呂偉麗， 馬小軍，2， 張小麗， 張國華

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070;2.甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室，甘肅 蘭州730070)

哺乳動物免疫系統(tǒng)包括固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)?？乖禺愋訲 和B 細胞介導(dǎo)的獲得性免疫性反應(yīng)只存在于脊椎動物，然而先天免疫普遍存在于脊椎動物和無脊椎動物［1］。同獲得性免疫應(yīng)答相比，固有免疫應(yīng)答過程在病原體入侵后能迅速被激活，形成防御病原體入侵的第一道防線，同時也是獲得性免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)。固有免疫是通過特殊的模式識別受體(PRRs)感知病原體相關(guān)的分子模式(PAMPs)來識別入侵的病原體，從而清除病原微生物的。Toll 樣受體家族(TLRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非常重要的PRPs，在固有免疫中感知病原體PAMPs，識別病原微生物，通過刺激信號的級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)炎癥因子和細胞因子產(chǎn)生，在抗感染中起重要作用［2-3］，相關(guān)的基因也在植物中被發(fā)現(xiàn)［4］。

近年來關(guān)于人和鼠的TLRs 生物學(xué)特點及其在天然免疫中的作用研究已經(jīng)取得了很大的進展，TLRs 在動物感染性疾病中的作用也日益受到關(guān)注，TLRs基因多態(tài)性與人和動物疾病的相關(guān)性已成為研究的熱點。Toll 樣受體4 (TLR4)是TLRs 家族的重要成員之一，主要識別革蘭陰性菌表面的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，在介導(dǎo)革蘭陰性菌及其LPS 的宿主反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用［5-7］。研究結(jié)果表明TLR4 的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)與人和動物疾病抗性、易感性有著密切的關(guān)系。目前對小鼠、牛、豬、雞TLR4 的研究已經(jīng)取得了較多的成果，而對綿羊TLR4 的研究甚少。以C3H/HeJ 小鼠作為動物模型對TLR4功能的研究已有大量報道，充分證實TLR4 在疾病研究方面具有重要作用［8-9］。牛TLR4基因可能在宿主對乳房炎感染的應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用，如White 等通過擴增牛TLR4基因外顯子，進行單核苷酸多態(tài)性掃描，發(fā)現(xiàn)了32 個SNPs 位點［10］。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)表明，豬的TLR4 的SNP 僅位于第三外顯子。Shinkai 等證實，豬TLR4基因的SNP 少于其他物種，只存在7 個非同義SNPs，且在11 個豬種的TLR4 基因中的7 個氨基酸替換全部位于外顯子3 上［11］。TLR4 在家禽中的研究成果主要還是集中在雞及其抗沙門氏菌感染與免疫的研究上，Sadeyen等利用沙門氏菌易感和抗性品系進行了TLR4基因表達量的研究，在感染后第1、2、4 周，抗性品系的TLR4基因表達量均高于易感性品系［12］。Shinkai 等用PCR-RFLP 方法的研究結(jié)果也表明，11 個豬種TLR4基因中共發(fā)現(xiàn)2 個等位基因，在27 bp 和245 bp 處存在多態(tài)位點［11］。但PCR-RFLP 方法不能確定酶識別序列以外的變異，導(dǎo)致等位基因的漏檢，而PCR-SSCP 技術(shù)能夠準(zhǔn)確的檢測到單核苷酸序列變異和等位基因數(shù)。本研究利用PCR-SSCP 方法對永昌羊、小尾寒羊、白薩?？搜蚝吞乜巳麪栄? 個品種舍飼綿羊TLR4基因第3 外顯子部分基因片段進行檢測，對不同SSCP 帶型的DNA 片段進行測序，以期確定舍飼綿羊TLR4基因的等位基因的分布情況，為利用分子標(biāo)記技術(shù)進行抗病育種及篩選抗病性強的肉用種羊提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗采集血樣共404 份:小尾寒羊112 份，采自甘肅省山丹縣某規(guī)?；B(yǎng)殖場;永昌羊(陶賽特與小尾寒羊雜交品種)201 份，采自甘肅省永昌縣某規(guī)?；驁?白薩福克羊53 份，采自甘肅省永昌縣規(guī)模化羊場;特克塞爾羊38 份，采自甘肅省民勤縣規(guī)?；驁?。每只羊頸靜脈采血10 ml，檸檬酸葡萄糖(ACD)抗凝，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 采用常規(guī)的酚/氯仿提取法，從血樣中提取DNA 并溶解于TE 緩沖液，在1%瓊脂糖凝膠，200 V 電泳檢測后，放于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計及PCR 擴增 根據(jù)GenBank 上公布的綿羊TLR4基因mRNA 序列(NM001135930.1)，與牛(GenBank 登錄號NM174198.6)、豬(GenBank 登錄號NM001113039.1)、人(GenBank 登錄號NM001017388)、小鼠(GenBank 登錄號NM001146035)的TLR4基因mRNA 進行序列對齊分析，并且參考已發(fā)表的文獻，利用PrimerPremier5.0軟件對羊TLR4基因第3 外顯子可能存在SNP 基因片段設(shè)計1 對引物。引物(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)序列如下:上游引物5'-CTTGCTCCCTGACATCTT-3'，下游引物5'-CCGTAGTTCTTGCTCCTT-3'。擴增的目的片段為238 bp。PCR 擴增體系:總體積為20.0 μl，其中超純水6.4 μl，上、下游引物各為(10 pmol/L)0.4 μl，基因組DNA(50 ng/μl)0.8 μl，PCR 預(yù)混酶12.0 μl。反應(yīng)條件:95.0 ℃預(yù)變性1 min;95.0 ℃變性30 s，56.5 ℃退火30 s，72.0 ℃延伸30 s，35 個循環(huán);最后72.0 ℃延伸7 min，4.0 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)( SSCP) 檢測及數(shù)據(jù)分析 取2 μl PCR 產(chǎn)物加入8 μl 變性緩沖液(95.000%去離子甲酰胺、0.025%二甲苯青、0.250%溴酚藍、0.010%甘油)于98 ℃變性10 min，冰浴10 min。12.000%的聚丙烯酰胺凝膠100 V，4℃電泳16 h，硝酸銀染，判定其基因型。根據(jù)PCRSSCP 分型結(jié)果，隨機選擇幾個基因型的PCR 代表產(chǎn)物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。運用DNAMAN 軟件對測序結(jié)果進行校正比對;運用Genepop 軟件對各品種的不同基因型的等位基因及基因頻率進行統(tǒng)計，同時進行多態(tài)信息含量(PIC)、純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和Hardy-Weinberg 平衡分析。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴增結(jié)果

擴增產(chǎn)物用1 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示擴增片段與目的片段大小一致且特異性好，可直接進行SSCP 分析(圖1)。

2.2 SSCP 分型結(jié)果

PCR 產(chǎn)物經(jīng)SSCP 檢測，發(fā)現(xiàn)擴增片段有多態(tài)性，根據(jù)條帶不同將其分為7 種基因型:AA、BB、CC、DD、AB、BD、EF(圖2)。

圖1 TLR4 基因的PCR 擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of TLR4 gene

2.3 TLR4 基因的核苷酸位點突變類型與多態(tài)性

將不同基因型的PCR 產(chǎn)物測序，與GenBank 中羊(登錄號NM-001135930.1)的TLR4基因序列進行比對(圖3)，共發(fā)現(xiàn)19 個變異位點，占分析位點的7.98%。其中轉(zhuǎn)換位點11 個，占變異位點的57.89%，包括鳥嘌呤(G)→腺嘌呤(A)的轉(zhuǎn)換位點6 個，胸腺嘧啶(T)→胞嘧啶(C)的轉(zhuǎn)換位點5 個;顛換位點6 個，占變異位點的31.58%;插入、缺失位點各1 個。

對綿羊TLR4基因的氨基酸序列進行分析，從圖4 可以看出，共有9 個氨基酸變異位點，占分析氨基酸總數(shù)的11.13%。

圖2 TLR4 基因的PCR-SSCP 檢測Fig.2 Detection of TLR4 gene by PCR-SSCP

2.4 TLR4 的基因型頻率和等位基因頻率

采用群體遺傳學(xué)方法，統(tǒng)計分析了本試驗的4種綿羊品種的基因型頻率和等位基因頻率。結(jié)果(表1)顯示，4 個綿羊的TLR4基因的基因型頻率和等位基因頻率分布各異，均表現(xiàn)為多態(tài)，且各個品種間存在差異，永昌羊和特克塞爾羊存在6 種基因型、4 個等位基因;永昌羊、白薩?？搜蚝吞乜巳麪栄蚨嘉礄z測到EF 基因型和E、F等位基因;白薩?？搜蜻€未檢測到DD 基因型;小尾寒羊未檢測到DD、BD基因型和D等位基因。其中AB 基因型在永昌羊的頻率較高，為0.58;AA 基因型在白薩?？搜?、和小尾寒羊的頻率均較其他基因型高，為優(yōu)勢基因型;而特克賽爾羊的優(yōu)勢基因型為BD 型。等位基因A在永昌羊、白薩福克羊和小尾寒羊的頻率分別達到了0.51、0.44 和0.59，因此單倍型A為優(yōu)勢等位基因;在特克塞爾羊中，B等位基因占據(jù)的比例最高，為優(yōu)勢等位基因。

2.5 遺傳多態(tài)性指標(biāo)和Hardy-Weinberg 平衡分析

對4 個品種的綿羊做多態(tài)信息含量(PIC)、純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和Hardy-Weinberg 平衡分析。結(jié)果(表2)顯示，4 個品種的綿羊在該基因上都處于Hardy-Weinberg 平衡態(tài)(P＞0.05)，其中白薩?？搜?、特克塞爾羊和小尾寒羊處于高度多態(tài)(PIC＞0.50)，而永昌羊處于中度多態(tài)(0.25 ＜PIC＜0.50)。

圖3 TLR4 基因的核苷酸比對結(jié)果Fig.3 Nucleotide sequences alignment of TLR4 gene

圖4 TLR4 基因編碼的氨基酸序列比對結(jié)果Fig.4 Amino acid sequences alignment of TLR4 gene

表1 4 種綿羊的基因型頻率和等位基因頻率Table 1 Genotype frequences and allele frequences in four types of sheep

表2 4 種綿羊TLR4 基因的遺傳多態(tài)性指標(biāo)Table 2 Genetic polymorphism of TLR4 gene

3 討論

大量的研究結(jié)果表明，免疫分子Toll 樣受體家族(Toll-like receptor，TLRs)的分子多態(tài)性差異與動物對病原的抵抗力和易感性有顯著的關(guān)系［13］，在豬、牛、雞、鼠等TLR4基因突變研究中發(fā)現(xiàn)其直接影響著機體的免疫反應(yīng)［14-18］。本研究在綿羊TLR4基因第3 外顯子部分序列中發(fā)現(xiàn)了19 處堿基突變，檢測到的7 種基因型，在4 個綿羊品種中的分布差異顯著，表明4 個綿羊品種之間的遺傳差異比較大，在分子水平上存在一定的遺傳差異。永昌羊和特克塞爾羊中發(fā)現(xiàn)6 種基因型和4 個等位基因，白薩?？搜虬l(fā)現(xiàn)了5 種基因型和4 個等位基因，小尾寒羊發(fā)現(xiàn)了5 種基因型和5 個等位基因，這可能是這4個綿羊品種所處的氣候環(huán)境、地理環(huán)境不同，使得其對外來病原微生物的抵抗能力各有差異，進而導(dǎo)致了遺傳多態(tài)性的差異［19］。研究結(jié)果表明，TLR4基因不同基因型的豬、牛、雞、鼠等都對疾病的抵抗力有差異［13-17］，可以推測本研究4 個綿羊品種的不同基因型對疾病的抵抗力也有差異，這對綿羊的抗病育種具有一定的指導(dǎo)意義。

基因外顯子功能區(qū)的SNPs 稱為功能SNPs，導(dǎo)致氨基酸改變的nsSNPs 對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著的影響［20］。本研究中氨基酸的變化位于跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，即1 498 bp A→G，導(dǎo)致氨基酸由異亮氨酸變?yōu)槔i氨酸;1 505 bp A→T，導(dǎo)致天冬氨酸變?yōu)槔i氨酸;1 534 bp T→G，導(dǎo)致絲氨酸變?yōu)楸彼?1 537 bp T→C，導(dǎo)致色氨酸變?yōu)榫彼?1 558 bp T→C，導(dǎo)致脯氨酸變?yōu)榻z氨酸;1 573 bp C→G，導(dǎo)致亮氨酸變?yōu)槔i氨酸;1 584 bp T→A，導(dǎo)致絲氨酸變?yōu)榫彼?1 599 bp G→C，亮氨酸變?yōu)楸奖彼?1 671 bp C→T，蘇氨酸變?yōu)榧琢虬彼?。這些堿基間的突變導(dǎo)致氨基酸的突變，可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的改變，進而使蛋白質(zhì)功能發(fā)生改變。至于這些堿基會不會影響TLR4基因的功能，主要是看編碼功能區(qū)與抗原結(jié)合的部位的氨基酸有無改變，這些還需要進一步研究。

群體遺傳學(xué)分析表明，TLR4基因第3 外顯子的基因型頻率在4 個綿羊品種中均偏離了Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)(P＜0.05)，說明該區(qū)域經(jīng)過長期進化與選擇，這些群體形成了適應(yīng)其生存環(huán)境的遺傳特性。A為4 個綿羊品種的優(yōu)勢基因，AA 為優(yōu)勢基因型。多態(tài)信息含量(PIC)和雜合度(He)都是能衡量群體內(nèi)遺傳變異的程度［21］。對于一個群體來說，PIC和He數(shù)值越大，說明群體內(nèi)基因的一致性越差，變異性也越大，選擇的潛力也大;反之，PIC和He數(shù)值越小，說明群體變異越小，選擇的潛力也就越?。?2］。本研究白薩?？搜颉⑻乜巳麪栄蚝托∥埠騊IC大于0.5，為高度多態(tài)，永昌羊PIC 大于0.25 且小于0.5，為中度多態(tài)。這可能是羊種受到自然環(huán)境和人工選育的雙重影響，從而使各個品種之間的遺傳多態(tài)性的豐富程度上存在著差異。人工選育使交配的隨機性降低，這或許會造成該基因位點處于不平衡。

到目前為止，還沒有綿羊TLR4基因突變與疾病抗性、易感性相關(guān)的研究。本研究中這4 個中國地方綿羊品種，TLR4基因多態(tài)性豐富，遺傳分化程度高，遺傳基礎(chǔ)廣泛，可以結(jié)合品種之間特性探討多態(tài)位點在免疫反應(yīng)中的作用，為進一步通過與疾病的相關(guān)性分析來確定分子標(biāo)記，進而為綿羊的抗病育種提供分子基礎(chǔ)。

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