李錨，賀珧珈，徐莉，張后今，閆云君

(華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 分子生物物理教育部重點實驗室，湖北 武漢 430074)

隨著化石燃料的消耗及環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，新型清潔可再生能源開發(fā)對人類社會可持續(xù)發(fā)展的重要性日益凸顯［1-2］，受到廣泛關(guān)注［3］。在目前已知的生物柴油制備工藝中，生物酶法生物柴油制備工藝因其反應(yīng)條件溫和、無污染、原料來源豐富、反應(yīng)產(chǎn)物易分離等優(yōu)點而被認(rèn)為具有較好應(yīng)用前景［4］。來源豐富的微生物脂肪酶作為一種高效的生物催化劑，在生物柴油制備中的應(yīng)用研究已有很多報道［5-11］。但固定化酶需要的分離、純化和固定化過程復(fù)雜，游離酶又不穩(wěn)定、易失活，因此價格昂貴，極大地阻礙了生物酶法生產(chǎn)生物柴油的工業(yè)化［12］。

表面展示技術(shù)的發(fā)展，使脂肪酶能夠展示于酵母細(xì)胞表面，進(jìn)而解決了生物酶法生物柴油制備工藝中存在的問題。南極假絲酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B，CALB)是一種應(yīng)用廣泛的脂肪酶，且已有研究證實其與嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase，TLL)在催化生物柴油制備時具有協(xié)同效應(yīng)［11］。但截至目前，尚未見有將這兩種具有協(xié)同催化效應(yīng)的脂肪酶共展示于酵母細(xì)胞表面并應(yīng)用于催化生物柴油合成的報道。

本研究將表面共展示有CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母工程菌經(jīng)高密度發(fā)酵、冷凍離心及真空冷凍干燥制備得凍干全細(xì)胞催化劑，用于生物柴油制備，探索了反應(yīng)體系、全細(xì)胞添加量、反應(yīng)溫度及醇油摩爾比等反應(yīng)條件，并進(jìn)一步做了正交優(yōu)化。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母GS115，自制;脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(C16 ∶0，C17 ∶0，C18 ∶0，C18 ∶1，C18 ∶2，C18 ∶3)，色 譜 純;PEG20000、甲醇、乙腈、丙酮、叔丁醇、正己烷、正庚烷、異辛烷、石油醚等均為分析純。

福立GC9790 氣相色譜;FID 檢測器;安捷倫HP-INNOWAX 19091-133 色譜柱;FD-1D-50 真空冷凍干燥機(jī)。

1.2 實驗方法

1.2.1 全細(xì)胞催化劑的制備 收集發(fā)酵液，4 ℃下6 000 r/min 離心5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液(pH 8.0，50 mmol/L)清洗2 ～3 次，用PEG20000 濃度為5%的磷酸鹽溶液重懸細(xì)胞，靜置30 min，－80 ℃預(yù)凍12 h，真空冷凍干燥24 h，收集干燥后微黃、顆粒粉狀物質(zhì)，即為凍干的全細(xì)胞。

1.2.2 轉(zhuǎn)酯化反應(yīng) 在50 mL 帶塞玻璃錐形瓶中，加入大豆油2.19 g 與一定量的甲醇和有機(jī)溶劑，再加入一定量的全細(xì)胞催化劑，40 ℃，200 r/min，反應(yīng)結(jié)束后，12 000 r/min 離心10 min，取上清(即得反應(yīng)產(chǎn)物)，進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3 分析方法

1.3.1 酶活力的測定 采用堿式滴定法測定全細(xì)胞水解橄欖油乳化液的活力［13］。將經(jīng)離心收集或干燥后的細(xì)胞用Tris-HCl(pH 8.0，0.05 mol/L)制成細(xì)胞懸液備用。取橄欖油乳化液4 mL，Tris-HCl(pH 8.0，0.05 mol/L)5 mL，配制反應(yīng)體系，40 ℃預(yù)熱5 min，加入細(xì)胞懸液1 mL(對照組加入Tris-HCl溶液1 mL)，反應(yīng)10 min，加入15 mL 終止液。用0.05 mol/L NaOH 溶液滴定，記錄消耗的NaOH 溶液的體積。

酶活力單位(U)定義:40 ℃，pH 8.0 時，單位時間(即每分鐘)催化水解橄欖油產(chǎn)生1 μmol 游離脂肪酸所需的脂肪酶量定義為一個活力單位(U)。測得表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母GS115 酶活力為1 700 U/(g-dry-cell)。

1.3.2 GC 檢測 去酶催化反應(yīng)后離心得的生物柴油10 μL 溶于300 μL 十七碳內(nèi)標(biāo)(1 mg/mL)，再加入正己烷290 μL，渦旋震蕩混勻。用微量進(jìn)樣針吸取樣品1 μL，待氣相色譜運行穩(wěn)定，且處于準(zhǔn)備狀態(tài)時注入進(jìn)樣口，啟動設(shè)定的樣品檢測程序進(jìn)行檢測。色譜儀配置:INNOWAX 毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm×0.25 μm);氫火焰離子檢測器(FID);N2000 氣相色譜工作站。載氣氮氣，柱前壓0.1 MPa，氣化室溫度230 ℃，檢測器溫度280 ℃。柱溫采用一階程序升溫:初始柱溫180 ℃，以3 ℃/min 的速率升到230 ℃，再 在 該 溫 度 維 持1 min。內(nèi)標(biāo)法計算生物柴油得率。

式中 Y——大豆油甲酯化得率，%;

m——脂肪酶催化大豆油各脂肪酸甲酯量，g;

M——大豆油完全甲酯化后脂肪酸甲酯量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)溶劑的選擇

有機(jī)溶劑體系自上世紀(jì)80 年代被美國科學(xué)家Klibanov［14］首次報道并證實了脂肪酶在該體系催化反應(yīng)的可行性后，脂肪酶有機(jī)溶劑體系催化反應(yīng)成為研究熱點。全細(xì)胞催化的反應(yīng)體系中必須要有合適的反應(yīng)溶劑才能取得較好的催化效果。圖1 列出了所選擇的不同有機(jī)溶劑介質(zhì)體系中全細(xì)胞催化劑的相對催化活力(以叔丁醇為參照)［15］。反應(yīng)條件:細(xì)胞量0. 1 g，甲醇∶豆油(n/n)= 4 ∶1，40 ℃，200 r/min，72 h，溶劑50%。

圖1 反應(yīng)溶劑的影響Fig.1 Effects of solvents on biodiesel production

由圖1 可知，以叔丁醇為反應(yīng)介質(zhì)時，表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶畢赤酵母全細(xì)胞催化劑表現(xiàn)出較高的催化活力，相比而言，其他有機(jī)溶劑及無溶劑的反應(yīng)體系中全細(xì)胞催化活力均很低。因此，選定叔丁醇為反應(yīng)溶劑。

2.2 叔丁醇添加量對全細(xì)胞催化反應(yīng)的影響

反應(yīng)體系中叔丁醇加入量對表面共展示CALB與TLL 脂肪酶畢赤酵母全細(xì)胞催化油脂甲醇解反應(yīng)的影響見圖2。反應(yīng)條件:細(xì)胞量0.5 g，甲醇∶豆油(n/n)=4 ∶1，40 ℃，200 r/min，72 h。

圖2 叔丁醇加入量的影響Fig.2 Effects of t-butanol amount on biodiesel production

由圖2 可知，當(dāng)叔丁醇加入量小于底物油重20%時，油脂甲酯得率隨著叔丁醇加入量的增加呈明顯上升趨勢;當(dāng)叔丁醇加入量超過底物油重20%時，油脂甲酯得率則緩慢降低。當(dāng)叔丁醇添加量為底物油重20%，反應(yīng)72 h，甲酯得率可達(dá)71.4%。

作為反應(yīng)溶劑，叔丁醇添加量對表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶畢赤酵母全細(xì)胞催化生物柴油制備具有十分重要的意義。叔丁醇添加量過少，甲醇與油脂溶解不均勻，且高濃度甲醇對酶毒害作用較大;叔丁醇添加量過多則會使得反應(yīng)物濃度過小，降低了分子有效碰撞幾率從而使得反應(yīng)速率降低。綜上，適宜的叔丁醇添加量對反應(yīng)高效進(jìn)行具有重要意義。實驗結(jié)果表明，最佳叔丁醇添加量為底物油重20%。

2.3 醇油摩爾比的影響

反應(yīng)條件:細(xì)胞量0. 5 g，40 ℃，200 r/min，72 h，溶劑量20%，甲醇加入量對反應(yīng)的影響見圖3。

圖3 醇油摩爾比的影響Fig.3 Effects of methanol/oil ratio on biodiesel production

由圖3 可知，在20%叔丁醇添加體系中，甲醇解甲酯得率隨著醇油比的增加而增加，在醇油摩爾比4 ∶1，甲酯得率最大，隨后呈緩慢下降趨勢，因此，選取醇油摩爾比4 ∶1 進(jìn)行反應(yīng)。

2.4 全細(xì)胞添加量的影響

反應(yīng)條件:甲醇∶豆油(n/n)= 4 ∶1，40 ℃，200 r/min，72 h，溶劑量20%，全細(xì)胞添加量的影響見圖4。

圖4 全細(xì)胞添加量的影響Fig.4 Effects of whole-cell biocatalyst amount on biodiesel production

由圖4 可知，反應(yīng)速率隨著全細(xì)胞添加量的增加而加快。全細(xì)胞添加量為0.6 g，反應(yīng)72 h，甲酯得率可達(dá)79.32%。繼續(xù)增加全細(xì)胞添加量，甲酯得率不再增加，呈微弱下降趨勢，有研究指出這一現(xiàn)象可能與體系中傳質(zhì)阻力的增加有關(guān)［15］。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，確定全細(xì)胞添加量為0.6 g。

2.5 水添加量的影響

脂肪酶催化的反應(yīng)多發(fā)生在油水界面，水添加量的影響見圖5。反應(yīng)條件:細(xì)胞量0.6 g，甲醇∶豆油(n/n)= 4 ∶1，40 ℃，200 r/min，72 h，溶劑量20%。

圖5 水添加量的影響Fig.5 Effects of water content on biodiesel production

由圖5 可知，在水添加量低于4%時，呈微弱激活效應(yīng)，當(dāng)添加量大于5%時，甲酯得率降低顯著。這可能是過量水的存在，使得水解副反應(yīng)的發(fā)生所致。

2.6 反應(yīng)溫度的影響

反應(yīng)條件:細(xì)胞量0.6 g，甲醇∶豆油(n/n)=4∶1，35 ℃，200 r/min，72 h，溶劑20%，水3%，反應(yīng)溫度的影響見圖6。

圖6 溫度的影響Fig.6 Effects of temperature on biodiesel production

由圖6 可知，叔丁醇介質(zhì)體系中表面共展示CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母全細(xì)胞作為催化劑適于低溫催化反應(yīng)，當(dāng)溫度超過45 ℃時，對酶的毒害作用顯著。綜合考率經(jīng)濟(jì)、節(jié)能原則，選取35 ℃作為最佳實驗溫度。

2.7 反應(yīng)時間的影響

酶促反應(yīng)是一個動態(tài)可逆過程，反應(yīng)進(jìn)行到一定程度，正逆反應(yīng)速率達(dá)到平衡，產(chǎn)物不再增加。反應(yīng)條件:細(xì)胞量0.6 g，甲醇∶豆油(摩爾比)=4 ∶1，40 ℃，200 r/min，溶劑20%，水3%，實驗考察了反應(yīng)時間的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 反應(yīng)時間的影響Fig.7 Effect of reaction time on biodiesel production

由圖7 可知，甲酯得率隨著反應(yīng)時間的延長而增加，24 h 前，速率增長顯著，隨后增速十分緩慢。選取24 h 為收獲時間。此時，甲酯得率80.99%。

2.8 正交優(yōu)化

用正交實驗設(shè)計對影響全細(xì)胞催化油脂甲酯得率的酶用量、醇油摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等因素作近一步優(yōu)化。實驗設(shè)計及結(jié)果分別見表1 與表2，方差分析見表3。

由表3 可知，較為顯著的影響因素是時間和全細(xì)胞添加量。由表2 可知，最優(yōu)反應(yīng)條件組合為:A3B2C2D3，即全細(xì)胞添加量0.7 g，醇油摩爾比4 ∶1，溫度35 ℃，時間36 h。驗證實驗表明最優(yōu)條件下甲酯得率，達(dá)86.23%。

表1 正交實驗設(shè)計Table 1 Orthogonal experimental design

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 正交實驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment results

3 結(jié)論

表面共展示具協(xié)同催化效應(yīng)CALB 與TLL 脂肪酶的畢赤酵母全細(xì)胞的催化劑可催化叔丁醇介質(zhì)體系下油脂甲醇解生物柴油制備，優(yōu)化反應(yīng)條件為:全細(xì)胞添加量0.7 g，醇油摩爾比4 ∶1，溫度35 ℃，時間36 h。在此條件下，甲酯得率可達(dá)86.23%。

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