李 靜，王 菲，劉艷芬，王麗萍，許鈺杰，王 盟，張 斌，張 毅

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州450052 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物治療中心 鄭州450052 3)鄭州大學生物工程系鄭州450001 4)鄭州大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科鄭州450052 5)美國西北大學醫(yī)學院芝加哥60611 6)河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室鄭州450052

#通訊作者，男，1964年4月生，博士，教授，研究方向:腫瘤免疫學、腫瘤干細胞和生物細胞治療，E-mail:yizhang@zzu.edu.cn

初始狀態(tài)T 細胞和記憶性T 細胞在特異性免疫應答時僅分泌少量的細胞因子，但在刺激物作用下，淋巴細胞發(fā)生活化，可以分泌大量的細胞因子［1］。佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)和離子霉素作為淋巴細胞激活劑被應用于刺激淋巴細胞增殖及分泌細胞因子等多種實驗研究中［2］。在抗腫瘤的淋巴細胞治療中，在培養(yǎng)臨床應用級別的淋巴細胞時，抗CD3 單抗和抗CD28 單抗作為刺激劑聯(lián)合應用可有效增強淋巴細胞的細胞毒性和增殖能力［3］，因此，在這些培養(yǎng)后的淋巴細胞臨床應用前，可應用抗CD3 單抗和抗CD28 單抗來判斷其功能和活性。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cell，CIK 細胞)是一群異質(zhì)性免疫活性細胞，具有較強的抗腫瘤能力［4］。該研究比較了抗CD3單抗聯(lián)合不同濃度抗CD28 單抗對CIK 細胞IFN-γ、IL-10、TNF-α、IL-2 及穿孔素(perforin)分泌的影響，為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 外周血標本來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院確診為癌癥的6例患者，標本均征得患者同意并簽訂知情同意書后采集。

1.2 主要試劑與儀器 PMA、離子霉素、布雷桿氏菌素A(BFA)、皂苷等均購自美國Sigma 公司，抗CD3 單抗和抗CD28 單抗購自美國BD PharMingen公司，重組人IL-2 購自北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司，重組人IFN-γ 購自上海凱茂藥業(yè)有限公司，淋巴細胞分離液購自上海華精生物高科技有限公司，Hyclone RPMI 1640 培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學制品有限公司，胎牛血清購自Gibco 公司。各種免疫熒光抗體(FITC-perforin、PE-IFN-γ、PerCP-CD8、APC-CD4、PE-CY7-CD3)均購自德國美天旎公司。IL-10、IL-2、IFN-γ、TNF-α ELISA 檢測試劑盒購自美國Biolegend 公司。流式細胞儀購自美國BD 公司。

1.3 實驗分組 將6例患者的外周血混合，取10 mL，肝素鈉抗凝，1 500 r/min 離心10 min，按文獻［5］方法處理，用IFN-γ、CD3、IL-2 誘導培養(yǎng)，第13天CIK 細胞成熟。取部分CIK 細胞，PBS 洗滌后計數(shù)，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為1×106mL－1，于24 孔板中分4組進行培養(yǎng)，分別加入50 μg/L PMA 和750 μg/L 離子霉素(對照組)、1.0 mg/L 抗CD3 單抗和2.5 mg/L 抗CD28 單抗(A組)、1.0 mg/L 抗CD3單抗和1.0 mg/L 抗CD28 單抗(B組)、1.0 mg/L 抗CD3 單抗和0.5 mg/L 抗CD28 單抗(C組)，于體積分數(shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組6 個復孔。

1.4 觀測指標

1.4.1 胞內(nèi)因子染色法檢測CIK 細胞中IFN-γ 和穿孔素的表達情況 培養(yǎng)3 h 后，各組細胞加入阻斷劑BFA 1 mg/L，充分混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后收獲細胞。加入相應抗體(PE-CY7-CD3、PerCP-CD8、APC-CD4)室溫避光孵育15 min，多聚甲醛固定20 min，用破膜劑皂苷破膜后加入胞內(nèi)抗體(FITC-perforin、PE-IFN-γ)共孵育30 min，PBS 洗一次，上流式細胞儀檢測。

1.4.2 ELISA 法檢測CIK 細胞IL-2、IFN-γ、IL-10和TNF-α 的分泌水平 培養(yǎng)24 h 后收獲各組細胞，離心后取上清，采用ELISA 法進行IL-2、IFN-γ、IL-10、TNF-α 的檢測，按試劑盒說明書操作。采用CurveExpert 1.3 Elisa 軟件計算細胞因子濃度。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0 進行處理。4組細胞因子表達水平和分泌水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，檢驗水準α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組CIK 細胞中細胞因子表達情況的比較見表1。

表1 4組CIK 細胞中細胞因子表達水平的比較

2.2 4組CIK 細胞細胞因子分泌水平的比較 見表2。

表2 4組CIK 細胞細胞因子分泌水平的比較

3 討論

PMA 和離子霉素為非特異性刺激物，常常用于刺激淋巴細胞增殖或分泌功能的研究，然而這種共刺激僅能用于體外實驗，不能應用于臨床。有研究［6］表明，低于75 μg/L 的PMA 和低于10 mg/L 的離子霉素共刺激不會引起淋巴細胞表面標記物表達的改變，因此該研究中，作者采用50 μg/L 的PMA和750 μg/L 的離子霉素進行共刺激作為對照。目前國內(nèi)外多將抗CD3/CD28 抗體聯(lián)合用于T 淋巴細胞的體外激活，并將殺傷性T 淋巴細胞回輸給患者殺傷腫瘤細胞［7-8］。在抗CD28 抗體的協(xié)同作用下，抗CD3 抗體的刺激活性明顯提高［8-9］，因此臨床上采用抗CD28 抗體協(xié)同抗CD3 抗體體外活化T 淋巴細胞［10-11］。該研究探討了1.0 mg/L 抗CD3 單抗聯(lián)合不同濃度抗CD28 單抗對CIK 細胞細胞因子分泌水平的影響。結(jié)果表明，不同濃度的抗CD28 單抗聯(lián)合抗CD3 單抗對CIK 細胞細胞因子分泌的影響差異無臨床意義，考慮到費用，臨床上可選用1.0 mg/L 抗CD3 單抗聯(lián)合0.5 mg/L 抗CD28 單抗作為刺激物用于T 淋巴細胞的活化。

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