唐應(yīng)華， 陸吉虎， 吳培培， 查國(guó)飛，4， 劉振興，2， 陳 輝， 侯繼波

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210095;3.南京天邦生物科技有限公司，江蘇 南京211102;4.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥230036)

H5 和H9 亞型禽流感滅活油乳劑疫苗在中國(guó)禽流感防控中發(fā)揮了重大作用，但現(xiàn)有疫苗質(zhì)量有待進(jìn)一步提高，如加速抗體產(chǎn)生、延長(zhǎng)免疫持續(xù)期等。在臨床生產(chǎn)中，種禽或蛋禽的生產(chǎn)周期內(nèi)，需要多次免疫，每增加一次免疫均對(duì)動(dòng)物帶來(lái)較大應(yīng)激，影響生產(chǎn)性能，同時(shí)也增加人力成本，臨床生產(chǎn)中亟需一種佐劑能有效延長(zhǎng)疫苗免疫持續(xù)期。

免疫增強(qiáng)劑與疫苗共同使用，具有較好的協(xié)同效應(yīng)，可以提高疫苗抗原的免疫效力，延緩抗原的釋放等。人用流感疫苗免疫增強(qiáng)劑MF59 已經(jīng)在歐洲應(yīng)用多年［1］，美國(guó)FDA 也已批準(zhǔn)［2］。葛蘭素史克公司的人流感疫苗使用AS03 佐劑［3］;Intervet 的豬圓環(huán)病毒疫苗和繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗均使用Diluvac Forte 佐劑［4-5］;Boehringer 的豬圓環(huán)病毒疫苗使用Ingelvac CircoFLEX 佐劑［6］;Pfizer 的豬圓環(huán)病毒疫苗使用Suvaxyn 佐劑［7］;豬支原體疫苗、偽狂犬疫苗和細(xì)小病毒疫苗等使用Amphigen 佐劑［8］;Seppic 公司的口蹄疫疫苗使用ISA206 佐劑，新城疫疫苗使用ISA70 佐劑［9-10］。

本研究中，我們將篩選的免疫增強(qiáng)劑以不同形式添加至疫苗中，評(píng)價(jià)免疫增強(qiáng)劑對(duì)疫苗免疫持續(xù)期和安全性以及對(duì)免疫雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料和方法

1.1 病毒、疫苗和檢測(cè)抗原

H5 亞型禽流感商品疫苗和H5 檢測(cè)抗原，均購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。H9 亞型禽流感疫苗由本實(shí)驗(yàn)室制備，疫苗毒株和檢測(cè)用抗原均為A/Chicken/Nanjing/02/2001(H9N2，簡(jiǎn)稱NJ02)。

1.2 雞

1 日齡商品海蘭褐雞購(gòu)自海安通榆種雞場(chǎng)，在普通環(huán)境飼養(yǎng)至使用，檢測(cè)針對(duì)H5 或H9 亞型禽流感母源抗體，僅抗體低于2lg2 時(shí)用于免疫。無(wú)特定病原體(Specific pathogen free，SPF)雞購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，養(yǎng)在負(fù)壓隔離器內(nèi)，直至使用。

1.3 含免疫增強(qiáng)劑疫苗的配制

含VA5 免疫增強(qiáng)劑疫苗的配制詳見(jiàn)專利(申請(qǐng)?zhí)?01210235427.0)。增強(qiáng)劑的使用形式有2 種，一種以疫苗伴侶形式使用:將免疫增強(qiáng)劑配制成油乳劑疫苗伴侶，使用時(shí)將該疫苗伴侶與H5 常規(guī)疫苗按體積比為1∶ 9 混合，即為含VA5 免疫增強(qiáng)劑的伴侶疫苗(VA5-H5);另一種是免疫增強(qiáng)劑與H9 疫苗抗原共同混勻形式使用:將免疫增強(qiáng)劑直接添加至抗原溶液中混勻后，制備水相，再與事先制備的油相混勻，制備含免疫增強(qiáng)劑的H9 疫苗(VA5-H9)。

1.4 免疫持續(xù)期

選擇10 日齡海蘭褐蛋雞，共設(shè)4 個(gè)免疫組，包括VA5-H5 伴侶疫苗免疫組和H5 常規(guī)疫苗免疫組(H5);VA5-H9 共混疫苗免疫組和H9 常規(guī)疫苗免疫組。海蘭褐蛋雞均經(jīng)頸背部皮下免疫，每只雞注射0.3 ml。另設(shè)空白對(duì)照組。免疫和空白組每組各20 只雞。在免疫后第2 周、第3 周、第4 周以及后續(xù)每隔2 周采血，其中VA5-H5 和H5 疫苗免疫組檢測(cè)至免疫后26 周，而VA5-H9 和H9 疫苗免疫組檢測(cè)至免疫后30 周。分離血清檢測(cè)血凝抑制抗體效價(jià)(HI)。根據(jù)H5 疫苗制造規(guī)程，設(shè)定HI高于或等于7lg2 為合格抗體效價(jià)，低于7lg2 為不合格抗體效價(jià)。對(duì)于H9 疫苗，設(shè)定HI高于或等于6lg2 為合格抗體效價(jià)，低于6lg2 為不合格抗體效價(jià)。

1.5 含免疫增強(qiáng)劑疫苗的安全性檢測(cè)

1.5.1 單劑量接種安全性 2 批次含免疫增強(qiáng)劑的疫苗(VA5-H9)和常規(guī)疫苗(H9)單劑量各免10只雞，共3 組，每只雞經(jīng)頸部皮下注射疫苗0.3 ml。另設(shè)不免疫的空白對(duì)照組10 只雞。

1.5.2 雙倍劑量接種安全性 2 批次含免疫增強(qiáng)劑的疫苗(VA5-H9)和常規(guī)疫苗(H9)雙倍劑量各免10 只雞，共3 組，每只雞經(jīng)頸部皮下分兩點(diǎn)注射疫苗0.6 ml。另設(shè)不免疫空白對(duì)照組10 只雞。

1.5.3 單劑量重復(fù)接種安全性 2 批次含免疫增強(qiáng)劑的疫苗(VA5-H9)和常規(guī)疫苗(H9)單劑量各免10只雞，共3 組，每只雞經(jīng)頸部皮下注射疫苗0.3 ml。第1 次接種后2 周，按第一次接種方法再次接種，每只雞頸部皮下注射0.3 ml。另設(shè)不免疫空白對(duì)照組10 只雞。上述接種雞在最后一次注射疫苗后，均觀察14 d，詳細(xì)記錄采食飲水等情況。觀察期結(jié)束后，撲殺5 只，觀察注射部位的疫苗吸收情況。再過(guò)14 d后將剩下的5 只撲殺，觀察疫苗吸收情況。

1.6 雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化

VA5-H9 疫苗和H9 疫苗分別免疫14 日齡無(wú)特定病原體SPF 雞，另設(shè)空白對(duì)照，每組10 只SPF 雞。在免疫后第1 d、3 d、5 d、7 d、10 d 放血處死各組2只雞，無(wú)菌分離免疫雞的脾臟淋巴細(xì)胞，于96 孔板每孔加100 μl 1 ml 1 ×106的淋巴細(xì)胞，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，于37 ℃孵育4 h 后，加入25 μg/ml的PHA 刺激培養(yǎng)68 h 后，每孔加入15 μl 濃度為5 mg/ml的MTT，孵育6 ～8 h 后加入50 μl DMSO，于分光光度計(jì)上讀數(shù)，檢測(cè)OD570值。按每3 個(gè)重復(fù)樣品的平均值計(jì)算刺激指數(shù)，即疫苗免疫組OD570均值/空白對(duì)照組OD570均值。刺激指數(shù)與免疫效力呈正相關(guān)性，即刺激指數(shù)值越高表示免疫效力越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加VA5 免疫增強(qiáng)劑的H9 疫苗的免疫持續(xù)期

將免疫增強(qiáng)劑VA5 與H9 抗原共同混勻后，制備疫苗免疫雞，持續(xù)監(jiān)測(cè)抗體效價(jià)。含免疫增強(qiáng)劑疫苗免疫后至第6 周一直處于抗體上升期，直至第30 周抗體效價(jià)下降至6lg2 以下，常規(guī)H9 疫苗免疫組抗體類似于含免疫增強(qiáng)劑組，抗體上升至第6 周達(dá)到高峰，抗體效價(jià)在第22 周低于6lg2。對(duì)照組母源抗體一直低于2lg2。含免疫增強(qiáng)劑H9 免疫組抗體水平一直高于常規(guī)H9 疫苗免疫組，且在18 周之前一直高于1.8lg2 以上(圖1)。以疫苗規(guī)程要求的6lg2 作為合格抗體界限，添加免疫增強(qiáng)劑的H9疫苗比常規(guī)H9 疫苗能延長(zhǎng)抗體持續(xù)期4 周。

2.2 添加VA5 免疫增強(qiáng)劑的H5 疫苗的免疫持續(xù)期

將免疫增強(qiáng)劑VA5 制備成油乳劑疫苗伴侶，再與H5 商品疫苗共同混勻后免疫雞，持續(xù)監(jiān)測(cè)抗體效價(jià)。含免疫增強(qiáng)劑疫苗免疫后，第2 周抗體達(dá)到7lg2，在第3 周達(dá)到高峰，一直維持至第12 周，之后逐漸下降，在第24 周抗體效價(jià)低于7lg2;常規(guī)疫苗在免疫后第2 周抗體僅為4.25lg2，在第3 周至第10周維持較高抗體水平，之后逐漸下降，在第20 周抗體效價(jià)低于7lg2;空白對(duì)照組一直未檢測(cè)出抗體(圖2)。與常規(guī)H5 疫苗相比，含免疫增強(qiáng)劑VA5-H5疫苗免疫后，合格抗體產(chǎn)生提前1 周，即縮短窗口保護(hù)期1 周;在免疫后14 周前，VA5-H5 組抗體效價(jià)高于常規(guī)H5 疫苗2lg2 以上;常規(guī)疫苗在免疫后第20周降至7lg2 以下，而VA5-H5 疫苗免疫組至第24 周降至7lg2 以下，即VA5-H5 延長(zhǎng)抗體持續(xù)期4 周。

圖1 H9 疫苗免疫后抗體持續(xù)期Fig.1 Duration of immunity provided by H9 vaccine

圖2 H5 疫苗免疫后抗體持續(xù)期Fig.2 Duration of immunity provided by H5 vaccine

2.3 添加免疫增強(qiáng)劑的疫苗安全性

2 批次含免疫增強(qiáng)劑疫苗經(jīng)單劑量接種雞，或兩倍超劑量接種雞，或經(jīng)間隔2 周單劑量重復(fù)接種雞，在最后一次接種后撲殺，肉眼觀察疫苗吸收情況。

2.3.1 單劑量免疫試驗(yàn) 在免疫后第14 d，各組撲殺5 只雞，檢查疫苗吸收情況。其中VA5-H9 疫苗第一批次、第二批次組和常規(guī)H9 疫苗組均有2 只雞在頸部皮下免疫處有淡黃色類脂肪粒，常規(guī)疫苗組另有1 只有乳白色顆粒和彌散性淡黃色類脂肪粒。各組其余剖檢雞均正常。在第28 d 剖檢時(shí)，VA5-H9 疫苗第一批次免疫組有1 只雞、第二批次免疫組有3 只雞，常規(guī)疫苗組有2 只雞有淡黃色類脂肪粒，各組其余剖檢雞均正常。非免疫的空白對(duì)照組在第14 d 和第28 d 均正常。3 組雞在免疫后的觀察期內(nèi)均健康，飲食正常。

2.3.2 超劑量免疫試驗(yàn) 在免疫后第14 d，VA5-H9 疫苗第一批次組和常規(guī)疫苗組5 只雞均在頸部皮下免疫處有淡黃色類脂肪粒;VA5-H9 疫苗第二批次組2 只雞在頸部皮下免疫處有淡黃色類脂肪粒，另3 只雞均正常。在第28 d 剖檢時(shí)，VA5-H9 疫苗第一批次和第二批免疫組均有2 只雞以及常規(guī)疫苗組5 只雞均有淡黃色類脂肪粒，其余剖檢雞均正常。非免疫的空白對(duì)照組在第14 d 和第28 d 均正常。3 組雞在免疫后的觀察期內(nèi)均健康，飲食正常。

2.3.3 單劑量重復(fù)免疫試驗(yàn) 在二免后第14 d，VA5-H9 疫苗第一批次免疫組3 只雞有乳白色顆粒，2 只雞有乳白色顆粒和黃色類脂肪混合顆粒。VA5-H9 疫苗第二批次免疫組中1 只雞有乳白色顆粒，4 只雞有淡黃色類脂肪顆粒。常規(guī)疫苗組的2只雞有乳白色顆粒，3 只雞有乳白色和淡黃色類脂肪混合顆粒。在二免后第28 d，VA5-H9 疫苗第一批次免疫組和常規(guī)疫苗組，均有2 只雞在免疫部位有淡黃色類脂肪樣顆粒，另3 只正常。而VA5-H9疫苗第二批次免疫組，1 只雞有白色顆粒狀未吸收完全的疫苗，另1 只有淡黃色脂肪樣顆粒，剩余3 只雞均正常。不免疫的空白對(duì)照組均正常。3 組雞在免疫后的觀察期內(nèi)均健康，飲食正常。

根據(jù)各組在免疫后不同時(shí)期的疫苗吸收情況比較可以得知，含免疫增強(qiáng)劑的2 批次疫苗，與常規(guī)疫苗的吸收情況較類似，無(wú)明顯延后。該結(jié)果提示，將免疫增強(qiáng)劑添加至疫苗中，并不影響機(jī)體對(duì)疫苗的吸收。

2.4 VA5 免疫增強(qiáng)劑對(duì)免疫雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響

各疫苗免疫組雞的淋巴細(xì)胞在免疫后，刺激指數(shù)逐漸升高，即淋轉(zhuǎn)活性逐漸上升，且含VA5 免疫增強(qiáng)劑劑的滅活疫苗組的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性高于常規(guī)疫苗組，特別在第5 d 以后更加明顯(圖3)。根據(jù)刺激指數(shù)與免疫效力的正相關(guān)性可以得知，免疫增強(qiáng)劑提高免疫雞的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性，即含免疫增強(qiáng)劑疫苗能提高機(jī)體對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答。這與抗體檢測(cè)結(jié)果中含免疫增強(qiáng)劑的疫苗抗體效價(jià)高一致。

圖3 添加VA5 免疫增強(qiáng)劑的疫苗免疫雞后的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化Fig.3 The lymphocyte transformation of chicken inoculated with VA5-contained vaccine

綜上所述，本研究獲得的免疫增強(qiáng)劑，無(wú)論以添加至抗原中混合使用的形式或以疫苗伴侶的形式使用，均能有效提高雞對(duì)禽流感疫苗的抗體效價(jià)和免疫持續(xù)期。安全性研究表明，該免疫增強(qiáng)劑不影響雞體對(duì)疫苗的吸收。

［1］ KHURANA S，CHEARWAE W，CASTELLINO F，et al.Vaccines with MF59 adjuvant expand the antibody repertoire to target protective sites of pandemic avian H5N1 influenza virus［J］.Sci Transl Med，2010，2(15):15.

［2］ REYNALES H，ASTUDILLO P，DE VALLIERE S，et al.A prospective observational safety study on MF59 ? adjuvanted cell culture-derived vaccine，Celtura ? during the A/H1N1 (2009)influenza pandemic［J］.Vaccine，2012，30(45):6436-6443.

［3］ PULESTON R，BUGG G，HOSCHLER K，et al.Multi-centre observational study of transplacental transmission of influenza antibodies following vaccination with AS03(A)-adjuvanted H1N1 2009 vaccine［J］.PLoS One，2013，8(1):e47448.

［4］ BROERS P，VISSER N，EGGER W.Field study for reduction of spread of Aujeszky’s disease virus in finishing pigs with different vaccination regimes［J］.Acta Vet Hung，1994，42(2-3):397-403.

［5］ MARTELLI P，F(xiàn)ERRARI L，MORGANTI M，et al.One dose of a porcine circovirus 2 subunit vaccine induces humoral and cellmediated immunity and protects against porcine circovirus-associated disease under field conditions［J］.Vet Microbiol，2011，149(3-4):339-351.

［6］ WEIBEL H，SYDLER T，BRUGNERA E，et al.Efficacy of simultaneous vaccination with Enterisol? Ileitis and Ingelvac? CircoFLEXTM in a Swiss breeding farm［J］.Schweiz Arch Tierheilkd，2012，154(10):445-450.

［7］ OPRIESSNIG T，PATTERSON A R，ELSENER J，et al.Influence of maternal antibodies on efficacy of porcine circovirus type 2(PCV2)vaccination to protect pigs from experimental infection with PCV2［J］.Clin Vaccine Immunol，2008，15(3):397-401.

［8］ WILLSON P J，ROSSI-CAMPOS A，POTTER A A.Tissue reaction and immunity in swine immunized withActinobacillus pleuropneumoniaevaccines［J］.Can J Vet Res，1995，59(4):299-305.

［9］ DUPUIS L，ASCARATEIL S，AUCOUTURIER J，et al.SEPPIC vaccine adjuvants for poultry［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，2006，1081:202-205.

［10］ BARNETT P V，PULLEN L，WILLIAMS L，et al.International bank for foot-and-mouth disease vaccine:assessment of Montanide ISA 25 and ISA 206，two commercially available oil adjuvants［J］.Vaccine，1996，14(13):1187-1198.