張宇 姚煦 顧漢艷 王寶璽 劉軍

單純皰疹病毒包膜糖蛋白gC合成及驗證

張宇 姚煦 顧漢艷 王寶璽 劉軍

目的利用基因工程技術表達單純皰疹病毒(HSV)包膜糖蛋白(gC)并進行驗證。方法分兩段合成gC蛋白,分別合成基因GC-F和GC-R,并分別將基因亞克隆進pSumo-Mut(含Stu I和Xho I酶切位點)和pCzn1(含Nde I和XhoI酶切位點)表達載體,獲得pSumo-Mut-GC-F和pCzn1-GC-R質粒。將兩重組質粒轉化ArcticExpressTM(DE3)原核宿主菌,異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達目的蛋白,經(jīng)Ni柱親和純化,最終獲得高純度蛋白。采用Western印跡法檢測重組GC-F和GC-R兩段蛋白與HSV IgG的結合情況。結果應用全基因合成方法獲得GC-F和GC-R基因片段,經(jīng)SDS-PAGE鑒定分析,主要分布于沉淀層,經(jīng)親和層析后獲得的蛋白純度在80%以上,并可被人抗HSV-1抗體(IgG)陽性血清識別。結論利用基因工程技術構建融合表達載體,并經(jīng)IPTG誘導成功表達gC蛋白,與HSV-1感染血清反應陽性,是后續(xù)進行功能研究的理想實驗材料。

濕疹;單純皰疹病毒屬;包膜糖蛋白

特應性皮炎(atopic dermatitis,AD)患者存在皮膚屏障功能異常如抗微生物肽分泌減少［1］,加之免疫平衡傾向Th2型為主導［2］,所以AD患者對多種病原微生物易感,并直接影響疾病的嚴重度［3］。單純皰疹病毒1型(HSV-1)感染引起的皰疹樣濕疹(eczema herpeticum)是AD較嚴重的并發(fā)癥。HSV-1有12種特異性抗原糖蛋白,包膜糖蛋白(glycoprotein C,gC)是其中主要的亞型。HSV包膜蛋白在病毒的吸附、入侵和刺激機體產(chǎn)生免疫反應中具有重要作用,其中包膜糖蛋白gC蛋白具有重要的抗原表位,能誘發(fā)機體特異性免疫應答。病毒糖蛋白可與樹突細胞表面的識別糖基結構的模式識別受體C型凝集素受體結合,內(nèi)吞至細胞內(nèi)后,引發(fā)機體的免疫反應［4］。為揭示HSV-1 gC蛋白在AD發(fā)病中的作用和機制,本研究在體外誘導合成了HSV-1包膜糖蛋白gC,并經(jīng)過驗證證實純化獲得的糖蛋白片段可與HSV-1感染患者血清中的特異性HSV-1抗體結合。

材料與方法

一、材料

pSumo-Mut質粒和pCzn1表達質粒(南京鐘鼎生物技術有限公司),DH5α為本實驗室保存,ArcticExpressTM(DE3)(美國Agilent Tehnologies公司),蛋白參照物(美國Invitrogen公司),Sumo蛋白酶(南京鐘鼎生物技術有限公司),異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺(Acr-Bis)、三羥甲基氨基甲烷(美國Sigma公司),十二烷基硫酸鈉(SDS,美國Amersco公司),四甲基乙二胺(TEMED,美國 Bio-Rad公司),Tyrptone、酵母浸液(英國Oxoid公司),0.22 μm無菌濾器和透析袋(美國Millpore公司),Ni2+-IDA親和層析膠(美國Novagen公司),瓊脂糖(美國Sigma公司),DNA膠純化試劑盒、質粒小提試劑盒(美國AXYGEN公司),鼠抗6組氨酸蛋白His單克隆抗體(美國abcam公司,貨號AB1791),兔抗鼠HRP標記的多克隆抗體(美國Millpore公司,貨號AP113p),鼠抗人HSV-1 gC包膜蛋白抗體(美國abcam公司,AB6509)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

二、方法

1.pSumo-Mut-GC-F和pCzn1-GC-R載體構建及鑒定:根據(jù)Genebank查找的gC蛋白全長序列,選取最大一段ORF,分別合成基因GC-F和GC-R,包括設計的酶切位點基因片段。其中GC-F防止蛋白移碼,在啟動密碼子后額外增加堿基T。全基因合成后,利用1%瓊脂糖電泳并切膠回收兩段基因片段。膠回收產(chǎn)物GC-F片段分別以Stu I和Xho I內(nèi)切酶酶切,連接于pSumo-Mut載體,獲得pSumo-Mut-GC-F質粒,見圖1a。膠回收產(chǎn)物GC-R片段分別以Nde I和XhoI內(nèi)切酶酶切,連接pCzn1載體,獲得pCzn1-GC-R質粒,見圖1b。

圖1 pSumo-Mut-GC-F和pCzn1-GC-R載體構建 1a:pSumo-Mut-GC-F質粒圖;1b:pCzn1-GC-R質粒圖

2.pSumo-Mut-GC-F和pCzn1-GC-R載體轉化至大腸桿菌ArcticExpressTM(DE3):分別將pSumo-Mut-GC-F和pCzn1-GC-R重組質粒5 ng加入100 μl ArcticExpressTM(DE3)感受態(tài)細菌中,置冰上20 min;42℃熱激90 s,迅速置冰中5 min;加入600 μl 37℃預熱的LB培養(yǎng)液;37℃,220 r/min振搖1 h,離心后全部涂布于含50 mg/L Kan的LB平板,37℃倒置培養(yǎng)過夜;挑取轉化平板上的單克隆接種于含50 mg/L卡那霉素的3 ml LB培養(yǎng)液試管中,37℃220 r/min振搖過夜;翻譯后GC-F蛋白序列為:MNWSHPQFEKSSGSSGGHHHHHHGGSG GSGSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSE IFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGI RIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGMSETASTG PTITAGAVTNASEAPTSGSPGSAASPEVTPTSTPNPN NVTQNKTTPTEPASPPTTPKPTSTPKSPPTSTPDPKPK NNTTPAKSGRPTKPPGPVWCDRRDPLARYGSRVQI RCRFRNSTRMEFRLQIWRYSMGPSPPIAPAPDLEEV LTNI,雙劃線區(qū)域為Sumo蛋白,劃線區(qū)域為目的蛋白GC-F,融合蛋白Sumo-GC-F理論分子量為30 910,GC-F蛋白理論分子量為16 740。翻譯后GC-R蛋白序列為:MNHKVHHHHHHMIGEVTPATQGMY YLAWGRMDSPHEYGTWVRVRMFRPPSLTLQPHAV MEGQPFKATCTAAAYYPRNPVEFDWFEDDRQVFN PGQIDTQTHEHPDGFTTVSTVTSEAVGGQVPPRTFT CQMTWHRDSVTFSRRNATGLALVLPRPTITMEFGV RHVVCTAGCVPEGVTFAWFLGDDPSPAAKSAVTAQ ESCDHPGLATVRSTLPISYDYSEYICRLTGYPAGIPV LEHHGSHQPPPRDPTERQVIEAIEWVG,加上N端的His標簽,蛋白理論分子量為29 340,GC-R蛋白理論分子量為27 910。

3.不同濃度IPTG誘導pSumo-Mut-GC-F和pCzn1-GC-R載體融合蛋白的表達:將少量擴繁的陽性單克隆培養(yǎng)液擴大培養(yǎng),按1∶100接種于含50 mg/L卡那霉素的30 ml LB培養(yǎng)液中,37℃220 r/min振搖至菌體A600為0.4(約2 h);取出1 ml培養(yǎng)物,10 000×g室溫離心2 min,用100 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體上清及沉淀(未IPTG誘導表達組);向剩余的培養(yǎng)物中加入終濃度0.1～1 mmol/L的IPTG。37℃220 r/min振搖4 h,誘導GC-F和GC-R融合蛋白表達。

4.GC-F-Sumo和GC-R-His融合蛋白的純化及鑒定:將IPTG誘導表達的培養(yǎng)菌液低溫離心6 000×g,10 min,菌體沉淀重懸于20 ml溶解緩沖液［20 mmol/L Tris-HCl,含1 mmol/L苯甲基磺酰氟化物(PMSF)和細菌蛋白酶抑制劑,pH 8.0］,超聲破碎(功率400 W,4 s,間歇8 s,共20 min);將超聲破碎的細胞裂解液4℃10 000×g離心20 min,收集沉淀;使用包涵體洗滌液(20 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,2 mol/L尿素,1 mol/L NaCl,1%Triton X-100,pH 8.0)洗滌包涵體3次;用溶解緩沖液［20 mmol/L Tris,5 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT),8 mol/L尿素pH8.0］,按一定比例溶解包涵體,4℃放置過夜;室溫,17 540×g離心15 min;將包涵體溶解液滴加到20 mmol/L Tris,pH8.0緩沖液逐步成倍梯度稀釋,緩慢攪拌;至尿素濃度達到0.5 mol/L時,將蛋白溶液裝入透析袋,于4℃、20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液、pH7.4中透析過夜。

Ni柱親和純化:將以上所得蛋白,利用Biologic LP層析系統(tǒng),上樣至Ni2+-IDA結合緩沖液預平衡的Ni2+-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱(0.8 cm,2 cm);分別用Ni2+-IDA結合緩沖液、Ni2+-IDA洗滌緩沖液(160 mmol/L Tris-HCl,20 mmol/L咪唑,0.5 mol/L NaCl,pH7.9)、Ni2+-IDA洗脫瓊脂糖凝膠(160 mmol/L Tris-HCl,250 mmol/L咪唑,0.5 mol/L NaCl,pH7.9)沖洗,至流出液A280值到達基線時,分別收樣;取所收各管樣品10 μl。

純化GC-F-Sumo和GC-R-His蛋白鑒定:對誘導表達的培養(yǎng)菌液進行變復性和Ni柱親和純化后,獲得的GC-F-Sumo融合蛋白和GC-R-His融合蛋白進行10%SDS-PAGE分析。

5.Western印跡檢測重組蛋白:分別取合成的gC兩段重組蛋白GC-F和GC-R各10 μl加入等體積2×樣品緩沖液,充分混勻后90℃水浴5 min,然后2 600×g離心1 min,每個泳道上樣20 μl;上樣完畢后,聚丙烯酰胺凝膠先90 V跑完積層膠,再將電壓升至200 V直到電泳結束;電泳結束后,取下凝膠進行轉膜,恒壓100 V轉膜,約為1.5 h;電轉結束后,取下膜后先用磷酸鹽緩沖溶液洗滌4次,每次5 min。然后置于5%脫脂奶粉封閉液中封閉37℃,1 h;用封閉液稀釋一抗,膜在一抗稀釋液中37℃反應1 h;洗膜4次,每次5 h;用含5%牛奶的封閉液稀釋二抗。膜在二抗中37℃反應1 h;洗膜ECL顯影。

結 果

一、pSumo-Mut-GC-F和pCzn1-GC-R融合基因表達載體構建

全基因合成的方法得到帶有Stu I和Xho I酶切位點的gC-F,酶切后連接入pSumo-Mut原核表達載體,連接后Stu I酶切位點消失;帶有Nde I和XhoI酶切位點的gC-R連接入pCzn1載體,獲得pCzn1-GC-R質粒。將構建好的重組質粒pSumo-Mut-GC-F用Xba I和Xho I雙酶切,電泳后得2條片段,2片段的位置與理論值一致(1條是5 183 bp,1條是901 bp),說明克隆成功(圖2)。將構建好的重組質粒pCzn1-GC-R用Nde I和XhoI雙酶切,電泳得2條線性片段,2片段的位置與理論值一致(1條為4 380 bp,1條為753 bp),說明克隆成功(圖2)。將質粒送Invitrogen公司測序,測序結果顯示,GC-F-ORF和GC-R-ORF區(qū)域與合成基因序列100%一致。

二、0.5 mmol/L IPTG 37℃誘導pSumo-Mut-GC-F和pCzn1-GC-R載體融合蛋白的表達

挑取轉化平板上成功將pSumo-Mut-GC-F和pCzn1-GC-R載體轉化至大腸桿菌ArcticExpressTM(DE3)陽性單克隆菌落,擴繁搖菌。取出1 ml培養(yǎng)物作為IPTG陰性誘導組(未IPTG誘導表達組),加入終濃度0.1～1 mmol/L的IPTG進行誘導(IPTG誘導表達組)。10%SDS-PAGE蛋白電泳分析,未加入誘導劑IPTG組GC-F-Sumo蛋白條帶雜亂,含有非特異性蛋白較多,0.5 mmol/L IPTG誘導組蛋白條帶清晰,且沉淀中獲得的目的蛋白條帶清晰,非特異性蛋白干擾較少(圖3)。含pCzn1-GC-R質粒菌液培養(yǎng)物中加入終濃度0.5 mmol/L IPTG后,分別在11℃和37℃條件下進行誘導表達。10%SDSPAGE分析,GC-R-His蛋白電泳結果見圖4。

三、GC-F-Sumo和GC-R-His蛋白純化及鑒定

將0.5 mmol/L IPTG誘導表達的培養(yǎng)菌液沉淀進行變復性和Ni柱親和純化后,獲得純化的GCF-Sumo融合蛋白,10%SDS-PAGE分析純度在80%以上,45 000附近(圖5a)。純化的GC-R-His融合蛋白,10%SDS-PAGE分析純度在85%以上,35 000附近(圖5b)。

圖2 重組質粒pSumo-Mut-GC-F、pCzn1-GC-R雙酶切電泳圖M:標準參照物;1:重組質粒pSumo-Mut-GC-F;2:重組質粒pCzn1-GC-R

圖4 IPTG誘導pCzn1-GC-R載體融合蛋白的表達 GC-R-His融合蛋白經(jīng)0.5 mmol/L IPTG在低溫11℃和37℃誘導條件下,上清及沉淀中均可表達,且菌體沉淀中獲得的目的蛋白條帶清晰,非特異性蛋白干擾較少。M:標準參照物;1:37℃未誘導;2:37℃IPTG誘導菌液沉淀;3:37℃IPTG誘導菌液上清;4:11℃未誘導;5:11℃IPTG誘導菌液沉淀;6:11℃IPTG誘導菌液上清

圖5 GC-F-Sumo(5a)和GC-R-His(5b)蛋白純化及鑒定 M:標準參照物;1:流出液;2:洗脫液;3:0.5 mmol/L IPTG誘導。經(jīng)變復性Ni柱純化后GC-F-Sumo融合蛋白純度達80%以上,GC-R-His融合蛋白純度在85%以上

四、Western印跡檢測重組蛋白

1.使用抗His單克隆抗體檢測重組蛋白:一抗為鼠抗人His單克隆抗體,二抗為兔抗鼠HRP標記的多克隆抗體。經(jīng)抗His抗體鑒定,表達的兩段gC蛋白(GC-F-Sumo和GC-R-His)均有陽性條帶,確系含有His標簽,見圖6。

2.使用抗HSV-1 gC包膜單克隆抗體檢測重組蛋白:一抗鼠抗人HSV-1 gC單克隆抗體,1∶1 000稀釋;二抗為兔抗小鼠HRP標記的多克隆抗體,1∶2 500。經(jīng)抗HSV-1 gC鑒定,表達的兩段gC蛋白(GC-F-Sumo和GC-R-His)均無陽性條帶,由于此一抗為商品化的單克隆抗體,是以HSV為抗原進行免疫,篩選單克隆抗體,獲得的抗體不一定針對本研究誘導合成蛋白gC衣殼蛋白抗原位點。

3.使用HSV IgG陽性血清檢測重組蛋白:一抗為患者血清,摸索稀釋條件為1∶10;二抗為兔抗人HRP-IgG,1∶500稀釋。對照組為健康人血清,1∶10稀釋。經(jīng)血清鑒定,表達的兩段gC蛋白(GC-F-Sumo和GC-R-His)均有陽性條帶,證明gC蛋白表達成功,見圖7。

討 論

研究發(fā)現(xiàn),約3%～6%的AD患者易并發(fā)HSV感染引起的皰疹樣濕疹［5］,導致病情加重和治療困難。并且HSV感染使AD患者對多種過敏原的敏感性增加,更易使免疫反應向Th2型極化和加重病情,并能減少表皮內(nèi)產(chǎn)生干擾素-γ(IFN-γ)的Th1細胞數(shù)量,導致多種感染,最常見的為金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌和綠膿桿菌感染［6］。還有學者推測HSV加重AD皮損的原因可能與金黃色葡萄球菌相似,包括HSV作為超抗原引起免疫反應,使局部T細胞活化,釋放細胞因子等［7］;但具體機制還不清楚,有待于進一步深入研究。

圖6 抗His單克隆抗體檢測重組蛋白 表達的兩段gC蛋白(GC-F-Sumo和GCR-His)均有陽性條帶,確系含有His標簽。M:標準參照物;1、3:空白對照;2:GC-F-Sumo蛋白;4:GC-R-His

圖7 使用感染單純皰疹病毒患者血清(HSV IgG陽性)檢測重組蛋白 表達的兩段gC蛋白(GC-F-Sumo和GC-R-His)均有陽性條帶,證明gC蛋白表達成功 M:標準參照物;1、3:健康人血清;2、4:感染HSV患者血清

有研究顯示,HSV-1包膜糖蛋白gC可與樹突細胞(DC)表面的C型凝集素受體DC-SIGN結合,結合量與DC-SIGN受體的表達量成正比。HSV-1經(jīng)與DC-SIGN結合后,介導了病毒的內(nèi)吞進入樹突細胞內(nèi),導致細胞感染［4］。進入DC細胞內(nèi)18 h后,HSV仍以粒子形式存在,而樹突細胞的免疫刺激能力減弱［8］,還可以通過細胞-細胞接觸形式將HSV傳播給接觸的細胞,在擴大感染及免疫逃避中起重要作用。我們的前期研究工作顯示(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表),AD患者樹突細胞表面表達DC-SIGN數(shù)量明顯增加,并且與患者病情呈正相關;DC-SIGN特異性識別抗原表面的糖基結構在體外可與多種病原菌或過敏原的糖基蛋白特異性結合,介導特應性皮炎的發(fā)病。故我們推測HSV的包膜糖蛋白gC通過C型凝集素受體,在介導特應性皮炎的發(fā)病中可能發(fā)揮了重要作用。

為進行后續(xù)的實驗研究,我們在本實驗中應用全基因合成方法獲得gC的兩個基因片段GC-F和GC-R,分別克隆至pSumo-Mut和pCzn1兩表達載體中。因為HSV蛋白包膜具有糖基化結構,糖基化是糖蛋白被識別結合的重要因素之一,所以我們選擇體外誘導合成gC在原核宿主菌中表達,具有糖基化結構并可被C凝集素受體識別。經(jīng)SDS-PAGE鑒定,分析融合蛋白主要分布于沉淀,通過變復性的方式,重溶后Ni親和純化,最終獲得純度在80%以上的GC-F-Sumo和GC-R-His蛋白。經(jīng)人抗HSV-1血清檢測GC-F-Sumo和GC-R-His表達成功。希望為進一步研究HSV如何引起樹突細胞感染及介導何種型別免疫應答提供材料。

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Synthesis and verification of herpes simplex virus envelope glycoprotein gC

Zhang Yu*，Yao Xu，Gu Hanyan，Wang Baoxi，Liu Jun.*Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

s:Yao Xu，Email:dryao_xu@126.com；Liu Jun，Email:drliu_jun@126.com

Objective To synthesize herpes simplex virus(HSV)envelope glycoprotein gC using gene engineering techniques，and to verify its expression.Methods Two separate parts of the HSV envelope glycoprotein gC，i.e.，GC-F and GC-R，were respectively synthesized.The GC-F and GC-R genes were synthesized，subcloned into the expression vectors pSumo-Mut(containing recognition sequences for endonucleases Stu1 and XhoI)and pCzn1(containing recognition sequences for endonucleases NdeI and XhoI)respectively to form the recombinant plasmids pSumo-Mut-GC-F and pCzn1-GC-R.E.coliBL21 Arctic Express(DE3)cells were transformed with the two recombinant plasmids separately.Isopropyl thiogalactoside(IPTG)was used to induce the expression of target protein which was subsequently purified by nickel affinity chromatography.Finally，Western blot was performed to verify the reactivity of the synthesized protein with the sera of HSV-1-positive patients.Results Both GC-F and GCR genes were synthesized by a total gene synthesis method.As sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis(SDS-PAGE)showed，the fusion proteins were mainly distributed in the sediment layer.The purity of GC-F and GC-R proteins was over 80%after purification by affinity chromatography.Western blot showed that both of the proteins were reactive with anti-HSV-1 antibody-positive sera.Conclusions Fusion expression vectors have been constructed for the gC protein，and IPTG successfully induces its expression.Moreover，the resulting proteins could react with anti-HSV-1 antibody-positive sera，and may serve as an ideal experimental material for next functional study.

Eczema；Simplexvirus；Glycoprotein C

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.013

國家自然科學基金(81171501);江蘇省自然科學基金(BK2011127)

210042南京,中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所(張宇、姚煦、顧漢艷、王寶璽);南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院皮膚科(劉軍)

姚煦,Email:dryao_xu@126.com;劉軍,Email:drliu_jun@126.com

2013-12-19)

(本文編輯:顏艷)