徐亞霞，李程碑，楊俊偉

(陜西省石油化工研究設(shè)計院，陜西 西安 710054)

卡松(KATHON)的有效成分為5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(CMIT)與2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MIT)，CMIT/MIT 的比值在2.5 ～4 之間，用硝酸鎂作穩(wěn)定劑，統(tǒng)稱卡松，主要應(yīng)用在日化、化妝品、涂料等行業(yè)的防腐殺菌。本院研究改用其它非二價鹽作穩(wěn)定劑的卡松(以下稱無鹽卡松)，避免了大量穩(wěn)定劑(硝酸鎂)引起的涂料、日化等產(chǎn)品絮凝，結(jié)塊等“鹽簇效應(yīng)”的不良現(xiàn)象。

近年來，微生物對包括卡松在內(nèi)的常用防腐劑產(chǎn)生了嚴重的抗藥性，引起了業(yè)內(nèi)人士的高度重視。王春華［1］等指出，工業(yè)殺菌劑的廣泛使用和其種類的不斷增加，使得抗藥性微生物菌株和具有多重抗藥性的菌株不斷出現(xiàn)，給工業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失。李程碑等［2］呼吁，使用日化防腐劑時應(yīng)注意減輕微生物抗藥性的產(chǎn)生，并不斷推出新的復(fù)合型防腐劑。使用復(fù)合防腐劑，是減輕微生物產(chǎn)生抗藥性的有效途徑之一。將幾種抑菌化學(xué)品配合使用，不僅可以拓寬抗菌譜，有效提高抗菌抑菌效果，而且可以使每種抗菌組分之間通過增效作用，增強使用效能，從而降低添加量。微生物同時對兩種或兩種以上的防腐劑產(chǎn)生抗藥性的概率極低，特別是幾種不同作用機理的防腐劑復(fù)合使用時，微生物對防腐劑產(chǎn)生抗藥性的幾率更低［3］。另外，使用復(fù)合防腐劑是防腐抑菌殺菌自身的需要。單一種類抗菌化合物，通常只對某一特定菌群具有殺滅或抑制效果，而造成日化、涂料等產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的微生物種類眾多，因此含有單一種類抗菌化合物的防腐劑不能滿足防腐防霉的實際需求。僅含一種抗菌化合物的防腐劑在實際使用中還存在適用pH 值、最低抑制濃度和抑菌范圍等多方面限制，故而推崇使用復(fù)合防腐劑。

卡松對銅綠假單胞菌的抑制作用較差，容易產(chǎn)生抗藥性而達不到防腐效果［4］，然而假單胞菌在土壤和空氣中大量存在，是涂料、日化等化工品中常見的重要有害菌，所以很難控制［5］?？ㄋ梢踩菀壮霈F(xiàn)皮膚過敏現(xiàn)象。1，3-二羥甲基-5，5-二甲基海因(DMDMH)是一種甲醛緩釋劑型防腐劑，在日化方面已得到了廣泛的應(yīng)用，因其同時具有很好的空間保護功能，在涂料中也越來越受到重視［6］。DMDMH 對細菌(包括銅綠假單胞菌)的抑制效率很高，而且不容易出現(xiàn)皮膚過敏，允許的添加量可高達0.6%，而DMDMH 對真菌的抑制效率則相對較差［2］，由于其添加量太小時起不到防腐作用，加量大時成本升高，而且會帶來甲醛超量問題，故而常常與卡松復(fù)合使用，通常DMDMH 與卡松的比例為(300∶1)～(1 000∶1)［7］。鑒于此，本文針對無鹽卡松與DMDMH 的復(fù)配展開研究，為開發(fā)一種使用成本低，更可靠安全的日化、涂料防腐劑作基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

無鹽卡松、DMDMH 均為自制;營養(yǎng)瓊脂、真菌培養(yǎng)基、瓊脂粉、營養(yǎng)肉湯為生化試劑;氯化鈉，分析純;菌種有銅綠假單胞菌(CGMCC 1.2464)、金黃色葡萄球菌(CGMCC 1. 0089)、黑曲霉(CGMCC 3.3928)、白色念珠菌(CGMCC 2.2086);雙圈牌定性濾紙。

DHP-9272 型恒溫培養(yǎng)箱;160 L 霉菌培養(yǎng)箱;BXM-30 型高壓滅菌器;JM-A1001 型電子天平;30-A2 型生物安全柜。

1.2 實驗方法

1.2.1 抑菌圈實驗將直徑1 cm 的滅菌濾紙置于一定濃度的防腐劑溶液中浸泡10 min，取出，自然風(fēng)干后備用。將滅菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿中，待凝固后，用無菌棉簽蘸取一定濃度的菌懸液，均勻涂抹在培養(yǎng)基上，然后將風(fēng)干的濾紙片貼于其上，37 ℃，24 h 培養(yǎng)，測量其抑菌圈大小。

1.2.2 增效實驗取5 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液加入試管中，121 ℃、20 min 滅菌。取1 mL 一定濃度的防腐劑溶液加至其中，再加0.1 mL 菌懸液，搖勻，置37 ℃培養(yǎng)。分別在24，48，72，112 h 觀察其是否渾濁，并計算增效系數(shù)SI 值。

1.2.3 挑戰(zhàn)實驗參照美國藥典(第21 版)微生物挑戰(zhàn)性試驗檢測防腐劑效果的方法，取自制受試樣30 g，加入菌懸液攪拌均勻，使每克受檢樣品最終分別含細菌量為5 ×106個、含真菌量為3 ×105，置于28 ℃培養(yǎng)箱。在接菌的0，7，14，21，28 d 分別取樣分析，取3 g 樣品，加到27 mL 滅菌生理鹽水，混勻，然后再用滅菌生理鹽水按10 倍依次稀釋。按平板傾注法計數(shù)受試品中含菌量，計算受試樣品是否通過挑戰(zhàn)實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度無鹽卡松、DMDMH 抑制細菌與真菌生長對比

選取防腐劑無鹽卡松與DMDMH 的不同濃度，測試其對綠膿桿菌和白色念珠菌的抑菌圈大小，結(jié)果見圖1。

圖1 不同作用濃度下無鹽卡松與DMDMH 抑菌圈大小對比Fig.1 Inhibition zone contrast of nonsalt KATHON and DMDMH with different concentration

由圖1 可知，兩種防腐劑在使用濃度為0.2%～1.5%范圍內(nèi)對細菌具有抑菌性，在使用濃度為0.4% ～1.8%范圍內(nèi)對真菌具有抑菌性，并且在該范圍內(nèi)，二者的抑菌性均隨著防腐劑濃度的增大而呈增強趨勢;同一使用濃度的無鹽卡松抑制細菌或真菌生長效果大于同一使用濃度的DMDMH;同一使用濃度的無鹽卡松抑制細菌生長效果大于抑制真菌生長效果，同樣，DMDMH 抑制細菌生長效果也大于抑制真菌生長效果。

2.2 無鹽卡松與DMDMH 協(xié)同增效抑制細菌生長效果

將無鹽卡松、DMDMH 稀釋至一定濃度，使其加至5 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中達到一定的濃度值，然后加入裝有5 mL 營養(yǎng)肉湯的試管中，再加入0.1 mL綠膿桿菌菌懸液，搖勻，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，在規(guī)定時間觀察其是否生長。以48 h 為基準(zhǔn)，以渾濁試管之后的第一個清亮試管的防腐劑濃度作為防腐劑的最小抑菌濃度，作為計算協(xié)同增效系數(shù)SI 的依據(jù)，協(xié)調(diào)增效系數(shù)SI 計算方法［8］如下:

SI=Qa/QA+Qb/QB

式中 QA——無鹽卡松單獨作用時的最小抑菌濃度;

Qa——混合防腐劑最小抑菌濃度時無鹽卡松的濃度;

QB——DMDMH 單獨作用時的最小抑菌濃度;

Qb——混合防腐劑最小抑菌濃度時DMDMH的濃度。

當(dāng)SI 值＞1 時，表明兩種防腐劑具有拮抗作用;當(dāng)SI 值=1 時具有相加作用;當(dāng)SI 值＜1 時表明兩種防腐劑具有協(xié)同增效作用，并且SI 越小說明增效作用越強，實驗結(jié)果見表1。

表1 無鹽卡松與DMDMH 對綠膿桿菌的協(xié)同增效抑制實驗Table 1 Synergy coefficient experiment of nonsalt KATHON and DMDMH inhibit Pseudomonas aeruginosa

由表1 可知，無鹽卡松與DMDMH 對細菌具有明顯的協(xié)同增效抑制作用，增效系數(shù)SI 為0.59 ～0.86;當(dāng)無鹽卡松與DMDMH 分別以0.24 與83.3(mg/L)復(fù)配時，具有最佳協(xié)同增效效果。以此作為依據(jù)，針對細菌和真菌混合菌的增效效果作進一步研究。

2.3 無鹽卡松與DMDMH 協(xié)同增效抑制細菌和真菌的混合菌生長效果

用綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉菌的混合菌菌懸液代替綠膿桿菌菌懸液，同法做無鹽卡松與DMDMH 的協(xié)同增效實驗，結(jié)果見表2。

表2 無鹽卡松與DMDMH 對細菌和真菌的混合菌的協(xié)同增效抑制實驗Table 2 Synergy coefficient experiment of nonsalt KATHON and DMDMH inhibit bacteria and epiphyte

由表2 可知，無鹽卡松與DMDMH 對細菌和霉菌的混合菌具有明顯的協(xié)同增效抑制作用，增效系數(shù)SI 為0.58 ～0.88;當(dāng)無鹽卡松與DMDMH 分別以0.60 與200(mg/L)復(fù)配時，具有最佳協(xié)同增效效果。

2.4 無鹽卡松與DMDMH 復(fù)配體系的挑戰(zhàn)試驗

為了進一步驗證無鹽卡松與DMDMH 復(fù)配體系的防腐效果，選自制洗潔凈為研究對象，添加無鹽卡松與DMDMH 有效成分之比為1.21 ∶133.3 的復(fù)配體系，使洗潔精中防腐劑的有效含量分別為12.1 mg/L無鹽卡松和1 333 mg/L DMDMH(工業(yè)實際應(yīng)用推介使用量為實驗室研究最低抑菌濃度的10 倍)，再分別添加綠膿桿菌和白色念珠菌菌懸液，做挑戰(zhàn)試驗，結(jié)果見表3。

表3 無鹽卡松與DMDMH 復(fù)配體系挑戰(zhàn)實驗結(jié)果Table 3 Challenging experiment result of the combined system of nonsalt KATHON and DMDMH

由表3 可知，添加無鹽卡松與DMDMH 的洗潔凈通過細菌和真菌挑戰(zhàn)實驗，說明無鹽卡松與DMDMH 的1.21∶133.3 (mg/L)的復(fù)配體系，具有優(yōu)良的長效抑制細菌和真菌生長的功效。

無鹽卡松除了具有常規(guī)卡松抑菌性能強、抗菌譜廣等特點外，還具有常規(guī)卡松不具有的很大優(yōu)勢，該研究為無鹽卡松系列產(chǎn)品的推出奠定了基礎(chǔ)，在無鹽卡松與DMDMH 1.21∶133.3 (mg/L)的復(fù)配體系中稍加合適的穩(wěn)定劑等輔料，就可作為一款新的效價更高的優(yōu)質(zhì)防腐殺菌劑在日化等工業(yè)市場推廣應(yīng)用。除了主要應(yīng)用于化妝品防腐外，同時還可作為日化、油漆、涂料及木材等領(lǐng)域的防腐劑，是一種應(yīng)用前景廣闊的值得大力開發(fā)的產(chǎn)品，具有很高的社會經(jīng)濟效益。

3 結(jié)論

(1)無鹽卡松、DMDMH 二者都具有抑制細菌、真菌生長效果，并且二者的抑菌性在一定濃度范圍內(nèi)隨著防腐劑濃度的增大而呈增強趨勢;同一使用濃度的無鹽卡松抑制細菌生長效果大于抑制真菌生長效果;同樣，DMDMH 抑制細菌生長效果也大于抑制真菌生長效果;但同一使用濃度的無鹽卡松抑制細菌或真菌生長效果大于同一使用濃度的DMDMH。

(2)當(dāng)無鹽卡松與DMDMH 分別以0.24 mg/L與83.3 mg/L 復(fù)配時，對細菌具有最佳協(xié)同增效抑制效果;當(dāng)無鹽卡松與DMDMH 分別以0.60 mg/L與200 mg/L 復(fù)配作用時，對細菌和霉菌的混合菌具有最佳協(xié)同增效抑制效果。

(3)無鹽卡松與DMDMH 的1. 21 ∶133. 3(mg/L)的復(fù)配體系，具有優(yōu)良的長效抑制細菌及真菌生長的功效。

［1］ 王春華，謝小保，曾海燕，等. 微生物對工業(yè)殺菌劑的抗藥性研究進展［J］.微生物學(xué)通報，2007，34(4):56-62.

［2］ 李程碑.使用日化防腐劑減少微生物的抗藥性［J］.應(yīng)用化工，2007，36(3):288-291.

［3］ 李程碑.復(fù)合防腐劑更安全［J］. 千色美業(yè)，2011(9):28-29.

［4］ Comish Aiexander. Method and compostions:US，7202287［P］.2007-09-19.

［5］ Smith Roger Errol，Bensaid Eric S.Antimicrobial mixtures of 1，3-bis(hydroxymethyl)-5，5-dimethylhydantino and 1，2-benzisothiazolin-3-one:US，6133300［P］. 2000-10-17.

［6］ 李程碑.涂料防腐劑的研究及應(yīng)用進展［J］.現(xiàn)代涂料與涂裝，2013，16(4):23-28.

［7］ Lutz，Patrick，Marski，et al. Broad spectrum preservative:US，6114366［P］.2000-09-05.

［8］ 李程碑，楊俊偉，李輝，等. 液體洗滌劑用防腐劑的發(fā)展及防腐體系的設(shè)計［J］. 中國洗滌用品工業(yè)，2012(10):65-72.