胡肄農(nóng)， 丁 潛， 紀(jì)紅軍， 王曉曉， 朱振坤，4， 趙慶順， 邢光東

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京210014;3.南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，江蘇 南京210061;4.南通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南通226001)

中國(guó)是豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，豬肉是中國(guó)居民消費(fèi)的最主要的肉類產(chǎn)品。但近年來(lái)食品安全問(wèn)題頻發(fā)，嚴(yán)重影響了消費(fèi)者的健康，所以建立可靠的豬肉產(chǎn)品溯源系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)豬場(chǎng)到餐桌全程雙向可追蹤溯源，對(duì)遏制養(yǎng)豬生產(chǎn)中瘦肉精、重金屬等的濫用，控制獸藥的殘留，傳染性疾病的傳播，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展等起十分重要的作用。

豬肉產(chǎn)品的溯源技術(shù)和方法很多［1-2］，目前大都采用耳標(biāo)等標(biāo)簽溯源，這一技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單和成本低的特點(diǎn)，但因其標(biāo)簽易損、易脫落丟失、易混淆，且易在豬活體、胴體和豬肉產(chǎn)品間分離而難以保障豬肉產(chǎn)品溯源的準(zhǔn)確性。基因組DNA 存在于動(dòng)物每個(gè)細(xì)胞，不因動(dòng)物產(chǎn)品加工等發(fā)生改變，具有準(zhǔn)確、可靠等特點(diǎn)而被看好用于豬肉產(chǎn)品溯源［3］。目前研究熱點(diǎn)主要集中在微衛(wèi)星或單核苷酸標(biāo)記的多態(tài)性(SNPs)如何用于豬肉產(chǎn)品的溯源［4-6］。SNP 是指同一物種不同成員間或同一個(gè)體的成對(duì)染色體在同一基因組DNA 位點(diǎn)上出現(xiàn)的單個(gè)核苷酸之間的變異，是可遺傳的變異中最常見的一種，具有分布廣、密度高的特點(diǎn)，SNP 常被開發(fā)為DNA 指紋。本研究通過(guò)挖掘蘇鐘豬基因組DNA 的SNP 位點(diǎn)，研究編制蘇鐘豬個(gè)體身份識(shí)別的DNA 條形碼并形成相應(yīng)的數(shù)字條形碼，為豬種個(gè)體身份識(shí)別及肉產(chǎn)品溯源方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用豬為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的江蘇省級(jí)品種蘇鐘豬。選取7 頭公豬和12 頭母豬所生的96頭蘇鐘豬，并拔取豬毛(含毛囊)，剪短至1.5 cm，用DNA MiniExtract 試劑盒(南京潤(rùn)邦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))制備DNA 模板。單個(gè)樣本DNA 模板制備過(guò)程為:將數(shù)根豬毛毛囊端朝下插入裝有17.6 μl DNA MiniExtract 的PCR 管中，PCR 儀中95 ℃ 5 min，16 ℃1 min 后，加入濃度為20 mg/ml蛋白酶K2.4 μl，55 ℃2 h，95 ℃10 min，16 ℃1 min，離心取上清液作PCR 擴(kuò)增模板。混合樣本DNA 模板制備過(guò)程為:每頭豬選取1 根豬毛，毛囊端朝下混合插入裝有352 μl DNA MiniExtract 的離心管中，95 ℃水浴5min 后，冷卻至常溫，加濃度為20 mg/ml蛋白酶K48 μl，55 ℃水浴2 h，冷卻至常溫后離心取上清液作PCR 擴(kuò)增模板。

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR 擴(kuò)增

初期根據(jù)GenBank 登錄的豬基因序列設(shè)計(jì)29對(duì)引物，并用混合樣本DNA 模板擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序并選擇測(cè)序圖譜背景干凈，序列閱讀無(wú)歧義且擴(kuò)增產(chǎn)物存在SNP 位點(diǎn)的7 對(duì)引物用于蘇鐘豬個(gè)體身份DNA 識(shí)別的數(shù)字條形碼編制。7 對(duì)引物擴(kuò)增基因的GenBank 序列登錄號(hào)分別為AF327369、AF034974、AF473820、X68247、AJ251197、AF038553和M29939。

7 對(duì)引物PCR 反應(yīng)體系總體積均為20 μl，其中:Milli-Q 13.1 μl、25 mmol/L Mg2+2.0 μl、10 ×Buffer 2.0 μl、5 mmol/L dNTP 0.8 μl、5 μmol/L正反向游引物各1.0 μl、Taq酶0.1 μl、混合樣本或單個(gè)樣本DNA 模板1.0 μl。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s 或60 s，共35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。各引物對(duì)的退火溫度和延伸時(shí)間見表1。

1.3 擴(kuò)增片段SNP 位點(diǎn)篩選、個(gè)體身份識(shí)別的DNA 條形碼及相應(yīng)的數(shù)字條形碼編制

7 對(duì)引物共擴(kuò)增52 個(gè)SNP 位點(diǎn)，結(jié)合后續(xù)的單個(gè)樣本DNA 模板擴(kuò)增產(chǎn)物中的SNP 位點(diǎn)關(guān)聯(lián)性分析(基因分型完全一致的SNP 位點(diǎn)保留其一)及雜合度(H≥0.1)計(jì)算，最終確定41 個(gè)SNP 位點(diǎn)用于蘇鐘豬個(gè)體身份識(shí)別的DNA 條形碼編制。這些SNP 位點(diǎn)以擴(kuò)增產(chǎn)物中堿基所在的順序位置標(biāo)記，其中正向引物的第1 個(gè)堿基標(biāo)記為+1(表2)。數(shù)字條形碼編制時(shí)，41 個(gè)SNP 位點(diǎn)先組合形成DNA 條形碼;DNA 條形碼中SNP 位點(diǎn)排列，以引物對(duì)1 ～7 依次排列，其中每對(duì)引物的SNP 位點(diǎn)以5'至3'順序依次排列(表2)。DNA 條形碼中10種SNP 位點(diǎn)的基因型AA、TT、GG、CC、AT、AG、AC、TG、TC、GC 分別由數(shù)字0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 共10 個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字代替，形成相應(yīng)的數(shù)字條形碼。

表1 各引物對(duì)及相應(yīng)的退火溫度和延伸時(shí)間Table 1 Primers and their annealing temperatures and extending times for PCR reactions

表2 用于豬個(gè)體身份識(shí)別的7 對(duì)引物擴(kuò)增的SNP 位點(diǎn)Table 2 SNPs used for identification of pig individuals amplified by 7 primer pairs

2 結(jié)果與分析

根據(jù)41 個(gè)SNP 位點(diǎn)編制的數(shù)字條形碼，很好地區(qū)分了96 頭蘇鐘豬的個(gè)體身份，且區(qū)分度較好(表3)。96 頭蘇鐘豬是7 頭公豬、12 頭母豬所生后代，其中大多為全同胞。理論上，全同胞遺傳背景基本相同或相近，個(gè)體身份最難識(shí)別，編制的數(shù)字條形碼差異性應(yīng)該較小，但結(jié)果卻與之不相符。例如1-12 號(hào)是全同胞豬，它們的數(shù)字條形碼一一比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5、6 號(hào)豬差異最小，數(shù)字條形碼只有2 對(duì)引物擴(kuò)增的4 個(gè)SNP 位點(diǎn)存在差異(表3 中用黑體字表示);但7、8 號(hào)豬卻存在30 個(gè)SNP 位點(diǎn)的差異(表3中用黑體字表示)，這或許與父母本41 個(gè)SNP 位點(diǎn)的雜合狀態(tài)有關(guān)。

表3 編制的用于個(gè)體身份識(shí)別的96 頭蘇鐘豬數(shù)字條形碼Table 3 Digital barcodes used for identification of Suzhong swine individuals

3 結(jié)論

DNA 存在于動(dòng)物的每個(gè)細(xì)胞之中，且不受食品加工等人為影響，具有準(zhǔn)確、可靠等特點(diǎn)，因此利用DNA 進(jìn)行個(gè)體身份識(shí)別或肉產(chǎn)品溯源，是一種有效的遺傳學(xué)方法。SNP 是基因組DNA 變化的最簡(jiǎn)單形式［7］，在基因組中普遍存在，頻率大概是0.1%或以上［8］，篩選相對(duì)容易;而且動(dòng)物個(gè)體不同染色體的SNP 位點(diǎn)組合形成的信息豐富，因此SNP 常被開發(fā)為DNA 指紋，且可用于動(dòng)物個(gè)體身份識(shí)別。以豬(共19 對(duì)染色體)為例，假如一對(duì)引物僅擴(kuò)增1 個(gè)SNP 位點(diǎn)，那么針對(duì)19 條染色體的19 對(duì)引物擴(kuò)增的SNP 位點(diǎn)可組合形成319種基因型，即可用于識(shí)別約1.1 ×109頭豬的個(gè)體身份識(shí)別或肉產(chǎn)品溯源。而且針對(duì)高突變區(qū)的1 對(duì)引物可同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)SNP 位點(diǎn)，雖然擴(kuò)增片段連鎖，但常常存在多種基因型，這些引物對(duì)擴(kuò)增片段組合形成的信息更為豐富。本研究篩選7 對(duì)引物，擴(kuò)增52 個(gè)SNP 位點(diǎn)，經(jīng)關(guān)聯(lián)性分析及雜合度過(guò)濾(H≥0.1)后，選留41 個(gè)SNP位點(diǎn)，用于蘇鐘豬個(gè)體身份識(shí)別。96 頭蘇鐘豬樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物中，分離到的基因型數(shù)分別為9、11、7、20、3、10 和12 種。7 對(duì)引物擴(kuò)增片段可組合成9 ×11 ×7 ×20 ×3 ×10 ×12 =4 989 600種基因型，理論上可用于近5.0 ×106頭豬個(gè)體身份DNA 識(shí)別的數(shù)字條形碼編制，基本可以滿足規(guī)模蘇鐘豬養(yǎng)豬場(chǎng)豬的個(gè)體身份識(shí)別。

同時(shí)，雖然不同豬種共有一些SNP 位點(diǎn)，但由于種群的地理隔絕，可能導(dǎo)致SNP 在不同種群中的頻率不同，而且一個(gè)在某個(gè)種群或種族中常見的SNP 等位基因很少出現(xiàn)在另一個(gè)種群或種族內(nèi)。因此，本研究所篩選的蘇鐘豬高雜合度SNP 位點(diǎn)，可滿足蘇鐘豬的個(gè)體身份識(shí)別及肉產(chǎn)品溯源所需，其他豬種的個(gè)體身份識(shí)別，需要通過(guò)挖掘品種自有的高雜合度SNP 位點(diǎn)，重新組合或調(diào)整SNP 條形碼識(shí)別技術(shù)，提高個(gè)體身份識(shí)別的準(zhǔn)確率。

DNA 個(gè)體身份識(shí)別具有準(zhǔn)確、可靠的特點(diǎn)，可優(yōu)選用于種豬個(gè)體身份識(shí)別的條形碼編制及檔案庫(kù)建設(shè)。目前，DNA 個(gè)體身份識(shí)別成本較耳標(biāo)等識(shí)別方法相對(duì)較高，豬場(chǎng)每頭豬編制SNP 個(gè)體身份條形碼不太現(xiàn)實(shí)，但可以在偶發(fā)事件需要精準(zhǔn)溯源時(shí)，作為耳標(biāo)等識(shí)別方法的一種補(bǔ)充。同時(shí)，規(guī)模豬場(chǎng)可以分批備份出售或待屠宰豬樣本，通過(guò)編制并比對(duì)待識(shí)別豬個(gè)體或同批次備份豬樣本的數(shù)字條形碼，在大幅降低溯源成本的同時(shí)，達(dá)到肉產(chǎn)品溯源目的。隨著基因測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步及成本的大幅降低，不久的將來(lái)DNA 個(gè)體身份識(shí)別技術(shù)將有廣泛的應(yīng)用市場(chǎng)。

［1］ 王立方，陸昌華，謝菊芳，等.家畜和畜產(chǎn)品可追溯系統(tǒng)研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2005，21(7):168-174.

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