何光耀，謝 貌，唐安洲，譚頌華

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 南寧530021

#通訊作者，男，1962年3月生，教授，研究方向:抗鼻咽癌中藥研究，E-mail:anzhoutang@126.com

鼻咽癌是我國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，其主要的治療方式是以放療為主、化療為輔的綜合治療，但放化療具有明顯的副作用，為此需要找尋一種更安全有效的治療方式［1］。苦參堿(matrine)是從中藥苦參中提取的一種生物堿類(lèi)活性成分，具有抗心律失常、抗炎、抗纖維化、抗腫瘤等多方面藥理活性，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡［2］。該實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)觀察苦參堿對(duì)人鼻咽癌CNE2 細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及其凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，初步探討苦參堿抗腫瘤作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 苦參堿(純度≥98%)購(gòu)于陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司，用培養(yǎng)液配制成相應(yīng)濃度溶液，過(guò)濾除菌，4℃保存。Trizol 購(gòu)于Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Fermentas 公司，二甲基亞砜(DMSO)、MTT、RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、EDTA 胰蛋白酶及BCA 蛋白濃度測(cè)量試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基及青霉素、鏈霉素均購(gòu)于美國(guó)Hyclone 公司。培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo 公司產(chǎn)品。倒置顯微鏡為日本Olympus 公司產(chǎn)品。PCR 儀為美國(guó)ABI 公司產(chǎn)品。SCV4A1 型超凈工作臺(tái)購(gòu)于新加坡ESCO 公司。

1.2 裸鼠移植瘤模型的制備 人鼻咽癌CNE2 細(xì)胞株由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心鼻咽癌實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，接種于含100 U/mL 青霉素、鏈霉素及體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化傳代。于裸鼠右前腋皮下接種胎牛血清重懸的CNE2 細(xì)胞懸液0.2 mL(約1×107mL－1)，制備裸鼠移植瘤模型，以瘤體直徑達(dá)到5 mm 且質(zhì)硬為成瘤。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 20 只BALB/C 裸鼠由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，鼠齡4～6 周，體重(20±2)g，雌雄不拘，按1.2 方法制備裸鼠移植瘤模型。成瘤后，隨機(jī)分成苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組，每組5 只。藥物用無(wú)菌生理鹽水溶解?？鄥A高、低劑量組分別腹腔注射100、50 mg/kg 苦參堿，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射順鉑2 mg/kg，陰性對(duì)照組給予生理鹽水10 mL/kg。隔日給藥1 次，共給藥7 次。

1.4 抑瘤率的測(cè)定 給藥14 d 后，頸椎脫臼處死裸鼠，剖出瘤體，測(cè)量瘤重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(1 － 給藥組平均瘤重/陰性對(duì)照組平均瘤重)×100%。

1.5 移植瘤組織中bax、bcl-2、caspase-3 mRNA 的檢測(cè) 按照Trizol 試劑說(shuō)明提取移植瘤組織總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)后，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行PCR。GAPDH 上游引物序列為5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物序列為5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3';bax 上游引物序列為5'-ATGGACGGGTCCGGGGAGCA-3'，下游引物序列為5'-TGCTCGATCCTGGATGAAACCCT-3';bcl-2 上游引物序列為5'-TCGCCCTGTGGATGACTGAG-3'，下游引物序列為5'-CAGAGTCTTCAGAGACAGC CAGGA-3';caspase-3 上游引物序列為 5'-TG CATACTCCACAGCACCTGGTTA-3' 下游引物序列為5'-CATGGCACAAAGCGACTGGATGAA-3'。PCR 反應(yīng)體系20 μL，包括10× PCR buffer 2 μL，MgCl2buffer(25 mmol/L)1.6 μL，dNTPs(10 mmol/L)2 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.1 μL，ddH2O 11.3 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;94℃30 s，56～60℃退火30 s，72℃30 s，循環(huán)30 次;72℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳成像，采用Image pro plus 6.0 圖像軟件分析，目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量=目的基因條帶吸光度/GAPDH 條帶吸光度。

1.6 移植瘤組織中bax、bcl-2、caspase-3 蛋白的檢測(cè) 瘤體經(jīng)過(guò)勻漿機(jī)處理后離心，棄上清，加入含有10 μL PMSF 的RIPA 裂解液1 000 μL，冰上裂解細(xì)胞30 min，4℃12 000 g 離心15 min，收集細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)蛋白濃度。取蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離，切膠，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用50 g/L 脫脂牛奶室溫封閉2 h，用抗兔bax、bcl-2、caspase-3 抗體(稀釋1 000 倍)及HRP 標(biāo)記的GAPDH(稀釋10 000倍)4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜5 min×3 次，HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG(稀釋1 000 倍)室溫孵育2 h，TBST 洗滌5 min×3 次，ECL 顯影，壓片，在凝膠成像儀上成像，用Image pro plus 6.0 分析圖像，目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶吸光度/GAPDH 條帶吸光度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 處理數(shù)據(jù)。4組抑瘤率、瘤組織中相應(yīng)蛋白和mRNA 表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組抑瘤率的比較 20 只裸鼠均達(dá)到成瘤標(biāo)準(zhǔn)。給藥14 d 后，陽(yáng)性對(duì)照組和苦參堿低、高劑量組抑瘤率分別為51.6%、26.4%和43.2%。

2.2 4組移植瘤組織中bax、bcl-2、caspase-3 mRNA 表達(dá)的比較 見(jiàn)表1。

表1 4組移植瘤組織中bax、bcl-2 和caspase-3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

2.3 移植瘤組織中bax、bcl-2、caspase-3 蛋白的表達(dá) 見(jiàn)圖1、表2。

圖1 4組移植瘤組織中bax、bcl-2、caspase-3 蛋白的表達(dá)

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及消退與細(xì)胞凋亡異常有著密切的關(guān)系，而大多數(shù)的抗腫瘤藥物均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［3］。半胱天冬氨酸酶caspase 和bcl-2 基因家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Caspase作為細(xì)胞凋亡的核心，參與啟動(dòng)和執(zhí)行細(xì)胞凋亡，其中caspase-3 是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。細(xì)胞接受凋亡信號(hào)后，caspase 系統(tǒng)激活，啟動(dòng)caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，活化caspase-3，執(zhí)行凋亡。bcl-2 和bax 均是bcl-2家族重要成員，bax 能與bcl-2 結(jié)合形成二聚體，抑制或者促進(jìn)細(xì)胞凋亡。bax 表達(dá)增高、bcl-2 表達(dá)減少能活化caspase-3，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而bcl-2 表達(dá)增高、bax 表達(dá)減少則抑制caspase-3 活化，細(xì)胞凋亡也相應(yīng)受抑制［4-5］。

苦參堿是一種生物活性堿，其毒副作用低，生物活性高，可以體外抑制神經(jīng)母細(xì)胞癌、卵巢癌、白血病、腎癌、鼻咽癌等細(xì)胞的生長(zhǎng)［6-10］。該研究中，作者建立了裸鼠CNE2 移植瘤模型，觀察了苦參堿對(duì)移植瘤生長(zhǎng)及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。

有資料顯示，苦參堿可以抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901 的增殖，通過(guò)升高caspase-3 表達(dá)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［11］;也可以降低白血病細(xì)胞HL-60、U937 的bcl-2/bax 比值，增加p-Akt、p-Erk 的表達(dá)，誘導(dǎo)凋亡［3］。研究［12］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)0.1 g/L 的苦參堿可導(dǎo)致白血病細(xì)胞K562 體積變小、核固縮、碎裂，細(xì)胞內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)也呈凋亡早期改變。該研究中作者發(fā)現(xiàn)，苦參堿能明顯抑制移植瘤的生長(zhǎng);同時(shí)，苦參堿可以上調(diào)移植瘤組織中bax 和caspase-3 mRNA 和蛋白的表達(dá)，下調(diào)bcl-2 mRNA 和蛋白的表達(dá)，說(shuō)明苦參堿能明顯改變鼻咽癌CNE2 細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。推測(cè)苦參堿可能是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，發(fā)揮體內(nèi)抗腫瘤作用。

總之，苦參堿的抗腫瘤作用與誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。但苦參堿是如何通過(guò)具體通路發(fā)揮抑瘤作用尚未明確，是否與MAPK、PI3K-AKT 等細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)［13］，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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