張朝甲，張 穎，劉 璐，杜 路，周雅麗，權(quán)松霞，邢國蘭

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科 鄭州450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州450052 3)鄭州大學(xué)腎臟病研究所鄭州450052

#通訊作者，女，1964年8月生，博士，教授，研究方向:慢性腎功能衰竭的防治，E-mail:xgl@zzu.edu.cn

隨著社會(huì)的發(fā)展、人類的生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者數(shù)量呈逐年上升趨勢(shì)。流行病學(xué)調(diào)查［1］顯示目前我國20歲以上的成人DM 患病率為9.7%(男性10.6%，女性8.8%)。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是DM 的一種重要微血管并發(fā)癥，它不僅加重了DM 患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且造成病死率增加，嚴(yán)重影響人類的健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。DN 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制目前尚不清楚。以往對(duì)DN 發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在高血糖所致的多元醇通路激活、蛋白質(zhì)非酶糖化、氧化應(yīng)激、脂代謝紊亂等方面［2］，治療主要集中在控制血糖、血壓、應(yīng)用糖基化阻斷劑、低蛋白飲食、調(diào)整血脂代謝方面，然而從以上幾方面著手并不能十分有效地干預(yù)DN 的發(fā)生發(fā)展，這提示尚有其他機(jī)制參與DN 的發(fā)病。有文獻(xiàn)［3］報(bào)道，補(bǔ)體通過旁路途徑、甘露聚糖結(jié)合凝集素途徑活化后參與DN 的發(fā)病過程。補(bǔ)體活化過程中產(chǎn)生過敏毒素C3a、C5a，是補(bǔ)體致炎的主要分子，而C3a、C5a 通過與相應(yīng)受體C3aR、C5aR 結(jié)合發(fā)揮作用。目前C3a、C5a 與DN 關(guān)系的國內(nèi)外報(bào)道均十分有限。作者檢測(cè)了不同病理損傷級(jí)別DN 患者腎臟組織中C3aR、C5aR 的表達(dá)情況，探討C3aR、C5aR 與DN 的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 病例選擇和血液相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 選取2012年1月至2013年5月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科住院行腎穿刺活檢術(shù)并經(jīng)臨床和病理診斷為DN 患者的石蠟標(biāo)本共45例，按照病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［4］分為Ⅰ+Ⅱ級(jí)(13例)、Ⅲ級(jí)(21例)、Ⅳ級(jí)(11例)。選取10例同期在泌尿外科住院行腎臟腫瘤切除術(shù)患者遠(yuǎn)離腫瘤的腎臟組織石蠟標(biāo)本作為正常對(duì)照，均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)無病變。DN 患者均在入院后第2天清晨空腹抽取肘靜脈血，常規(guī)方法進(jìn)行血液相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2 腎臟組織中C3aR、C5aR 表達(dá)的免疫組化檢測(cè) 石蠟標(biāo)本按3 μm 厚度連續(xù)切片。染色步驟按免疫組化PV 二步法試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行。兔抗人C3aR 多克隆抗體(Santa Cruz 公司，美國)按1∶100 稀釋，小鼠抗人C5aR 單克隆抗體(Abd Serotec 公司，英國)按1∶1 000稀釋，DAB 顯色，中性樹膠封片，晾干后在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。用PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。C3aR、C5aR 均以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆?；蛘唿S色顆粒為染色陽性細(xì)胞。每張切片選取10 個(gè)不重疊視野，高倍鏡下計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比［5］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 進(jìn)行分析。所有計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn);應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t 檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)比較DN 患者臨床資料的差異;應(yīng)用Spearman 相關(guān)性分析評(píng)判DN 患者腎臟病理損傷級(jí)別、腎組織中C3aR 和C5aR 的表達(dá)情況與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組DN 患者臨床資料的比較 見表1。

表1 DN 患者臨床資料

2.2 DN 患者腎臟病理損傷級(jí)別與部分臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 DN 病理損傷級(jí)別與24 h 尿蛋白定量、血肌酐、血尿素氮、C-反應(yīng)蛋白呈正相關(guān)，而與血清C3、紅細(xì)胞沉降率、平均動(dòng)脈壓無相關(guān)性(表2)。

表2 DN 患者腎臟病理損傷級(jí)別與部分臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

2.3 各組腎臟組織中C3aR、C5aR 的表達(dá) 正常腎臟組織中可見少量腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)C3aR 和C5aR，腎小球及腎間質(zhì)未見。DN 患者腎臟組織中C3aR 和C5aR 于腎小管上皮細(xì)胞表面表達(dá)尤為顯著，在腎小球系膜細(xì)胞、包曼囊壁層上皮細(xì)胞及間質(zhì)浸潤的炎性細(xì)胞表面也有不同程度的表達(dá)(圖1)，并且隨著腎臟病理損傷級(jí)別的增加C3aR 和C5aR的表達(dá)逐漸增強(qiáng)(表3)。

2.4 DN 患者腎臟組織中C3aR、C5aR 陽性表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 各組DN 患者腎臟組織中C3aR、C5aR 陽性細(xì)胞百分比均與24 h 尿蛋白定量、血肌酐、血尿素氮、紅細(xì)胞沉降率、C-反應(yīng)蛋白呈正相關(guān)，而與血清C3、平均動(dòng)脈壓無相關(guān)性(表4)。

圖1 各組腎臟組織中C3aR、C5aR 的表達(dá)(PV，×200)

表3 各組腎臟組織中C3aR、C5aR 陽性細(xì)胞百分比比較 %

表4 DN 患者腎臟組織中C3aR、C5aR 陽性細(xì)胞百分比與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

C3a、C5a 是補(bǔ)體激活后所產(chǎn)生的最主要的致炎癥補(bǔ)體裂解產(chǎn)物，其誘發(fā)的炎癥反應(yīng)是由特異的受體C3aR、C5aR 介導(dǎo)的。段喜梅等［6］應(yīng)用免疫組化及ELISA 方法研究發(fā)現(xiàn)C3a、C5a 在IgA 腎病病理損傷過程中起重要作用。有學(xué)者［7］發(fā)現(xiàn)C3a、C5a可促進(jìn)腎臟缺血再灌注損傷，C5aR 拮抗劑能夠降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥介質(zhì)的表達(dá)、降低趨化因子表達(dá)水平并減少單核細(xì)胞的浸潤。

C3a、C5a 與其相應(yīng)受體C3aR、C5aR 可產(chǎn)生擴(kuò)張血管、增加血管通透性、趨化炎癥細(xì)胞、引起炎癥反應(yīng)等效應(yīng)［8］。該研究發(fā)現(xiàn)DN 患者的腎臟組織的確存在不同程度的炎性細(xì)胞浸潤，而持續(xù)的炎性細(xì)胞浸潤又與腎間質(zhì)纖維化、腎臟病理損傷加重等關(guān)系密切，考慮這一現(xiàn)象可能與C3aR、C5aR 表達(dá)增多、趨化炎癥細(xì)胞效應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，但需相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。同時(shí)該研究在不同病理損傷級(jí)別DN 患者的腎臟組織中均檢測(cè)出C3aR、C5aR 表達(dá);與正常對(duì)照組腎臟組織相比，除在腎小管上皮細(xì)胞胞膜均有C3aR、C5aR 表達(dá)外，DN 患者的腎小管基底膜、包曼囊壁層上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)浸潤的炎癥細(xì)胞亦有C3aR、C5aR 表達(dá)，且隨DN 患者腎臟病理損傷程度的加重而表達(dá)逐漸增強(qiáng)。以上研究提示C3a、C5a與C3aR、C5aR 結(jié)合后，參與DN 患者腎小球、腎小管以及腎小管間質(zhì)病變的損傷過程。

DN 患者腎臟病理損傷級(jí)別及C3aR、C5aR 在腎臟組織中的表達(dá)情況均與評(píng)估腎臟狀況的臨床指標(biāo)(如:24 h 尿蛋白定量、血肌酐、血尿素氮)呈正相關(guān)。同時(shí)結(jié)合該研究的免疫組化及相關(guān)數(shù)據(jù)分析可知，DN 患者腎臟病理損傷程度較重者，其腎臟組織C3aR、C5aR 表達(dá)較強(qiáng)。由此可見C3aR 和C5aR 在DN 患者腎臟組織的表達(dá)增強(qiáng)，對(duì)DN 患者腎臟組織造成不同程度的損傷，可能參與DN 的進(jìn)展。

綜上所述，C3aR、C5aR 在DN 患者腎臟病理損傷過程中起促進(jìn)作用，可影響疾病的進(jìn)展。該研究結(jié)果為尋找DN 治療的新靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

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