胡高翔 畢躍東 吳永超 徐恒 秦敏*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 四川成都 610064;2.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司 四川成都 610023)

氫氧化鋁是國(guó)際通用的人用疫苗佐劑[1],用于疫苗制備,其功能主要是吸附小分子的抗原,提高其免疫原性,其質(zhì)量對(duì)最終產(chǎn)品的效力和不良反應(yīng)均有直接影響。對(duì)機(jī)體而言,氫氧化鋁佐劑是外源性物質(zhì),除了所需要的免疫刺激作用外,還可能引起副作用。造成副作用的原因可能與佐劑質(zhì)量有關(guān)系,這就促使我們需要優(yōu)化配制工藝,加強(qiáng)質(zhì)量控制,減少批間差異。

氫氧化鋁佐劑主要采用氨水法(氯化鋁加氨水)和氫氧化鈉法[2](氯化鋁加氫氧化鈉)制備,兩法配制工藝不同,所涉及的質(zhì)量體系也不同,本公司主要采用氨水法配制。本文將用氨水法優(yōu)化前后各配制的5批進(jìn)行對(duì)比。(批號(hào)見(jiàn)“結(jié)果”項(xiàng))

1 材料和方法

1.1 主要試劑

(1)結(jié)晶氯化鋁(AlCl3.6H2O):分析純,廣東光華有限公司制造,本所QC質(zhì)檢合格。(2)氨水:分析純,成都長(zhǎng)聯(lián)化工試劑有限公司,本所QC部門質(zhì)檢合格。(3)納氏試劑(Nessler):天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司。

表1 優(yōu)化前后的氨水使用量

表2 滅菌后的pH檢測(cè)結(jié)果

表3 平均粒徑檢測(cè)結(jié)果

1.2 配制優(yōu)化

1.2.1 配制方法

將一定濃度的三氯化鋁溶液加入到配制罐中,用一定濃度的氨水滴定,直至反應(yīng)終點(diǎn),溶液pH檢測(cè)合格后,分裝于透析袋中透析,透析溶液氨含量檢測(cè)合格后,收集于配制罐內(nèi),攪拌均勻后分裝,高壓滅菌,室溫保存。

1.2.2 設(shè)備校準(zhǔn)

校準(zhǔn)罐內(nèi)溫度傳感器和在線pH探頭,用轉(zhuǎn)速儀校準(zhǔn)攪拌轉(zhuǎn)速。

1.2.3 用具標(biāo)化

配制溶液的用具均標(biāo)化。

1.2.4 配制工藝優(yōu)化

(1)三氯化鋁除菌過(guò)濾:結(jié)晶氯化鋁用新鮮注射用水配制成適宜濃度的三氯化鋁溶液,通過(guò)0.22um除菌濾芯過(guò)濾至配制罐,去除纖毛過(guò)濾異物。(2)氨水除菌過(guò)濾:通過(guò)0.22um除菌濾芯過(guò)濾后滴加入配制罐,去除纖毛過(guò)濾異物。(3)轉(zhuǎn)速:提高攪拌轉(zhuǎn)速,優(yōu)化前為60轉(zhuǎn)/min,優(yōu)化后為80轉(zhuǎn)/min。(4)反應(yīng)溫度:優(yōu)化前溫度在一定范圍波動(dòng),優(yōu)化后恒溫63℃。(5)加樣速度調(diào)整:優(yōu)化前氨水按200mL/min向三氯化鋁溶液里滴加,直至反應(yīng)終點(diǎn)。優(yōu)化后先按150mL/min滴加,觀察在線pH變化,pH達(dá)到5.0后,降為50mL/min,直至反應(yīng)終點(diǎn)。(6)無(wú)菌分裝:無(wú)菌操作將配制溶液分裝于透析袋,每袋裝量為600mL。優(yōu)化前,每袋裝量不固定。(7)透析:根據(jù)透析槽大小,計(jì)算透析袋懸掛數(shù)量,透析袋懸掛后使用新鮮注射用水透析。

1.3 質(zhì)量檢測(cè)

分別取優(yōu)化工藝前和優(yōu)化工藝后生產(chǎn)的連續(xù)五批氫氧化鋁佐劑按照下列項(xiàng)目進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

(1)氨含量檢測(cè):采用顯色、比色法進(jìn)行檢測(cè):硫酸銨與堿性的納氏試劑作用,生成棕色膠體溶液;先用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液進(jìn)行顯色反應(yīng),反應(yīng)后的顏色為對(duì)照,再用佐劑進(jìn)行顯色反應(yīng),然后比色,佐劑顏色比對(duì)照顏色淺,判定合格。(2)pH檢測(cè):pH計(jì)檢測(cè)滅菌后佐劑的pH。(3)粒徑大小檢測(cè):使用歐美克LS-pop6粒徑檢測(cè)儀測(cè)定滅菌后的佐劑粒徑。(4)沉降速度的測(cè)定:按照《歐洲藥典》[3]的檢測(cè)方法,將滅菌后的佐劑進(jìn)行沉降率的檢測(cè)。(5)內(nèi)毒素檢測(cè):按照《歐洲藥典》的檢測(cè)方法,將滅菌后的佐劑進(jìn)行內(nèi)毒素的檢測(cè)。(6)無(wú)菌檢測(cè):按《中國(guó)藥典》三部(2010版)[4]要求,對(duì)佐劑進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)。

表4 沉降率檢測(cè)結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 氨水使用量比較

在三氯化鋁溶液量恒定的前提下,到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)后,優(yōu)化工藝后的氨水使用量批間差異小,變異系數(shù)僅0.36%,遠(yuǎn)小于優(yōu)化工藝前的5.59%,詳見(jiàn)表1。

2.2 氨含量檢測(cè)結(jié)果比較

優(yōu)化前五批佐劑,透析后和滅菌后氨含量檢測(cè)均＜1/1000;優(yōu)化后五批,透析后和滅菌后氨含量檢測(cè)＜1/5000,可見(jiàn)透析效果增強(qiáng)。

2.3 pH檢測(cè)

檢測(cè)滅菌后佐劑的pH,優(yōu)化后pH在4.7±0.2范圍內(nèi),優(yōu)化前pH在4.17-5.05,變化大,詳見(jiàn)表2。

2.4 粒徑檢測(cè)結(jié)果

優(yōu)化前5批佐劑的平均粒徑分布在517-950nm之間,而優(yōu)化后5批佐劑的平均的粒徑分布在275-435nm之間,平均粒徑變小,詳見(jiàn)表3。

2.5 沉降率結(jié)果

佐劑沉降率結(jié)果為上清液體積<20ml判為合格,優(yōu)化后5批沉降率結(jié)果合格率為100%,大于優(yōu)化前5批40%的合格率,詳見(jiàn)表4。

2.6 內(nèi)毒素檢測(cè)

優(yōu)化后5批佐劑進(jìn)行內(nèi)毒素的檢測(cè),結(jié)果均為內(nèi)毒素<5IU/mg鋁,合格率100%,符合《歐洲藥典》的規(guī)定,大于優(yōu)化前5批40%的合格率。

2.7 無(wú)菌試驗(yàn)

優(yōu)化后5批佐劑外觀均為藍(lán)白色懸液,抽樣進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn),結(jié)果均為無(wú)菌生長(zhǎng),符合《中國(guó)藥典》的規(guī)定。

3 討論

理論上佐劑粒徑大小與化學(xué)反應(yīng)物的反應(yīng)濃度,罐攪拌速度,反應(yīng)溫度等有關(guān)。生產(chǎn)工藝從以上方面優(yōu)化后,佐劑批間差異小,平均粒徑的大小分布在275～435nm。研究表明[5],顆粒越小,比表面積就大,表面反應(yīng)活性越高,吸附能力可能越強(qiáng)?；丙惼嫉萚6]證實(shí),氫氧化鋁佐劑粒徑大小與白喉類毒素的吸附效果及免疫原性密切相關(guān)。

氫氧化鋁佐劑是外源性物質(zhì),免疫應(yīng)答的同時(shí)可能引起副作用,增加佐劑內(nèi)毒素檢測(cè)和無(wú)菌試驗(yàn),有助于保證佐劑的安全性,保障人體安全。

《歐洲藥典》對(duì)氫氧化鋁佐劑有明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,而《中國(guó)藥典》三部(2010版)對(duì)氫氧化鋁佐劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)明確規(guī)定,優(yōu)化后的氫氧化鋁佐劑符合《歐洲藥典》某些檢測(cè)項(xiàng)目的要求,但還需要完善其吸附能力的研究,為氨水法配制的氫氧化鋁佐劑相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。優(yōu)化后的配制工藝加強(qiáng)了質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)控制,減少了批間差異,減少熱源進(jìn)入制品的機(jī)率,保證佐劑質(zhì)量。

[1]張延齡.疫苗學(xué)[M]北京:科學(xué)出版社,2004:613-614.

[2]李德娟,何巍,張睿,等.氫氧化鋁佐劑配制工藝優(yōu)化[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2010,23(10):1135-1137.

[3]Directorate for the Quality of Medicines &HealthCare of the Council of Europe.The European Pharmacopoeia7.0[S].Framce:Strasbourg Cedex,2008:1664.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(三部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄89-附錄92.

[5]何萍,呂鳳林,任建敏,等.鋁佐劑機(jī)制及其納米化前景[J].世界華人消化雜志,2003,11(11):1764-1768.

[6]槐麗平,劉輝,張楠,等.不同粒徑氫氧化鋁佐劑對(duì)白喉類毒素免疫效果的影響[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2011,39(3):15-17.