鄧 鑫，宋來君，郭新賓

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科鄭州450052

#通訊作者，男，1952年9月生，教授，主任醫(yī)師，研究方向:神經(jīng)外科的基礎(chǔ)與臨床，E－mail:laijunsong@126.com

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細(xì)胞，可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞，如神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等［1］，周圍外環(huán)境可對其分裂增殖以及分化等產(chǎn)生顯著影響。以往對神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)通常采用普通平面培養(yǎng)方式，與其體內(nèi)生長環(huán)境有較大差異。Matrigel 膠是從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS 小鼠腫瘤中分離出的一種細(xì)胞外基質(zhì)，包含如層連接蛋白、Ⅳ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)［2］，可構(gòu)建適于細(xì)胞生長的三維立體支架。Irons 等［3］將神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞嵌入到Matrigel 膠基底膜基質(zhì)中，構(gòu)建適于細(xì)胞生長的三維平臺，結(jié)果顯示Matrigel 膠中的神經(jīng)元伸出長的突起，表達(dá)成熟神經(jīng)元特異性的細(xì)胞骨架蛋白，且用膜片鉗檢測到了電生理學(xué)信號，表明了功能性突觸的形成。同樣有研究［4］表明，Matrigel 膠有助于雪旺細(xì)胞的延伸和生長。作者通過將體外培養(yǎng)的海馬NSCs 接種于Matrigel 膠內(nèi)，觀察Matrigel 膠形成的立體支架對于NSCs 的影響，以研究立體培養(yǎng)對于NSCs 增殖及分化的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑 出生24 h 內(nèi)的SD 大鼠，SPF 級，雌雄不限，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。DMEM/F12 培養(yǎng)基(Hyclone 公司)，B27 Supplement(50×，Gibco 公司)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF，Invitrogen 公司)，表皮細(xì)胞生長因子(EGF，Gibco公司)，青-鏈雙抗(Solarbio 公司)，小鼠抗大鼠巢蛋白(Nestin)單克隆抗體、羊抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)單克隆抗體(Santa Cruz 公司)，兔抗大鼠β-tubulinⅢ蛋白單克隆抗體(EPITOMICS 公司)，SABC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG多克隆抗體、SABC-HRP、SABC-FITC(武漢博士德公司)，Dylight594 標(biāo)記驢抗羊多克隆抗體、FITC 標(biāo)記驢抗兔多克隆抗體(Immunoreagents 公司)。Matrigel 膠(美國BD 公司)訂購于2013年3月，有效期3 個月，冰上融化分裝為1 mL 后置于－20℃保存。

1.2 NSCs 的培養(yǎng) 取新生SD 大鼠，乙醇消毒后于超凈工作臺內(nèi)去頭處死，取海馬區(qū)腦組織剪碎，胰蛋白酶消化8 min 后加入胎牛血清終止，輕柔吹打后以1 200 r/min離心4 min，棄上清，沉淀以PBS 混懸液吹打、離心，重復(fù)2 次后以正常培養(yǎng)基(DMEM/F12 培養(yǎng)基按體積比1∶50 比例加入B27 Supplement 和20 ng/L bFGF、20 ng/L EGF、40 U/mL 肝素)混懸，200 目篩網(wǎng)過濾后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×106mL－1接種25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察，每3 d 換液1 次。原代培養(yǎng)7 d 后進(jìn)行傳代，傳代后每3 d 換液1 次，每7 d 傳代1 次。

1.3 NSCs 的鑒定 將傳至第3 代的細(xì)胞接種至包被多聚賴氨酸的24 孔板中，過夜后去除培養(yǎng)基，PBS沖洗3 次后用多聚甲醛固定，4℃過夜，吸棄多聚甲醛，PBS 沖洗5 min，連續(xù)3 次后加入體積分?jǐn)?shù)3%H2O2甲醇溶液作用10 min，PBS 沖洗5 min(3 次)，吸去PBS，加入50 g/L BSA 室溫封閉1 h 后吸去BSA，加入以抗體稀釋液稀釋至1∶200 的小鼠抗大鼠Nestin 蛋白單克隆抗體(對照組僅加入抗體稀釋液)，4℃過夜后，吸棄抗體，PBS 沖洗5 min，連續(xù)3 次，加入SABC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 多克隆抗體(1∶100 稀釋)，37℃30 min 后，吸棄抗體，PBS 沖洗5 min，連續(xù)3 次，加入SABC-HRP 作用20 min，PBS 沖洗5 min，連續(xù)4 次后，加入DAB 顯色液顯色，顯微鏡下控制顯色，約2 min 后吸棄顯色液，鏡下觀察，拍照。

1.4 NSCs 的接種培養(yǎng) 24 孔板第1、2 排12 孔內(nèi)加入200 μL 多聚賴氨酸靜置過夜包被。將傳至第3 代的NSCs 吹打混勻，取一半均勻接種至包被多聚賴氨酸的孔內(nèi);另一半1 200 r/min 離心4 min，離心管內(nèi)保留0.5 mL 上清液，玻璃吸管輕柔吹打混勻后與2 mL Matrigel 膠混勻，以200 μL/孔接種于第3、4排孔內(nèi)。接種完成后放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h，顯微鏡下觀察神經(jīng)球貼壁、Matrigel 膠凝固后去除原培養(yǎng)基，在第1、3 排孔內(nèi)加入正常培養(yǎng)基，分別標(biāo)記為A組、C組;第2、4 排孔內(nèi)加入血清培養(yǎng)基(DMEM/F12 培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清)，分別標(biāo)記為B組、D組，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液，連續(xù)培養(yǎng)1 周。

1.5 NSCs 接種培養(yǎng)后細(xì)胞中Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP 蛋白的免疫熒光染色檢測 NSCs 接種1 周后，吸棄培養(yǎng)基，40 g/L 多聚甲醛固定過夜后，4組各取6 孔，分別進(jìn)行Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP 蛋白免疫熒光染色，一抗均按1∶200 稀釋，并以DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色后，在200 倍熒光顯微鏡下觀察、拍照。通過Image-Pro Plus 6 軟件分析所得圖片，以陽性熒光染色細(xì)胞個數(shù)比DAPI 藍(lán)色熒光染色的細(xì)胞核個數(shù)，得到陽性率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 進(jìn)行分析，應(yīng)用2×2 析因設(shè)計(jì)的方差分析比較4組NSCs 中Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP 蛋白免疫熒光染色陽性率的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NSCs 的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 顯微鏡下觀察，原代提取細(xì)胞剛接種時呈單個懸浮圓形細(xì)胞，邊界清楚，胞核大，胞質(zhì)折光性強(qiáng)(圖1A);3 d 后開始出現(xiàn)小的細(xì)胞球，由5～8 個細(xì)胞組成(圖1B);原代培養(yǎng)4～5 d，細(xì)胞球增大，形成約幾十個細(xì)胞組成的細(xì)胞球(圖1C);第7 天左右，形成約幾百個細(xì)胞組成的細(xì)胞球(圖1D)。NSCs 傳代后形成單細(xì)胞和少量小細(xì)胞球組成的細(xì)胞懸液，傳代第2～3 天小細(xì)胞球形成，至第5 天形成約幾百個細(xì)胞組成的細(xì)胞球。第3 代細(xì)胞經(jīng)Nestin 免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，鏡下可見神經(jīng)球大部分細(xì)胞胞質(zhì)深棕色染色，呈陽性(圖2A)，對照組神經(jīng)球細(xì)胞呈淡黃色(圖2B)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示神經(jīng)球內(nèi)細(xì)胞Nestin 蛋白高表達(dá)，證實(shí)為NSCs。

圖1 海馬NSCs 形態(tài)學(xué)觀察(A:×200;B、C、D:×400)

圖2 Nestin 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果(SABC-HRP 法，×400)

2.2 4組NSCs 第3 代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 A組NSCs貼壁后，分化較為緩慢，遷出細(xì)胞較其他3組少，神經(jīng)球結(jié)構(gòu)保留，遷出細(xì)胞以神經(jīng)球?yàn)橹行难乜椎灼矫娣派錉钸w出(圖3A);B組細(xì)胞分化迅速，神經(jīng)球結(jié)構(gòu)大多消失，分化細(xì)胞形成平面的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3B);C組細(xì)胞分化較A組明顯，遷出細(xì)胞明顯增多，神經(jīng)球結(jié)構(gòu)存在，較A組偏小，遷出細(xì)胞以神經(jīng)球?yàn)橹行模蚋鞣较蛄Ⅲw放射(圖3C);D組細(xì)胞分化明顯，神經(jīng)球結(jié)構(gòu)消失，形成立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3D)。

2.3 4組NSCs 中Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP 蛋白表達(dá)的比較 見圖4、表1。

圖3 4組NSCs 形態(tài)學(xué)觀察(×200)

圖4 Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP 蛋白免疫熒光染色結(jié)果

表1 4組NSCs 中Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP 蛋白的表達(dá)(n=6)%

3 討論

干細(xì)胞最早接觸的細(xì)胞外基質(zhì)就是基底膜，在胚胎發(fā)育中，基底膜成分是最早合成的細(xì)胞外基質(zhì)，在二細(xì)胞期就有Lamrnin 表達(dá)。Lamrnin 是一種可溶性的大分子糖蛋白，分布在細(xì)胞外基質(zhì)中，其分子上存在某些細(xì)胞表面粘附分子的結(jié)合位點(diǎn)，以此促進(jìn)細(xì)胞的粘附、生長與分化［5］，眾多體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明，Lamrnin 可以促進(jìn)軸突的生長，被廣泛地應(yīng)用于引導(dǎo)軸突損傷后的定向生長、再生，以及細(xì)胞的遷移等組織工程研究［6］。Lamrnin 是Matrigel 膠中主要的促進(jìn)分化的因子。Matrigel 膠能促進(jìn)很多不同類型的細(xì)胞系或原代培養(yǎng)細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上和基因表型中表現(xiàn)出分化的表型［7］。有研究［8-9］報道Matrigel 膠中細(xì)胞分化的情況與具體的細(xì)胞種類有關(guān)，細(xì)胞與細(xì)胞間可發(fā)生三維立體聯(lián)系，組成與組織來源近似的結(jié)構(gòu)。此外，Matrigel 膠還含有多種細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白酶和生長因子等，均能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、遷移，且Matrigel 膠的最大優(yōu)點(diǎn)在于其組成成分以及比例與體內(nèi)基質(zhì)膜相同，可以塑造與體內(nèi)相似的生長環(huán)境，是理想的體外培養(yǎng)平臺。

作者在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用Matrigel 膠為NSCs 創(chuàng)造三維立體培養(yǎng)環(huán)境，以觀察在模擬體內(nèi)環(huán)境的條件下NSCs 的生長與分化情況。Nestin 是一種中間絲類型的蛋白，能夠特異性地表達(dá)在神經(jīng)上皮干細(xì)胞上［10-11］。A組采用多聚賴氨酸促使NSCs 貼壁，添加正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞球結(jié)構(gòu)仍保留完好，部分細(xì)胞因貼壁遷出細(xì)胞球分化，Nestin 免疫熒光染色大多數(shù)細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，表明細(xì)胞分化程度低，仍存在細(xì)胞增殖。B組細(xì)胞同樣采取多聚賴氨酸促使NSCs 貼壁，并添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清誘導(dǎo)分化，細(xì)胞球結(jié)構(gòu)迅速解離，Nestin 免疫熒光染色僅少量細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，表明細(xì)胞分化迅速完全。C組NSCs 接種到Matrigel 膠內(nèi)，與A組相比，Nestin 染色陽性細(xì)胞集中于細(xì)胞球中，遷出細(xì)胞明顯增多，大多呈Nestin 陰性，Nestin 陽性率低于A組，說明Matrigel 膠可能存在促進(jìn)NSCs 分化的作用。D組NSCs接種到Matrigel 膠后給予胎牛血清促進(jìn)分化，與B組相比，Nestin 陽性率提高，且存在較小的細(xì)胞球結(jié)構(gòu)，表明Matrigel 膠在促進(jìn)NSCs 分化的同時，可能能夠?yàn)镹SCs 生長提供良好的生長環(huán)境，且存在一定的促進(jìn)NSCs 增殖能力。

β-tubulinⅢ是一種微管蛋白，特異性地分布于神經(jīng)元和睪丸細(xì)胞中，是一種理想的神經(jīng)元標(biāo)志物［12］。A組β-tubulinⅢ陽性細(xì)胞散在細(xì)胞球外，陽性率較低;B組則僅有少量細(xì)胞呈β-tubulinⅢ陽性;C組β-tubulinⅢ陽性細(xì)胞率高于A組，D組高于B組，表明Matrigel 膠可以促進(jìn)NSCs 向神經(jīng)元分化。

GFAP 是一種中間絲蛋白，其主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，可以作為膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。通過GFAP 免疫熒光染色比較，A組GFAP 陽性細(xì)胞主要分布于細(xì)胞球外，球內(nèi)表達(dá)較少;B組則呈現(xiàn)大量GFAP 陽性細(xì)胞;C組GFAP 陽性率高于A組，表明Matrigel 膠可促進(jìn)NSCs 分化;D組細(xì)胞GFAP 陽性率遠(yuǎn)低于B組，表明Matrigel 膠促進(jìn)NSCs 分化作用中，神經(jīng)元誘導(dǎo)分化傾向要強(qiáng)于膠質(zhì)細(xì)胞傾向。

綜上所述，Matrigel 膠可以為NSCs 的增殖與分化提供良好的三維支架支撐作用，使NSCs 立體生長，并能促進(jìn)NSCs 的增殖與分化，且能夠誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元方向分化。因此，Matrigel 膠對于研究NSCs 的生長分化規(guī)律有實(shí)際的研究價值，并且在移植NSCs 治療的研究中具有廣闊的前景。

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