彭勝，王志宏，鄭陽(yáng)，史麗娟，趙帥，唐坤海，彭密軍

(吉首大學(xué) 林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杜仲湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000)

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)為我國(guó)特有名貴滋補(bǔ)中藥材，其皮入藥已有兩千多年歷史，早在漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》中就被列為“上品”，具有“三降六抗一增”等作用［1］?？寡趸煞秩琰S酮、多酚類化合物是杜仲的主要活性物質(zhì)，它們通過(guò)清除體內(nèi)自由基、還原氧化物質(zhì)，達(dá)到延緩衰老、提高機(jī)體免疫力等效果［2-4］。目前杜仲皮提取物各萃取部位的抗氧化活性尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)杜仲皮不同萃取部位的體外清除·OH 和·DPPH 活性進(jìn)行研究，以期為杜仲皮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

杜仲皮2012 年5 月于吉首大學(xué)張家界校區(qū)后山采摘(經(jīng)廖博儒研究員鑒定為杜仲)，50 ℃烘干，粉碎并過(guò)40 目篩，備用;1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基(·DPPH);無(wú)水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、鹽酸、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰二氮菲等均為分析純;所有用水為超純水。

U-3900 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);KQ-250E 超聲波清洗器;Hei-VAP 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;BM400 數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋;AEG-220 電子天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2. 1 杜仲皮不同萃取物的制備準(zhǔn)確稱取1 000 g杜仲樣品以料液比1∶15 加入60%乙醇水溶液超聲輔助提取40 min，濾渣以1∶10 料液比重復(fù)提取1 次，合并濾液并濃縮至1 000 mL，依次用1 000 mL石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取相和萃余相分別于55 ℃濃縮成浸膏，冷凍干燥得石油醚萃取物0. 947 8 g，三氯甲烷萃取物2.978 5 g，乙酸乙酯萃取物6.909 0 g，正丁醇萃取物15.232 0 g，萃余相物質(zhì)100.737 0 g。

1.2.2 杜仲皮不同萃取物清除·OH 活性測(cè)定采用鄰二氮菲-Fe2+-H2O2法［5］，按表1 數(shù)據(jù)分別加入試劑后，定容至10 mL，混合均勻，于37 ℃水浴中反應(yīng)1 h，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上510 nm 處測(cè)定吸光值(3 個(gè)平行)，計(jì)算杜仲皮不同萃取物對(duì)·OH的清除率，見(jiàn)下式。

式中 A0——空白參比吸光值;

A1——未損傷管吸光值;

A2——損傷管吸光值;

A3——樣品參比吸光值;

A4——樣品管吸光值。

表1 鄰二氮菲-Fe2+-H2O2 反應(yīng)體系加樣表Table 1 Protocol of phenanthroline-Fe2+-H2O2 reaction system mL

1.2.3 杜仲萃取物清除·DPPH 活性測(cè)定［5］精密稱取1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基，用無(wú)水乙醇溶解并配制成0.20 mmol/L 溶液。按表2 分別加入試劑和樣品后，25 ℃水浴中保溫30 min，以無(wú)水乙醇為對(duì)照，在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上514 nm 測(cè)定吸光值，計(jì)算杜仲皮不同萃取物對(duì)·DPPH 的清除率，見(jiàn)下式。

表2 清除·DPPH 加樣表Table 2 Protocol of scavenging·DPPH

2 結(jié)果與討論

2.1 杜仲萃取物清除·OH 活性測(cè)定

自由基是體內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)代謝時(shí)產(chǎn)生的，高化學(xué)活性的自由基氧化不飽和脂肪酸，導(dǎo)致細(xì)胞功能突變或衰退，從而引起老化和一系列病變及多種疾病。杜仲皮中含有豐富的抗氧化物質(zhì)，這些物質(zhì)通過(guò)清除機(jī)體內(nèi)自由基，還原氧化物質(zhì)，從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體，延緩衰老的作用。

圖1 杜仲皮不同萃取物清除·OH 活性Fig.1 Scavenging activity of different solvent fractions from the bark of Eucommia ulmoides Oliv. on·OH

圖2 Vc 清除·OH 活性Fig.2 Scavenging activity of Vc on·OH

由圖1、圖2 可知，在0.5 ～300 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，杜仲不同萃取物隨著質(zhì)量濃度的增加，對(duì)·OH的清除率先升高后降低。萃取物中清除活性最高的是正丁醇相，當(dāng)其質(zhì)量濃度為190 μg/mL 時(shí)清除率達(dá)到75.23%，與抗壞血酸最大清除率很接近;乙酸乙酯相清除作用次之，當(dāng)質(zhì)量濃度為230 μg/mL時(shí)，清除率為68.84%;氯仿相清除率稍低，清除率為50.01%;石油醚相和萃余相清除率最低，均低于20%?？赡苁怯捎诓煌瑯O性溶劑萃取物的活性成分不同，其清除·OH 的能力不同。

2.2 杜仲皮不同萃取物清除·DPPH 活性測(cè)定

在細(xì)胞進(jìn)行代謝的過(guò)程中，自由基作為副產(chǎn)物源源不斷的產(chǎn)生，少量自由基對(duì)人體有益，過(guò)量則會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞功能喪失，造成機(jī)體損害。·DPPH 是一種有機(jī)自由基，可用其測(cè)定抗氧化物質(zhì)打斷脂質(zhì)氧化或蛋白質(zhì)氧化的鏈鎖反應(yīng)的能力?？寡趸镔|(zhì)清除·DPPH 反應(yīng)原理為·DPPH 溶于乙醇等有機(jī)溶劑中且呈紫色，性質(zhì)穩(wěn)定，抗氧化劑的供氫離能力使得·DPPH 的孤對(duì)電子被配對(duì)而使其褪色，514 nm 處測(cè)得的特征吸收峰吸光值變?。?］。

由圖3、圖4 可知，杜仲皮不同萃取物質(zhì)量濃度和清除· DPPH 活性存在量效關(guān)系。在0 ～120 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，·DPPH 清除率隨著萃取物質(zhì)量濃度的增大而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為120 μg/mL時(shí)，清除·DPPH 效果依次為乙酸乙酯相＞正丁醇相＞氯仿相＞萃余相＞石油醚相，最大清除率高達(dá)93.01%，可能原因在于以上萃取溶劑對(duì)于多酚類化合物等抗氧化成分萃取能力依次降低。

圖3 杜仲皮不同萃取物清除·DPPH 活性Fig.3 Scavenging activity of different solvent fractions from the bark of Eucommia ulmoides Oliv. on·DPPH

圖4 Vc 清除·DPPH 活性Fig.4 Scavenging activity of Vc on·DPPH

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，杜仲皮不同萃取物對(duì)·OH和·DPPH 均有一定的清除能力。其中乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相清除自由基效果較佳，可以用來(lái)開(kāi)發(fā)抗氧化劑。

［1］ 杜紅巖.杜仲優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培［M］.北京:中國(guó)林業(yè)出版社，1996.

［2］ 黃美娥，曠勇，彭勝，等. 杜仲粉絲中活性成分同時(shí)提取條件及其含量測(cè)定研究［J］. 食品科技，2012，37(7):206-208.

［3］ 葉文峰.杜仲葉中化學(xué)成分、藥理活性及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.林產(chǎn)化工通報(bào)，2004，38(5):40-44.

［4］ 晏媛，郭丹. 杜仲葉的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展［J］.中成藥，2003，25(6):491-492.

［5］ 彭密軍，彭勝，吳吉林，等. 杜仲素抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2010，31(19):84-86.

［6］ 彭勝.杜仲葉抗氧化活性成分研究及桃葉珊瑚甙的制備［D］.吉首:吉首大學(xué)，2011.