圖片檢測區(qū)域色度的分析實現(xiàn)定量檢測。

近年來，隨著智能手機的廣泛普及以及其功能的不斷強大，基于智能手機的數(shù)字圖片比色分析(Digital image colorimetric，DIC)作為一種新型、快速的定量檢測方法被研究者所重視［9－11］。用手機采集圖片時由于光照條件不同，會對成像質量產(chǎn)生很大的影響，最終將直接影響待檢物的定量檢測。為了解決這一問題，研究者們著手從軟件算法和特殊光源光路上進行改進。Shen等［12］在分析數(shù)字圖片時通過映射算法將不同光強環(huán)境(熒光3 500 K，日光，陰影，手機閃光燈)下所得的顏色色度值轉化為定值光強(熒光5 000 K)下的色度值，實現(xiàn)了不同光照強度下顏色的統(tǒng)一;隨后，Hong等［13］分別將熒光、日光以及低照度光強等不同光強下采集到的圖片經(jīng)過顏色校正算法轉換為顏色相同的圖片進行比色分析。Garcia等［14］在檢測水溶液中鉀離子時采用了一個封閉裝置，并使用3個對稱放置的LED燈珠作為光源;Suzuki等［15］在檢測水中余氯時采用LED陣列作為光源。在封閉裝置中檢測和使用LED陣列光源均在一定程度上控制了環(huán)境光照的影響。但是，當光源的放置位置不合適時，采集的照片會有陰影出現(xiàn)，這將很大程度地影響檢測結果。2013年，Bang－iam等［16］在檢測天然乳膠和醫(yī)用乳膠中的蛋白質時通過實驗證明:只用一個LED燈珠不能采集到完美的圖片，而放置兩個與樣品成45°的LED燈則能采集到理想的圖片。

綜上所述，在基于智能手機的數(shù)字圖片比色法的應用中，環(huán)境光照的條件將直接影響檢測結果的準確性。由于LED面光源具有較好的光線平行度，將其置于樣品上方時，手機能采集到無陰影的圖片。更為重要的是，在圖片采集過程中，較大的光源面積可以實現(xiàn)樣品區(qū)域的均勻照明，因此無需將光源放置在特定角度的位置。鑒于此，本文采用LED“面光源”作為照明光源，以智能手機作為圖片采集工具，從而實現(xiàn)了有機磷農(nóng)殘的快速、定量檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

馬拉硫磷標準液(100 μg/mL，溶于丙酮)購于國家標準物質中心，使用前置于藥品保存箱(4℃)中保存。有機磷農(nóng)殘檢測試劑盒(石家莊諾威亞生物試劑有限公司)包括:乙酰膽堿酯酶、硫代乙酰膽堿、顯色劑(二硫代雙硝基苯甲酸)、磷酸鹽緩沖液，干粉狀態(tài)下的試劑使用前置于低溫冰箱(－20℃)中保存，配成溶液后置于藥品保存箱(4℃)中保存。實驗用的黃色墨水為愛普生噴墨打印機(R270系列)原供黃色墨水。供試蘋果購于當?shù)爻小?/p>

LED面光源(18 cm×18 cm，12 W，佛山飛力照明科技有限公司)，智能手機(Coolpad8736，Mi2，Samsungi9300)，UV－3100PC紫外可見分光光度計(上海美普達科技有限公司)，SK－1快速混勻器(金陵市科析儀器有限公司)，Pipet－LiteXLS手動單道移液槍(美國梅特勒托利多公司)，HC－2518高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)，石英比色皿(宜興市和橋科化儀器廠)，超純水儀(Gen-Pure UV－TOC/UF with Dispenser，美國賽默飛世爾科技公司)。

1.2 樣品的制備

由于實驗最終產(chǎn)物呈黃色，故選擇黃色墨水作為前期優(yōu)化條件所用樣品。配制4 000 μL黃色墨水樣品，其中墨水的體積分別為0，200，400，600，800，1 000，1 200，1 400，1 600，1 800 μL，用水稀釋至4 000 μL。經(jīng)稀釋后墨水的體積分數(shù)(墨水體積與總體積之比)分別為0%，5%，10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%，45%。10個樣品置于離心管中，并取1 000 μL樣品置于比色皿供手機拍照以及顏色分析。

將丙酮中的馬拉硫磷標準液用水分別稀釋至 0，0.05，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg/mL，各取500 μL置于離心管中。取乙酰膽堿酯酶、顯色劑各25 μL加至上述馬拉硫磷標準液中，在37℃恒溫箱中溫育30 min后，加入25 μL硫代乙酰膽堿制成馬拉硫磷檢測液，取575 μL檢測溶液至比色皿中，待反應進行15 min后，使用手機采集圖片并進行顏色分析。

將用于樣品測試的蘋果等分為5份，用水清洗干凈后置于通風處晾干，分別在每塊蘋果表皮噴灑濃度為0，10，20，30，40 μg/mL的馬拉硫磷溶液。3 h后，分別削取2 mg蘋果表皮置于樣品瓶中，各加入10 mL磷酸鹽緩沖液后用快速混勻器混勻10 min，取上清液500 μL于離心管中，10 000 r/min離心10 min，待用。

1.3 DIC圖片采集裝置及顏色處理

如圖1A所示，LED面光源作為手機數(shù)字圖片采集時的照明裝置，置于比色皿正上方，智能手機置于樣品正前方進行圖片采集，整個裝置置于暗室環(huán)境中，圖片保存格式為.Jpeg格式。采集到的圖片經(jīng)分析軟件(Adobe Photoshop CS6.0)讀取 Y值。Y值是指在CMYK(Cyan，Magenta，Yellow，Black)顏色模型中用來表示圖片所含黃色成分的百分比(范圍為0%～100%)。其中，圖片黃色越深，Y值越大，反之Y值越小，具體讀取方法如圖1B所示。

2 結果與討論

2.1 檢測原理及光譜特性

酶抑制法檢測馬拉硫磷的原理［7］見圖2，硫代乙酰膽堿(ATCh)在乙酰膽堿酯酶(AChE)的作用下水解，水解產(chǎn)物硫代膽堿在顯色劑二硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)作用下產(chǎn)生黃色物質5-硫代2-硝基苯甲酸(TNB)，當反應溶液中存在有機磷農(nóng)藥時，乙酰膽堿酯酶的活性被抑制，水解產(chǎn)物硫代膽堿變少，最終導致黃色物質TNB的量變少，檢測液的黃色變淺。為了進一步研究有機磷農(nóng)殘抑制酶的原理，考察了反應溶液的紫外－可見吸收光譜特性。反應溶液中加入底物之后立即進行吸收光譜測量。此后，每隔10 min測1次溶液的吸收光譜，結果如圖3所示。

圖1 DIC圖片采集裝置(A)與Y值讀取窗口(B)Fig.1 Schematic diagram of DIC device(A)and the window for Y value reading(B)

圖2 馬拉硫磷酶抑制法的檢測原理Fig.2 Principle of malathion detection based on enzyme inhibition method

圖3 每隔10 min測得的反應溶液的光譜特性Fig.3 UV－Vis spectra of the detecting solution obtained for every 10 min

由圖3A可知，在未加馬拉硫磷的條件下，吸收光譜在250～550 nm范圍內有兩個明顯的吸收峰。且隨著時間的推移，320 nm處的吸光度逐漸下降，而412 nm處的吸光度逐漸增加，直至反應進行約1 h后，吸光度達到飽和。值得注意的是，412 nm處的吸收峰為反應的最終黃色產(chǎn)物TNB的吸收峰，隨著其含量的增加，412 nm處的吸光度逐漸增加，約1 h后達到飽和。圖3B為加入8 μg/mL馬拉硫磷后溶液的光譜特性，與圖3A相比，兩個吸收峰的位置未發(fā)生移動，但達到飽和的時間增加到2 h。說明馬拉硫磷抑制了酶的活性，進而降低了反應速度。

2.2 DIC圖片采集裝置測試

為考察所用LED面光源在圖片采集裝置中的可靠性，使用Coolpad8736智能手機對10個體積分數(shù)均為15%的黃色墨水(編號1～10)在自然光和LED面光源下分別進行圖片采集，并做結果分析(如圖4)。由圖4A可見，自然光照下所采集到的圖片有很嚴重的陰影，而LED面光源照明下所采集到的圖片亮度均勻無陰影，圖片質量有明顯提高。進一步對這10個樣品分別進行顏色均勻程度分析，結果如圖4 B～C所示。由圖看出，自然光下由于背景很大，采集到的圖片Y值整體偏高，并且每個位置處樣品的顏色誤差較大。相比之下，采用LED作為照明光源，采集到的圖片顏色誤差很小。這充分說明在自然光下采集到的圖片顏色不均勻而導致顏色誤差增大。

圖4 自然光(上)和LED面光源(下)采集的黃色墨水圖片(A)，以及10個樣品的Y值分析結果(B)與Y值的標準偏差(C)Fig.4 The yellow ink images obtained under ambient(upon)and LED source(down)(A)，Y value(B)and standard deviation of Y value(C)of ten samples with same content of ink

在自然光和LED面光源的照明條件下，采集了體積分數(shù)為0%～45%的10個黃色墨水樣品圖片，并進行了顏色分析，如圖5所示。由圖可知，在LED面光源的照明條件下，所采集到的圖片質量有了大幅增加，且LED面光源下墨水含量在0%～45%范圍內均保持良好的線性關系，而自然光下墨水含量僅在0%～25%范圍內與Y值的線性關系很好，且由于自然光下背景較大，使得墨水含量大于30%即達到飽和，導致較高濃度的墨水含量不能區(qū)分。實驗結果表明，LED面光源相較于自然光在數(shù)據(jù)分析上有很大的優(yōu)勢，能大幅提高檢測的靈敏度。

圖5 自然光(上)和LED面光源(下)采集的不同含量黃色墨水圖片(A)，以及黃色墨水含量與Y值的關系(B)Fig.5 The yellow ink images obtained under ambient(upon)and LED source(down)(A)and relationship between Vink/Vtotaland Y value(B)

2.3 不同品牌智能手機對圖片采集的影響研究

為了驗證不同品牌的智能手機在比色分析中的普適性，以黃色墨水為實驗樣品，在LED面光源照明下分別以Huawei，Coolpad，Samsung 3款智能手機(參數(shù)見表1)為圖片采集工具，對體積分數(shù)為0%～40%的黃色墨水進行圖片采集，并進行色度值分析。實驗結果顯示，3款智能手機所采集到的圖片略有差異。圖片的色度值分析結果顯示，3款手機所測得的Y值分布趨勢完全相同，只是Y值大小略有差別，Samsung分析的Y值最大，其次是Coolpad，Huawei分析的Y值最小(圖6)。從表1可以看到，3款智能手機的F數(shù)值各不相同，從小到大依次是 Huawei，Coolpad，Samsung。表明F數(shù)值越小，進光量越多，則獲得的畫面更亮;而F數(shù)值越大，進光量越少，則畫面較暗，因此Y值略有差異。

表1 3款智能手機的參數(shù)及其設置Table 1 Parameters and setting of the three different bands smartphones

2.4 基于數(shù)字圖片比色分析的馬拉硫磷檢測

以Coolpad8736智能手機為圖片采集工具，對馬拉硫磷進行檢測。實驗中，加入底物搖勻溶液后用移液槍將顯色后8個濃度(0～10.0 μg/mL)的馬拉硫磷檢測液轉移到比色皿中，反應15 min后，在LED面光源照射下進行圖片采集，同時作為對比，測量了待檢溶液反應15 min后在412 nm處的吸光度值，分析結果如圖7所示。從圖7A可以看到，隨著馬拉硫磷濃度的增加其Y值逐漸減小最終趨于飽和。吸光度值與馬拉硫磷濃度的關系如圖7B所示，隨著馬拉硫磷濃度的增加，溶液的吸光度值逐漸減少，直至飽和。將比色法所得結果與光譜分析法所得結果進行對比(如圖7C)，兩種方法的相關系數(shù)達到0.995 1，充分證明了本方法的可行性與準確性。

圖6 黃色墨水體積比與3款智能手機采集黃色墨水圖片Y值的關系Fig.6 Relationship between Vink/Vtotaland Y value by analyzing yellow ink images captured by three smartphones of different bands

圖7 馬拉硫磷標準品濃度與Y值的關系曲線Fig.7 Relationship between malathion concentration and Y value

2.5 未知樣品的檢測以及與傳統(tǒng)紫外－可見分光光度法的結果對比

為了驗證本方法在實際樣品檢測中的可靠性與準確性，以噴灑0，10，20，30，40 μg/mL 5個濃度的馬拉硫磷溶液的蘋果表皮作為待檢樣品。分別采用比色法與光譜分析法對樣品進行定量檢測(如圖8)。由圖可知，噴灑較高濃度馬拉硫磷(10～40 μg/mL)的樣品檢測結果約為3.4～8.5 μg/mL，與UV－Vis分光光度計的結果一致。

3 結論

本文研究了基于智能手機數(shù)字圖片比色法的有機磷農(nóng)殘速測技術，使用LED面光源作為圖片采集光源，解決了自然光照下圖片失真、背景大等問題，同時也彌補了LED點光源由于角度放置不合適而引起的圖片失真問題。本方法具有普適性，不同的智能手機不會對檢測結果產(chǎn)生影響。與傳統(tǒng)的檢測手段相比，本方法具有易操作、速度快、成本低等優(yōu)勢。在本方法的基礎上，有望通過集成化研制出便攜式測試盒，同時應用手機APP進行比色分析，以實現(xiàn)有機磷農(nóng)殘的實時、在線定量檢測。

圖8 DIC與紫外－可見分光光度計對樣品檢測的結果Fig.8 Detecion results for sample with DIC and UV－Vis spectrometry

［1］GB 2763 －2012．The Maximum Residue Limits of Pesticide in Food．National Standards of the People’s Republic of China(食品中農(nóng)藥最大殘留限量．中華人民共和國國家標準)．

［2］Li X J，Chen A，Huang C，Shi J，Yu H．J.Instrum.Anal．(李曉晶，陳安，黃聰，施潔，于鴻．分析測試學報)，2011，30(3):326－329．

［3］Xuan Q J，Zhou C G，Xu H Z，Wang Y J，Lin Z S，Yao Z W，Lü J C．Chin.J.Anal.Lab．(宣秋江，周傳光，徐恒振，王艷潔，林忠勝，姚子偉，呂景才．分析試驗室)，2008，27:273－275．

［4］Du X T，Zhou M，Zhang J，Zeng Y B，Zhai Y Y，Li L．J.Instrum.Anal．(杜曉婷，周敏，張劍，曾延波，翟云云，李蕾．分析測試學報)，2010，29(7):751－754．

［5］Liu Q，Sun L，Zhang L．J.Instrum.Anal．(劉琪，孫雷，張驪．分析測試學報)，2010，29(7):747－750．

［6］Xu J，Chen J，Wang L，Sun L H，Yuan Z Y，Ye H Y，Zhu L．J.Instrum.Anal．(徐娟，陳捷，王嵐，孫靈慧，袁震宇，葉弘毅，朱林．分析測試學報)，2013，32(3):293－301．

［7］Ellman G L，Courtney D K，Jr Anerds V，F(xiàn)eatherstone R M．Biochem.Pharmacol．，1961，7(4):88 －95．

［8］Liang M M，F(xiàn)an K L，Pan Y，Jiang H，Wang F，Yang D L，Lu D，F(xiàn)eng J，Zhao J J，Yang L，Yan X Y．Anal.Chem．，2013，85(1):308－312．

［9］Sumriddetchkajorn S，Chaitavon K，Intaravanne Y．Sens.Actuators B，2013，182:592 －597．

［10］Apilux A，Siangproh W，Praphairaksit N，Chailapakul O．Talanta，2012，97:388－394．

［11］Martinez A W，Phillips S T，Carrilho E，Thomas III S S，Sindi H，Whitesides G M．Anal.Chem．，2008，80(10):3699－3707．

［12］Shen L，Hagen J A，Papautsky I．Lab Chip，2012，12(21):4240 －4243．

［13］Hong J I，Chang B Y．Lab Chip，2014，14(10):1725 －1732．

［14］Garcia A，Erenas M M，Marinetto E D，Abad C A，Orbe－ Paya I，Palma A J，Capitán －Vallvey L F．Sens.Actuators B，2011，156(1):350－359．

［15］Suzuki Y，Endo M，Jin J Y，Iwase K，Iwatsuki M．Anal.Sci．，2006，22:411－414．

［16］Bang－iam N，Udnan Y，Masawat P．Microchem.J．，2013，106:270－275．