王偉瓊，王 沖，劉延方，郝倩倩，馬 杰

鄭州大學第一附屬醫(yī)院血液科 鄭州450052

#通訊作者，男，1962年5月生，教授，主任醫(yī)師，研究方向:血液系統(tǒng)惡性腫瘤的基礎及臨床，E-mail:liuyanfang@zzu.edu.cn

端粒重復序列結合蛋白1(telomeric repeat binding factor 1，TRF1)是第一個被鑒定出來的端粒結合蛋白。TRF1 由439 個氨基酸組成，通過抑制端粒酶和端粒末端的接近程度負向調(diào)控端粒的長度。在端粒酶陽性細胞中，過表達TRF1 將導致端粒長度的縮短，而TRF1 的功能缺失突變體則會導致端粒長度不正常的增加［1］。作者的前期研究［2］發(fā)現(xiàn):在有絲分裂期，TRF1 能夠定位于中心體且用siRNA 沉默TRF1 能夠?qū)е露鄻O紡錘體的出現(xiàn)，但TRF1 通過何種作用機制參與細胞周期的調(diào)控尚不清楚。該研究中，作者采用酵母雙雜交方法尋找與TRF1 相互作用的蛋白，為探討TRF1 在細胞有絲分裂期的調(diào)控機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 人宮頸癌HeLa 細胞株由鄭州大學血液病研究所保存。含有Flag 標記的p3XFLAG-myc-TRF1 真核表達質(zhì)粒由洛克菲勒大學Tetia de Lange 教授惠贈。胎牛血清購自Hyclone 公司，青、鏈霉素，DMEM 培養(yǎng)基及蛋白A 和蛋白G 瓊脂凝膠珠購自Invitrogen 公司，胰蛋白酶購自華美(SABC)公司。鼠抗Myc 單克隆抗體、鼠抗GST 單克隆抗體購自Cell Signaling 公司，鼠抗TRF1 單克隆抗體購自Abnova 公司，鼠抗SAM68 單克隆抗體購自Abcam 公司，羅丹明偶聯(lián)羊抗鼠IgG 抗體購自Jackson Immunoresearch 公司。AH109 酵母菌種以及pGBKT7、pEGST-C3 質(zhì)粒均由鄭州大學血液病研究所保存。人HeLa 細胞cDNA 文庫、MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3 試劑盒購自Clontech 公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、T4 DNA 連接酶、pyrobest 酶及相關緩沖液購自TaKaRa 公司，LipofectamineTM2000 購自Invitrogen 公司。

1.2 TRF1 誘餌蛋白表達載體的構建及鑒定 以含有TRF1 全長的p3XFLAG-myc-TRF1 真核表達質(zhì)粒為模板擴增TRF1 基因序列全長，測序后將TRF1全長片段亞克隆到酵母表達載體pGBKT7，少量提取質(zhì)粒;EcoRⅠ和SalⅠ酶切鑒定并測序證實。同法獲得pGBKT7-TRF1 和pEGST-TRF1 重組質(zhì)粒。將pGBKT7(陽性對照)和pGBKT7-TRF1 分別轉化AH109感受態(tài)酵母菌，接種于SDP/-Leu 培養(yǎng)板，30℃培養(yǎng)觀察，免疫印跡實驗檢測TRF1 蛋白的表達。

1.3 酵母雙雜交［3］實驗 以pGBKT7-TRF1 為誘餌質(zhì)粒篩選人HeLa 細胞cDNA 文庫，共篩選1×108個cDNA，經(jīng)β-半乳糖苷酶活性測定以及2 輪SD/-Trp/-Leu/X-α-gal 培 養(yǎng) 板 和2 輪SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/ X-α-gal 培養(yǎng)板篩選后，將陽性克隆提取質(zhì)粒，進行PCR 反應，將PCR 產(chǎn)物大小一致的質(zhì)粒行酶切以排除重復質(zhì)粒，進一步經(jīng)核苷酸序列測定，并與GenBank 數(shù)據(jù)庫進行同源性比較。

1.4 免疫共沉淀實驗 收集HeLa 細胞，加入RIPA緩沖液進行裂解，取2%的細胞裂解液作為樣品對照，剩余部分均分為2 份，1 份加入正常小鼠血清及蛋白A 和蛋白G 瓊脂凝膠珠(空白對照)，1 份加入正常小鼠血清、蛋白A 和蛋白G 瓊脂凝膠珠及1 μg鼠抗TRF1 單克隆抗體(免疫共沉淀組)，搖床上4℃旋轉過夜孵育以捕獲目的蛋白。將蛋白裂解物及免疫共沉淀復合物用上樣緩沖液加熱變性，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗TRF1 單克隆抗體和鼠抗SAM68 單克隆抗體檢測，再以相應二抗孵育后，用ECL 發(fā)光底物壓片顯影。

1.5 體外沉降實驗 GST 融合蛋白及GST-TRF1融合蛋白的體外表達及純化參照Qiagen 公司重組GST 蛋白純化樹脂說明書操作。體外沉降實驗操作步驟參照文獻［3］進行，共分為3組進行檢測:HeLa細胞裂解液經(jīng)RIPA 緩沖液預清除后，首先取20 μL裂解液作為內(nèi)參對照(內(nèi)參對照組)，再分別與GST對照蛋白(GST 對照蛋白組)和GST-TRF1 融合蛋白(GST-TRF1 融合蛋白組)共同孵育，隨后以SDSPAGE 電泳分離產(chǎn)物后，以抗GST 單克隆抗體及抗SAM68 單克隆抗體進行免疫印跡分析。

2 結果

2.1 TRF1 誘餌蛋白表達載體的構建 pGBKT7-TRF1 雙酶切結果見圖1。pGBKT7-TRF1 轉化菌株生長良好，與pGBKT7 轉化菌株生長速度無明顯差異，表明TRF1 蛋白對AH109 酵母菌沒有毒性。免疫印跡實驗證實pGBKT7-TRF1 能在AH109 酵母菌中正確表達，見圖2。

2.2 酵母雙雜交篩選結果 經(jīng)酵母雙雜交最終篩選出5 個與人TRF1 相互作用的蛋白，分別是人SAM68 蛋白、Cullin1 蛋白、Polo-like kinase 1(Plk1)蛋白、Hsp70 以及activating transcription factor/cAMP responsive element binding protein(ATF5 蛋白)。

2.3 SAM68 與TRF1 的免疫共沉淀和體外沉降實驗結果 在HeLa 細胞株中，內(nèi)源性TRF1 能夠與SAM68 抗體發(fā)生共沉淀反應，形成復合物，而與空白對照血清無結合(圖3)，表明TRF1 與SAM68 可能在細胞內(nèi)相互結合。GST-TRF1 能夠與SAM68 相結合，形成復合物，而GST 蛋白則不能將SAM68 沉淀下來(圖4)，提示TRF1 與SAM68 能夠在體外相互結合。

圖1 重組質(zhì)粒pGBKT7-TRF1 的鑒定

圖2 pGBKT7-TRF1 在酵母菌AH109 中的表達

圖3 SAM68 與TRF1 結合的免疫共沉淀結果

圖4 TRF1 與SAM68 的體外沉降實驗

3 討論

酵母雙雜交系統(tǒng)是以酵母遺傳系統(tǒng)為基礎，研究反式作用因子之間的相互作用對真核基因轉錄調(diào)控影響的一種技術。其最有價值的應用是用BD-X篩選由AD-Y 構成的cDNA 文庫，從而發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術不僅可用于鑒定新的蛋白質(zhì)相互作用，證實可疑相互作用，確定相互作用的結構域，而且可直接獲得編碼相互作用蛋白質(zhì)的基因。

端粒是存在于真核生物線性染色體末端由核酸DNA 重復序列和蛋白質(zhì)組成的特殊保護性結構，對于維持染色體的完整性和基因組的穩(wěn)定性具有極其重要的生物學意義。端粒異常將導致染色體不穩(wěn)定，而染色體的不穩(wěn)定性與細胞衰老及腫瘤發(fā)生密切相關。端粒長度和結構的維持受端粒結合蛋白的調(diào)控。TRF1 是以端粒序列(TTAGGG)27 為探針，從HeLa 細胞核裂解產(chǎn)物中分離純化獲得的第一個人端粒雙鏈結合蛋白［1］，它以同源二聚體的形式直接與端粒雙鏈DNA 結合，通過調(diào)控端粒酶的活性以及端粒酶和端粒DNA 的接近程度，起到維持端粒長度與結構穩(wěn)定的作用［4-5］。已有研究［6］顯示，TRF1在包括急性白血病在內(nèi)的多種腫瘤中表達下調(diào)，而過量表達外源性TRF1 將促使細胞提前進入有絲分裂期并發(fā)生凋亡。另有研究［7］表明，TRF1 能夠參與細胞有絲分裂期的調(diào)控，在中心體形成的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，但其具體作用機制及修飾途徑目前仍不清楚。

該研究中，作者采用酵母雙雜交系統(tǒng)，以pGBKT7-TRF1 為誘餌篩選人HeLa 細胞cDNA 文庫，成功篩選出一批TRF1 的新的結合蛋白，并首次發(fā)現(xiàn)SAM68 可以與TRF1 在體內(nèi)和體外相互作用。SAM68 是一個RNA 結合蛋白，在RNA 的剪切和轉運過程中起調(diào)控作用［8］;此外，SAM68 在細胞有絲分裂調(diào)節(jié)以及腫瘤的轉移過程中亦起到重要的調(diào)節(jié)作用［9］。該項研究首次表明端粒結合蛋白TRF1 能夠與RNA 結合蛋白SAM68 發(fā)生相互作用，這為進一步研究端粒結合蛋白在細胞有絲分裂時相的調(diào)節(jié)及RNA 在調(diào)控和轉運過程中的功能提供了新的研究線索，也為進一步研究TRF1 對細胞周期和凋亡調(diào)控的影響提供了新的實驗證據(jù)。

綜上所述，作者鑒定出了5 個新的與TRF1 相互作用的蛋白質(zhì);通過體內(nèi)及體外結合實驗證實了SAM68 是一個新的TRF1 結合蛋白。TRF1 有可能是一個新的連接端粒和細胞有絲分裂調(diào)控的通路蛋白，其可能通過與SAM68 的結合參與RNA 剪切及轉運過程的調(diào)控;選擇TRF1 作為基因治療的靶點，可能為腫瘤的靶向治療提供新的線索。

［1］van Steensel B，de Lange T.Control of telomere length by the human telomeric protein TRF1［J］.Nature，1997，385(6618):740

［2］Zhu Y，Wang C，Lan J，et al.Phosphorylation of Tara by Plk1 is essential for faithful chromosome segregation in mitosis［J］.Exp Cell Res，2012，318(18):2344

［3］王沖，余建，黃河.Plk1 磷酸化修飾PinX1 對宮頸癌He-La 細胞有絲分裂及凋亡的影響［J］.鄭州大學學報:醫(yī)學版，2013，48(3):323

［4］Chong L，van Steensel B，Broccoli D，et al.A human telomeric protein［J］.Science，1995，270(5242):1663

［5］Poulet A，Pisano S，F(xiàn)aivre-Moskalenko C，et al.The N-terminal domains of TRF1 and TRF2 regulate their ability to condense telomeric DNA［J］.Nucleic Acids Res，2012，40(6):2566

［6］Zhou XZ，Lu KP.The Pin2/TRF1-interacting protein PinX1 is a potent telomerase inhibitor［J］.Cell，2001，107(3):347

［7］Zhu Q，Meng L，Hsu JK，et al.GNL3L stabilizes the TRF1 complex and promotes mitotic transition［J］.J Cell Biol，2009，185(5):827

［8］Itoh M，Haga I，Li QH，et al.Identification of cellular mRNA targets for RNA-binding protein Sam68［J］.Nucleic Acids Res，2002，30(24):5452

［9］Li Z，Yu CP，Zhong Y，et al.Sam68 expression and cytoplasmic localization is correlated with lymph node metastasis as well as prognosis in patients with early-stage cervical cancer［J］.Ann Oncol，2012，23(3):638