王玉玉，張 軍 ，鄭鵬遠(yuǎn) ，李付廣，劉志強(qiáng)，陳東暉

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州450014 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科 鄭州450014 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 鄭州450001 4)深圳市耳鼻咽喉研究所 深圳518000

#通訊作者，張軍，女，1955年1月生，副教授，副主任藥師，研究方向:安全用藥、合理用藥，E－mail:zdefyzj@163.com;鄭鵬遠(yuǎn)，男，1965年2月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:胃腸道感染與免疫，E－mail:medp7123@126.com

應(yīng)激是機(jī)體對外界刺激的非特異性適應(yīng)性反應(yīng)，長期處于應(yīng)激狀態(tài)會(huì)引發(fā)機(jī)體的各種應(yīng)激性疾病，如腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)。目前認(rèn)為IBS 的發(fā)病是多因素的，涉及胃腸動(dòng)力異常、內(nèi)臟敏感性異常和心理因素等。腸黏膜屏障的完整性缺失與IBS 黏膜免疫活化和腸道功能失調(diào)有關(guān)［1］。IBS 亞群患者腸通透性存在異常，且與內(nèi)臟高敏和排便習(xí)慣有關(guān)［2－3］。研究［4］表明IBS 患者黏膜屏障的結(jié)構(gòu)、功能異常與臨床癥狀有關(guān)，提示腸黏膜屏障在IBS 發(fā)病中發(fā)揮重要作用。雙歧桿菌可緩解應(yīng)激大鼠腸道細(xì)菌移位、腸道通透性改變等現(xiàn)象;酪酸梭菌分泌的酪酸是結(jié)腸細(xì)胞優(yōu)先利用的能源物質(zhì);谷氨酰胺廣泛應(yīng)用于臨床營養(yǎng)，已證明可以改善多種疾病狀態(tài)的腸黏膜屏障，降低腸道通透性［5－6］。作者采用避水實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)小鼠慢性應(yīng)激模型，應(yīng)用雙歧桿菌、酪酸梭菌和谷氨酰胺進(jìn)行治療，評價(jià)其對小鼠腸道通透性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 SPF 級Balb/c 小鼠60 只，雄性，6～8 周齡，體重(20±2)g，購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飲食和水，適應(yīng)環(huán)境1周，溫度20～26℃，濕度(50±10)%。雙歧桿菌、酪酸梭菌菌粉由山東科興生物制品有限公司惠贈(zèng)，谷氨酰胺購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 雙歧桿菌、酪酸梭菌懸液及谷氨酰胺藥液的配制 雙歧桿菌、酪酸梭菌菌粉用無菌生理鹽水配成1×107CFU/mL 懸液。谷氨酰胺用無菌生理鹽水溶解，按人與小鼠之間的用藥劑量換算，配制成質(zhì)量濃度為40 g/L 的藥液備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及應(yīng)激模型的建立 應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將60 只小鼠分為6組:正常對照組、模型對照組、雙歧桿菌干預(yù)組、酪酸梭菌干預(yù)組、谷氨酰胺干預(yù)組、聯(lián)合干預(yù)組。正常對照組和模型對照組分別用生理鹽水0.5 mL 灌胃，雙歧桿菌干預(yù)組用0.5 mL 雙歧桿菌1×107CFU/mL 灌胃，酪酸梭菌干預(yù)組用0.5 mL 酪酸梭菌1×107CFU/mL 灌胃，谷氨酰胺干預(yù)組用0.5 mL 40 g/L 谷氨酰胺灌胃，聯(lián)合干預(yù)組各用0.5 mL雙歧桿菌1×107CFU/mL+ 0.5 mL 40 g/L 谷氨酰胺灌胃。每日9:00 給藥一次，各干預(yù)組均從造模開始前4 d 開始連續(xù)給藥，直至造模結(jié)束。根據(jù)既往方法建立避水實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］:每日稱質(zhì)量給藥后，除正常對照組外其余各組動(dòng)物均放置到10 cm×10 cm的平臺(tái)上，平臺(tái)固定在直徑為100 cm、深25 cm 的有水塑料容器內(nèi)，離水面的距離為2 cm。每天放置2 h(上午9:00～11:00)，連續(xù)10 d。

1.4 小鼠腸道通透性測定 血清D－乳酸和二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)含量可反映腸黏膜的通透性。造模結(jié)束后用眼眶靜脈叢采血法取血，用ELISA 法測定各組小鼠血清D－乳酸和DAO 的含量。ELISA 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.5 腸道閉鎖小帶(zonula occluden-1，ZO-1)、閉合蛋白(Occludin)mRNA 表達(dá)的RT-PCR 檢測在GenBank 中查找目的基因序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成相關(guān)引物(表1)。Trizol 法提取小腸、結(jié)腸組織總RNA 進(jìn)行RTPCR。PCR 反應(yīng)體系:cDNA 模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，共30 個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min，4℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物行20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，采用溴化乙錠染色，用凝膠成像分析儀分析條帶的灰度值，以目的基因與內(nèi)參β－actin 條帶平均灰度值的比值表示目的基因的表達(dá)水平。

表1 引物的序列及產(chǎn)物大小

1.6 腸道ZO-1、Occludin 蛋白表達(dá)的Western blot 檢測 取小腸、結(jié)腸組織100 mg，加入蛋白裂解液制備蛋白樣品。SDS－PAGE 凝膠電泳1 h，轉(zhuǎn)膜。室溫封閉1 h。一抗(鼠抗ZO－1、Occludin 多克隆抗體，購自北京奧博森生物技術(shù)有限公司)均按1∶300稀釋，4℃孵育1 h。二抗4℃孵育1 h，顯色。用成像掃描分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β－actin 條帶平均灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD－t 檢驗(yàn)比較各組小鼠血清D－乳酸、DAO 含量和ZO－1、Occludin mRNA 及蛋白表達(dá)的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腸道通透性測定 見表2。與正常對照組相比，模型對照組、各干預(yù)組血清D－乳酸、DAO 含量顯著升高;與模型對照組相比，正常對照組、各干預(yù)組血清D－乳酸、DAO 含量顯著下降。

表2 各組小鼠血清D-乳酸、DAO 檢測結(jié)果(n=10)μg/L

2.2 各組小鼠腸道ZO-1、Occludin mRNA 及蛋白表達(dá)的比較 見表3、4，圖1、2。

表3 各組小鼠小腸ZO-1、Occludin 的表達(dá)(n=10)

表4 各組小鼠結(jié)腸ZO-1、Occludin 的表達(dá)(n=10)

圖1 各組小鼠腸道ZO-1、Occludin mRNA 的表達(dá)

圖2 各組小鼠腸道ZO-1、Occludin 蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示模型對照組、各干預(yù)組小腸、結(jié)腸的ZO－1、Occludin mRNA 和蛋白表達(dá)量較正常對照組顯著降低;各干預(yù)組小腸、結(jié)腸ZO－1、Occludin mRNA 和蛋白表達(dá)較模型對照組均顯著升高。

3 討論

腸黏膜屏障形成分隔腸腔與內(nèi)環(huán)境的物理屏障，腸上皮屏障結(jié)構(gòu)和功能完整性的缺失利于食物和細(xì)菌抗原的自由滲透，刺激破壞性的免疫反應(yīng)和黏膜炎癥的發(fā)展，參與多種疾病的發(fā)病，如IBS。腸道機(jī)械屏障中的緊密連接是決定腸道通透性的重要因素，緊密連接蛋白數(shù)量和分布的改變直接影響腸道通透性。ZO 和Occludin 是重要的緊密連接蛋白。IBS 患者的腸黏膜屏障功能失調(diào)與結(jié)腸黏膜中ZO－1下調(diào)和蛋白酶介導(dǎo)的Occludin 降解有關(guān)。Occludin在腹瀉型－IBS 患者空腸腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中顯著增加，提示Occludin 大量內(nèi)化，而健康人Occludin 主要位于緊密連接處［8］。該實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激小鼠小腸、結(jié)腸上皮ZO－1、Occludin 表達(dá)有不同程度減少。

益生菌可以抑制腸道通透性增高和內(nèi)臟高敏性，從而改變腸道對應(yīng)激的黏膜反應(yīng)［9］，降低壓力誘導(dǎo)的結(jié)腸通透性增高［10］。該實(shí)驗(yàn)中益生菌干預(yù)后，應(yīng)激小鼠癥狀顯著改善，緊密連接蛋白ZO－1、Occludin 表達(dá)升高，腸道通透性也相應(yīng)降低。有研究［11］表明，雙歧桿菌可以降低壞死性腸炎小鼠升高的腸道通透性，維持密封蛋白－4 和ZO 在緊密連接中的結(jié)構(gòu)、位置。人體攝入多種益生菌后，可顯著減少糞便中連接蛋白的含量，提示腸道通透性降低。益生菌改變腸道通透性的機(jī)制之一可能是通過影響促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子水平實(shí)現(xiàn)的［12］。有研究［13］報(bào)道，對急性應(yīng)激大鼠應(yīng)用益生菌干預(yù)2 周后，大鼠血漿促腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)醇含量以及下丘腦脂多糖表達(dá)降低，結(jié)腸細(xì)胞間高通透性和門脈血中脂多糖水平的升高也有所緩解，但其具體的作用機(jī)制仍需更深入的研究。

谷氨酰胺是血液和體內(nèi)游離氨基酸池中最豐富的氨基酸，它是小腸黏膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及惡性細(xì)胞等快速分裂細(xì)胞的重要能源物質(zhì)。谷氨酰胺可能是維持腸道代謝、結(jié)構(gòu)、功能基本的成分，特別是在腸黏膜屏障受損的情況下。谷氨酰胺缺陷可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，補(bǔ)充谷氨酰胺則可以恢復(fù)腸道通透性。谷氨酰胺在臨床營養(yǎng)中應(yīng)用廣泛，可以改善外科手術(shù)后、燒傷、放療、化療及胰腺炎等患者的腸黏膜，降低腸道通透性，從而減少腸道菌群易位，抑制促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生［］。研究［15］發(fā)現(xiàn)腸道通透性增高的IBS 亞群患者出現(xiàn)谷氨酰胺合成水平下降。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明谷氨酰胺可明顯降低應(yīng)激模型小鼠的腸道通透性及緊密連接蛋白的表達(dá)。

IBS 的臨床表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制均有異質(zhì)性。雖然關(guān)于IBS 發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展迅速，但目前仍缺乏有效的治療手段。該研究結(jié)果顯示，雙歧桿菌聯(lián)合谷氨酰胺能較好恢復(fù)腸道緊密連接蛋白水平，降低腸道滲透性，恢復(fù)腸黏膜屏障功能。該研究可望為IBS 的治療提供新的理論依據(jù)。

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