陳聽宜 楊國玲 劉建雯 劉金鵬 張芳芳 趙曉宣

RNA干擾技術對犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究

陳聽宜 楊國玲 劉建雯 劉金鵬 張芳芳 趙曉宣

目的構建犬小孢子菌PQ-LRP基因RNA干擾載體,探討RNA干擾載體對犬小孢子菌PQLRP基因表達的影響。方法用根癌農(nóng)桿菌介導的T-DNA插入突變技術,加入多克隆位點,引入潮霉素抗性基因,先后構建PUC-PLULT、PCB309-PLULT載體。應用實時PCR方法檢測PCB309-PLULT載體對犬小孢子菌PQ-LRP基因表達的干擾作用。結果構建了中間載體PUC-PLUT、PUC-PLULT,并通過PCR、基因測序進行鑒定。成功構建了長為8 825 bp的干擾載體PCB309-PLULT,并通過酶切測定為該目的載體;篩選出犬小孢子菌轉化子的潮霉素最佳濃度為300 mg/L;用實時定量PCR方法對犬小孢子菌PQ-LRP基因干擾前后表達量進行鑒定:以干擾前PQ-LRP相對表達量1.0為標準,干擾后PQ-LRP相對表達量為0.39,干擾后下調61%。結論干擾載體PCB309-PLULT可以明顯抑制犬小孢子菌PQ-LRP基因的表達。

犬小孢子菌;RNA干擾;基因,PQ-LRP;基因沉默

犬小孢子菌(Microsporum canis)是較常見的致病性淺部真菌,易致兒童白癬和膿癬。對頭癬流行病學調查發(fā)現(xiàn),主要致病菌為犬小孢子菌［1］。本課題組前期運用抑制消減雜交技術(SSH)構建了犬小孢子菌差異基因文庫［2］,通過NCBI數(shù)據(jù)庫分析得到PQ loop repeat protein(PQ-LRP),并用半定量PCR證實PQ-LRP基因在兒童頭皮組織中的高表達可能與犬小孢子菌的生長和致病性密切相關［3］;后期采用cDNA末端快速擴增法(RACE)獲取PQ-LRP基因的cDNA全長序列,其全長為1 522 bp,開放閱讀框為 1 080 bp,編碼 359個氨基酸序列［4］。 基于此,本實驗用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的T-DNA(transfer DNA)插入突變技術,對現(xiàn)有的植物雙元表達載體進行修飾改造,加入多克隆位點,引入潮霉素(hygromycin)抗性基因,使其在間隔序列兩側加上目的基因的正反向干擾序列。構建并優(yōu)化根癌農(nóng)桿菌介導的犬小孢子菌遺傳轉化體系,通過基因定量分析確定構建的轉化體系對犬小孢子菌PQ-LRP基因的抑制作用。

材料和方法

一、材料

1.主要試劑:潮霉素,哈爾濱賽拓生物公司生產(chǎn);質粒PCB309、PUC-PUT、根癌農(nóng)桿菌EHA105來自本科室;DH5α,XbaⅠ、XhoⅠ、SpeⅠ、SacⅠ、KpnⅠ、BglⅢ、HindⅢ等限制性內切酶,T4DNA連接酶、Taq酶、T載體、反轉錄試劑盒均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;標準參照物(MarkerⅢ)、質粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

2.菌株:犬小孢子菌膿癬株1株來自本科真菌室,分離自我科門診就診的5歲頭癬男孩,經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)及ITS段PCR電泳鑒定為犬小孢子菌。

二、方法

1.引物設計:①擴增PQ-LRP基因引物:PQLRP正向:5'-CGGGGTACCCTCGAGCTTCAACATT ATCGGAGCGG-3',酶切位點:KpnⅠ,XhoⅠ;反向:5'-GAAGATCTAAGCTTTAACTGAGGGATTCGGCT AC-3',酶切位點:BglⅢ,HindⅢ;②PUC-PUT 質粒中間間隔序列引物:CUT正向:5'-TACCCACTGGAG ATTTGTTGG-3',反向:5'-CAACAAATCTCCAGTGG GTAC-3'。

2.參照RNAisoTMPlus試劑盒說明書提取總RNA［4］,用紫外分光光度計測定A260/A280比值為1.9～2.0(正常為1.8～2.0),電泳鑒定提取RNA的片段大小。然后將提取的總RNA反轉錄為cDNA作為PCR擴增的模板。

3.RNA干擾載體PCB309-PLULT的構建及根癌農(nóng)桿菌的轉化:①構建中間載體PUC-PLUT:以cDNA為模板,用引物PQ-LRP擴增PQ-LRP基因的干擾序列,得到片段長度約600 bp(反應條件:94℃預變性1 min;94℃變性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸30 s,30個循環(huán);72℃后延伸10 min);分別將PUC-PUT和純化回收的上述PCR片段用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切(37℃、3 h),將酶切后純化回收的PCR片段與PUC-PUT載體進行連接(22℃、2 h),得到PUC-PLUT載體,將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌DH5α,提質粒測序驗證;②構建中間載體PUC-PLULT:分別將PUC-PLUT和純化回收的上述PCR片段用BglⅢ和KpnⅠ雙酶切(條件同上),將酶切后純化回收的PCR片段與PUC-PLUT載體進行連接(條件同上),得到PUC-PLULT,將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌DH5α,提質粒測序驗證;③構建載體PCB309-PLULT:將質粒PUC-PLULT和PCB309分別用SpeⅠ和SacⅠ雙酶切,酶切后再分別純化回收,將從PUC-PLULT酶切并純化的PLULT片段(3.4 kb)與酶切后純化的PCB309載體進行連接,得到PCB309-PLULT,將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌DH5α,挑取單菌落,提質粒,SpeⅠ和SacⅠ雙酶切驗證。用電轉化方法,將干擾載體從DH5α供體菌中轉入根癌農(nóng)桿菌EHA105中,并用PCR鑒定干擾載體是否轉入。

4.犬小孢子菌對潮霉素的敏感試驗、犬小孢子菌的轉化及轉化子的篩選:分別配置潮霉素濃度為0、100、150、200、250、300、350、400 mg/L 的沙氏固體培養(yǎng)基,將犬小孢子菌懸液(分段菌絲濃度1×105～5×105個/ml)涂于培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)6～7 d,重復實驗3次,確定潮霉素的篩選濃度為300 mg/L。取1 mlA600nm為0.6～0.8的根癌農(nóng)桿菌與5×105個/ml分段菌絲1 ml混合;將200 μl混合液分別涂于添加和未添加乙酰丁香酮(AS 200 μmol/L)的誘導平板上,25 ℃避光培養(yǎng) 24、36、48、60、72 h［5］。 將共培養(yǎng)的含有根癌農(nóng)桿菌和犬小孢子菌分段菌絲的混合物轉移到誘導平板上(含300 mg/L潮霉素、200 μmol/L頭孢噻肟鈉);25℃培養(yǎng)4 d,直至菌落出現(xiàn);將具有潮霉素抗性的犬小孢子菌轉接于無潮霉素的沙氏培養(yǎng)基,連續(xù)傳代5次后,轉移至含有300 mg/L潮霉素的篩選平板上進行檢測,由此獲得穩(wěn)定的含有干擾載體PCB309-PLULT的犬小孢子菌干擾株。

5.犬小孢子菌PQ-LRP基因mRNA表達量:用SYBR GreenⅠ熒光染料嵌合法,以干擾前犬小孢子菌的總RNA反轉錄獲得的cDNA作為標準品，分別對各樣品的PQ-LRP基因和管家基因18S用實時PCR進行定量分析,通過對管家基因的校正,對各樣品PQ-LRP基因的相對表達量進行分析。

結 果

一、總RNA提取結果

提取的犬小孢子菌膿癬株總RNA用瓊脂糖凝膠電泳得到完整帶型(圖1),適宜用于反轉錄。

二、RNA干擾載體PCB309-PLULT的構建

①PUC-PLUT質粒PCR鑒定:用引物PQ-LRP正向引物、CUT反向引物進行PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳鑒定,可見約600 bp的目的片段,證明目的片段連接到PUC-PUT載體中得到載體PUC-PLUT(圖2),后經(jīng)測序驗證正確;②PUC-PLULT質粒PCR鑒定:以引物LRP正向、CUT正向引物進行PCR擴增鑒定,可見約600 bp的目的片段,證明目的片段連接到PUC-PLUT中,得到載體PUCPLULT(圖3),并經(jīng)測序驗證:與NCBI數(shù)據(jù)庫比照,與PQ-LRP基因序列相同;③酶切片段PLULT與PCB309 PCR鑒定:載體PCB309-PLULT構建前酶切片段PLULT(3.4 kb)與 PCB309(5.4 kb)的 PCR鑒定,與預期結果相符(圖5)。

圖1 犬小孢子菌膿癬株總RNA提取電泳圖 M:標準參照物;1,2:犬小孢子菌膿癬株RNA

圖2 PUC-PLUT質粒PCR鑒定圖M:標準參照物;1:陰性對照;2:PUC-PLUT

圖3 PUC-PLULT質粒PCR鑒定圖 M:標準參照物;1:陰性對照;2:PUC-PLUTL

圖4 PCB309-PLULT質粒的根癌農(nóng)桿菌轉化鑒定圖 M:標準參照物;1:陰性對照;2:PCB309-PLULT

圖5 酶切片段PLULT與PCB309的PCR鑒定結果 M:標準參照物;1:PLULT(3.4 kb)與PCB309(5.4 kb)

三、PCB309-PLULT質粒的根癌農(nóng)桿菌轉化結果

構建的PCB309-PLULT質粒用電轉化的方法轉到根癌農(nóng)桿菌EHA105中,對陽性克隆用引物LRP正向、CUT正向引物進行PCR鑒定,可見到約600 bp的片段,證明載體轉入根癌農(nóng)桿菌中(圖4)。

四、利用實時PCR方法對犬小孢子菌PQ-LRP基因的mRNA相對表達量進行分析,結果可見,干擾后組PQ-LRP基因表達水平發(fā)生變化,以干擾前PQ-LRP相對表達量為標準1,干擾后PQ-LRP相對表達量為0.39(表1)。

表1 犬小孢子菌PCB309-PLULT干擾前、后PQ-LRP基因相對表達量

討 論

我們用RNA干擾技術對犬小孢子菌PQ-LRP基因進行了研究。RNA干擾技術具有高效、特異、周期短、操作簡單、高通量等特點,已漸成為對真菌進行遺傳改造的一種新手段［6-8］。1992年,Romano和Macino首次在粗糙脈胞菌中發(fā)現(xiàn)真菌中存在RNA干擾現(xiàn)象(當時稱此現(xiàn)象為“基因壓制”),之后Vermout等運用聚乙二醇(PEG)介導的轉化體系對犬小孢子菌基因SUB3及DPPIV干擾后進行功能研究［9］。但由于真菌細胞多為多倍體且細胞壁含有較多的多糖及多糖蛋白等成分,使得干擾技術用于真菌研究過程中也存在干擾效率低、有脫靶效應等問題。所以選擇適當?shù)倪z傳轉化方法并制備合適的轉化載體,才能夠更高效地導入siRNA,有效延長RNA干擾的作用時間,進而提高靶基因抑制效率,更好地對真菌進行基因研究。

RNA干擾技術中載體構建及轉化是本實驗研究的關鍵部分。已報道的載體構建方法有多種,本研究采用本真菌室設計的絲狀真菌基因RNA干擾載體,構建了載體PCB309-PLULT,證明PCB309-PLULT載體適用于皮膚癬菌基因的RNA干擾研究,該方法也是首次在皮膚癬菌中得到應用。與Vermout等［9］構建載體的方法相比優(yōu)點為:能夠將多數(shù)研究中使用的雙元載體改造為較小的雙元載體,加入T-DNA邊界重復序列,之后加入潮霉素抗性基因以便于篩選。根癌農(nóng)桿菌是一種革蘭陰性土壤桿菌,它能夠將腫瘤誘導質粒上的一段T-DNA轉移并隨機整合到宿主基因組中,產(chǎn)生T-DNA插入突變。本研究成功完成了PCB309-PLULT質粒的根癌農(nóng)桿菌轉化,獲得了干擾載體PCB309-PLULT的犬小孢子菌干擾株,并用實時PCR方法對犬小孢子菌PQ-LRP基因的mRNA相對表達量進行分析,結果顯示,干擾后其基因表達水平下調61%。優(yōu)化的反應體系成功地實現(xiàn)了對犬小孢子菌PQ-LRP基因表達的有效干擾,證明由根癌農(nóng)桿菌介導的T-DNA插入突變技術具有轉化受體類型多、轉化效率高、轉化子穩(wěn)定、操作簡便等優(yōu)點。

PQ-LRP蛋白家族都是膜綁定蛋白,在真菌其他菌屬中也被發(fā)現(xiàn),但該基因的致病機理尚未見報道,本研究結果干擾載體PCB309-PLULT能夠明顯抑制犬小孢子菌PQ-LRP基因的表達及犬小孢子菌干擾株的成功獲得,為探討PQ-LRP基因對菌落形態(tài)學、動物模型的建立等奠定了一定基礎。

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PQ-loop repeat protein gene silencing by RNA interference inMicrosporum canis

Chen Xinyi，Yang Guoling，Liu Jianwen，Liu Jinpeng，Zhang Fangfang，Zhao Xiaoxuan.Department of Dermatology and Venereology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116011，China

Yang Guoling，Email:yanggl@medmail.com.cn

Objective To build a RNA interference vector for PQ-loop repeat protein(LRP)gene，and to evaluate the effect of the vector on the expression of PQ-LRP gene inMicrosporum canis.Methods The PUC-PLULT and PCB309-PLULT vectors were constructed sequentially by usingAgrobacterium tumefaciens-mediated T-DNA insertional mutagenesis，adding multiple cloning sites，and introducing the hygromycin-resistance gene.Microsporum caniswas transformed with the PCB309-PLULT vector followed by a series of passages and hygromycin selection.Real-time quantitative PCR was performed to measure the expression of PQ-LRP gene inMicrosporum canisbefore and after transformation.Results The intermediate vectors PUC-PLUT and PUC-PLULT were constructed and identified by PCR and gene sequencing.The 8 825-bp interference vector PCB309-PLULT was successfully built and confirmed by enzyme digestion.The optimum concentration of hygromycin for screening forMicrosporum canistransformants was determined as 300 mg/L.The mRNA expression level of PQ-LRP was decreased by 61%in the transformants as compared with untransformedMicrosporum canis(0.39 vs.1.00).Conclusion The constructed PCB309-PLULT interference vector can effectively inhibit the expression of PQ-LRP gene inMicrosporum canis.

Microsporum canis；RNA interference；Genes，PQ-LRP；Gene silencing

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.007

國家自然科學基金(81071330)

116011大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚性病科

楊國玲,Email:yanggl@medmail.com.cn

2013-11-20)

(本文編輯:吳曉初)