焦晶凱，劉振民，莫蓓紅

(乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436)

乳酸菌作為人和動物腸道的正常菌群，具有阻止病原菌對腸道的感染和侵害、抑制內(nèi)毒素的產(chǎn)生、維持腸道的微生態(tài)平衡、提高機體免疫力、預(yù)防和抑制腫瘤的發(fā)生、降低膽固醇、延緩衰老和抗輻射等功效。乳酸菌還有抑制過敏發(fā)炎反應(yīng)，對氣喘、異位性皮膚炎有很好的效果。特別是口服乳酸菌具有免疫耐受性作用，微量釋放過敏原疫苗蛋白，降低過敏炎性反應(yīng)，改善氣喘和減少過敏性鼻炎發(fā)作的機會等［1］。

新的分子生物學(xué)技術(shù)極大地促進了在宿主微生物區(qū)系水平上對乳酸菌益生作用的研究，乳酸菌遺傳學(xué)的主要突破是基因組學(xué)研究的進步，目前已成功獲得了幾個種類乳酸菌的全基因組序列［2］。全基因組序列無疑會提高我們對乳酸菌代謝、乳酸菌間水平基因轉(zhuǎn)移及其生態(tài)作用的認識和了解。特別是在乳糖和檸檬酸代謝、蛋白質(zhì)水解［3］、噬菌體抗性機制及細菌素產(chǎn)生等方面，通過全基因組序列可以了解這些過程是如何被控制或調(diào)節(jié)的。詳細的序列信息可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上開辟基因表達分析的途徑，從而進一步推斷這些微生物在益生方面的代謝模式。隨著人們對分子生物學(xué)的進一步了解以及生物信息學(xué)研究的深入，在宿主基因表達水平上研究益生菌與宿主相互作用亦成為可能。

1 基因組成

細菌中的基因組成分為兩個部分，大部分基因作為主要DNA分子存在于細菌染色體中，另一小部分儲存于自主復(fù)制的質(zhì)粒中。乳酸菌遺傳學(xué)研究的主要是它們當中的質(zhì)粒和噬菌體，這些質(zhì)粒和噬菌體在乳酸菌中起著比較重要的作用，對比染色體，采用分子遺傳分析方法來分析的質(zhì)粒和噬菌體更加容易獲取和研究。眾所周知，好的發(fā)酵劑菌株對于乳制品發(fā)酵來說至關(guān)重要，但是這些菌株的某些特性并不穩(wěn)定，而大部分原因歸咎于質(zhì)粒的缺失，質(zhì)粒的編碼消除等對菌株的特性至關(guān)重要。

1.1 質(zhì)粒DNA的檢測及其豐度

1972年，Mckay等人［4］推斷乳酸鏈球菌(Str.lactis)喪失利用乳糖的能力可能是由于質(zhì)粒消除引起，此后乳酸鏈球菌染色體外DNA研究開始映入人們的視線。對質(zhì)粒研究之初，是通過顯微鏡對放射性標記的質(zhì)粒DNA進行檢測的。對這種質(zhì)粒DNA進行電子顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，這些不同大小的環(huán)狀質(zhì)粒分子可以由其拉伸長度進行評定。隨后研究者發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖電泳可以更加快速而有效的進行乳酸菌質(zhì)粒DNA的檢測。隨著技術(shù)研究的進步，對質(zhì)粒DNA檢測技術(shù)更加完善，分子質(zhì)量超過30兆道爾頓的質(zhì)粒DNA可以很容易的被檢測出來。目前已發(fā)展了更多快速篩選菌株中質(zhì)粒含量的方法［5］。

質(zhì)粒譜提供了一個有效的“指紋圖譜”，可以更簡便地去觀察菌株特性及其相互之間的關(guān)系。通過質(zhì)粒譜觀察到乳酸鏈球菌(Str.lactis)菌株和乳脂鏈球菌(Str.cremoris)菌株中包含大而復(fù)雜的質(zhì)粒，相反，菌株嗜熱鏈球菌(Str.thermophilus)不包含質(zhì)粒或包含質(zhì)粒數(shù)目較少。不同乳桿菌中所包含的質(zhì)粒數(shù)目差異較大，通常乳桿菌中不包含或僅僅包含一個質(zhì)粒，但如嗜酸乳桿菌(Lb.acidophilus)等菌株包含多個質(zhì)粒。片球菌(Pediococci)包含0～2個質(zhì)粒，Leuconostoc包含2 個質(zhì)粒［6］。

1.2 質(zhì)粒消除法和表型歸屬性

研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒的突然消失能夠?qū)Ρ硇蛶碛绊?，吖叮黃、溴化乙錠濃度和溫度的增加對消除頻率會產(chǎn)生影響，由此通過觀察菌株間基因轉(zhuǎn)移的特征得出表型是由質(zhì)粒基因控制的結(jié)論。找到?jīng)Q定菌株表型的質(zhì)粒中特定分子是目前的一大研究熱點。質(zhì)粒消除法對研究特定質(zhì)粒的特性尤為重要，例如乳酸鏈球菌712(Str.lactis712)和雙醋酸乳鏈球菌176(Str.Lactis diacetylactis 176)中的乳糖質(zhì)粒，研究者們觀察了在原生質(zhì)體恢復(fù)之后乳酸鏈球菌712(Str.lactis 712)質(zhì)粒的消除現(xiàn)象，并通過連續(xù)的對質(zhì)粒進行消除獲得了僅攜帶特定質(zhì)粒分子的菌株及非攜帶質(zhì)粒的菌株。通過觀察這些“衍生”的菌株的表型，可以清晰地辨別出乳糖質(zhì)粒分子，這是通過傳統(tǒng)的表型消除法和質(zhì)粒圖譜分析難以實現(xiàn)的。乳酸鏈球菌復(fù)雜的質(zhì)粒組成為分析質(zhì)粒編碼的基因轉(zhuǎn)移引起的表型的改變帶來很大困難，并且使對純化質(zhì)粒進行分子分析更加復(fù)雜化，基于以上原因，分離出帶單一質(zhì)粒的菌株及非攜帶質(zhì)粒的菌株更具有重要意義，目前，已經(jīng)成功使用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍試劑分離出非攜帶質(zhì)粒的乳酸鏈球菌712(Str.lactis 712)和乳酸鏈球菌C2(Str.lactis C2)、通過使用”原生質(zhì)體消除”法獲得了非攜帶質(zhì)粒的乳酸鏈球菌TL1987(Str.lactis TL1987)、通過吖叮黃獲得了非攜帶質(zhì)粒的雙醋酸乳鏈球菌176(Str.lactis subsp.diacetylactis 176)及通過提高溫度的方法獲得了非攜帶質(zhì)粒的雙醋酸乳鏈球菌BU2(Str.lactis subsp.diacetylactis BU2)和乳脂鏈球菌1200(Str.cremoris 1200)。

1.3 乳糖和蛋白酶質(zhì)粒

表型、遺傳、物理等多種方法已被用來證明在乳鏈球菌中乳糖的發(fā)酵能力是由質(zhì)粒編碼調(diào)控的。在20世紀30年代有學(xué)者就研究了乳糖發(fā)酵能力的突然消失的原因，1972年McKay等人研究得出增加吖叮黃的濃度或增加溫度可引起乳糖質(zhì)粒消除的增加［4］。研究已證明在乳酸鏈球菌(Str.lactis)和雙醋酸乳酸鏈球菌(Str.Lactis subsp.diacetylactis)中乳糖基因是由特殊的分子控制的。由消除實驗鑒定了在菌株乳脂鏈球菌B1(Str.cremoris B1)中含有36Mdal乳糖質(zhì)粒，但在該屬的其他菌株中，并未得到相關(guān)的乳糖質(zhì)粒［7］。隨后，有學(xué)者研究當一些乳脂鏈球菌(Str.cremoris)菌株作為供體與乳酸鏈球菌(Str.lactis)進行基因轉(zhuǎn)移時，乳糖基因轉(zhuǎn)移和質(zhì)粒分子的轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出了一定的相關(guān)性，Snook和McKay［8］推斷乳脂鏈球菌(Str.cremoris)菌株可能攜帶了罕見穩(wěn)定的乳糖質(zhì)粒。而有研究者發(fā)現(xiàn)一個非攜帶質(zhì)粒的乳脂鏈球菌菌株1200(Str.cremoris 1200)依然保留了乳糖發(fā)酵能力，因此，在不同乳脂鏈球菌(Str.cremoris)菌株中乳糖表型差異很大，一些攜帶了乳糖質(zhì)粒，一些僅包含染色體乳糖基因，此外在一些乳桿菌中也鑒定出了乳糖質(zhì)粒。

已有學(xué)者致力于研究菌株中的乳糖分解代謝途徑中的酶是由哪一種質(zhì)粒基因調(diào)控的。有研究得出在乳酸鏈球菌C2(Str.lactis C2)和乳脂鏈球菌B1(Str.cremoris B1)菌株里磷酸稀醇式丙酮酸依賴性磷酸轉(zhuǎn)移酶(PTS)系統(tǒng)中用于糖的攝取的酶Ⅱ、因子Ⅲ和乳糖分解酶-磷酸-β-半乳糖苷酶是由質(zhì)粒編碼基因調(diào)控的［9］。有學(xué)者采用乳糖陰性突變的方法證實乳酸鏈球菌11454(Str.lactis 11454)菌株乳糖質(zhì)粒攜帶有關(guān)編碼乳糖磷酸轉(zhuǎn)移酶和磷酸-β-半乳糖苷酶的基因。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)D-塔格糖-6-磷酸途徑中的3種酶(塔格糖-6-磷酸異構(gòu)酶、D-塔格糖-6-磷酸激酶、塔格糖-1，6-二磷酸醛縮酶)的基因與乳酸鏈球菌Str.lactis C10、H1和133菌株的乳糖質(zhì)粒相關(guān)。干酪乳桿菌64H(Lb.casei 64H)也被研究發(fā)現(xiàn)其中的乳糖質(zhì)粒編碼乳糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的酶和磷酸-β-半乳糖苷酶［10］。半乳糖的利用也受乳糖質(zhì)粒的消失的影響。目前已獲知乳酸鏈球菌(Str.lactis)的乳糖陰性突變體減緩了乳糖的增長率。

由于乳酸鏈球菌是營養(yǎng)依賴型微生物，而牛奶中缺乏足夠的游離氨基酸或小的肽類，需要將牛奶中酪蛋白分解，因此發(fā)酵劑的生長和產(chǎn)酸量依賴于發(fā)酵劑細胞壁上蛋白酶分解酪蛋白的能力。失去這種分解蛋白的能力會導(dǎo)致產(chǎn)酸量的減少。McKay等人［11］和Klaenhammer等人［12］證實質(zhì)粒消除法可以得到這種產(chǎn)酸量少的突變體。蛋白酶質(zhì)粒已在一些乳脂鏈球菌(Str.cremoris)中鑒定出來。

乳酸鏈球菌(Str.lactis)的蛋白酶質(zhì)粒鑒定有很多不確定性，主要是因為該表型特點與乳糖基因調(diào)控之間存在一定的相關(guān)性。在乳酸鏈球菌(Str.lactis C2、ML3、712、C10、M18)和雙醋酸乳酸鏈球菌(diacetylactis DRC1)中，均表現(xiàn)乳糖和蛋白酶表型特征的同時消失與一個大小為30～45 Mdal的質(zhì)粒相關(guān)，同時也發(fā)現(xiàn)了一些與之不同的現(xiàn)象，如保留了乳糖基因的乳酸鏈球菌C2(Str.Lactis C2)蛋白酶陰性突變體丟失了大小為12.5Mdal和18Mdal的質(zhì)粒而保留了30Mdal的質(zhì)粒分子［12］。近期有學(xué)者進行了高頻率的刪除組織構(gòu)架和對一種未知的質(zhì)粒的高頻率消除實驗［13］，對解釋這些復(fù)雜現(xiàn)象起到了一定的作用。首先，很容易從乳酸鏈球菌712(Str.lactis 712)消除一個9Mdal的質(zhì)粒，而大多數(shù)這些消除質(zhì)粒的菌株通常表現(xiàn)為乳糖或蛋白酶陰性突變體。這個9Mdal的質(zhì)粒并不調(diào)控乳糖基因或蛋白酶基因，但卻對這2個基因的表型有極大的影響，由此可以看出質(zhì)粒與表型表現(xiàn)相關(guān)性是有條件的。第2，乳酸鏈球菌712(Str.lactis 712)的乳糖和蛋白酶質(zhì)粒受支配于刪除組織構(gòu)架的頻率。根據(jù)分子出現(xiàn)的位置的不同，通過消除實驗可以得到3種表型的菌株，分別是Lac-Prt-、Lac-Prt+和Lac+Prt-。再者，消除小于等于10%的質(zhì)粒DNA并不能通過瓊脂糖凝膠檢測出來。pLP712的轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗中，為了接受來自噬菌體頭部的DNA需要破壞受體的組織結(jié)構(gòu)，根據(jù)破壞位點的不同得到了2種轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)物，Lac+Prt+和Lac+Prt-。另外將乳酸鏈球菌(Str.Lactis 712、ML3、C2)中的乳糖質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移到非攜帶質(zhì)粒菌株乳酸鏈球菌712(Str.Lactis 712)中，3種菌株轉(zhuǎn)移后均得到了Lac+Prt+和Lac+Prt-兩種表象的菌株，并由限制性內(nèi)切酶進行酶解，對這些質(zhì)粒進行了對比，Lac+Prt-型菌株攜帶了1個了與蛋白酶質(zhì)粒類似的質(zhì)粒但是該質(zhì)粒缺少了1個編碼蛋白酶的區(qū)域。乳酸鏈球菌(Str.Lactis)菌株似乎通常攜帶了1個同時編碼乳糖基因和蛋白酶基因的質(zhì)粒，但是消除實驗可能破壞了該質(zhì)粒與2種表現(xiàn)型之間的遺傳關(guān)系。

1.4 編碼表型的其他質(zhì)粒

隨著乳糖和蛋白酶基因的研究，雙醋酸乳鏈球菌(Str.Lactis sub.diacetylactis)菌株發(fā)酵檸檬酸(Cit)的能力也被發(fā)現(xiàn)，Kempler和McKay［14］采用吖啶橙消除法分離了Cit-突變體和菌株18-16、DRC1。另外，拮抗控制質(zhì)粒也得到了廣泛的研究，Neve等人使用消除法和接合轉(zhuǎn)移實驗鑒定了乳脂鏈球菌(Str.cremoris)菌株4G6和9B4及雙醋酸乳鏈球菌6F7(Str.Lactis sub.diacetylactis 6F7)中的細菌素質(zhì)粒［15］。目前，已成功分離了乳酸鏈球菌 354-07(Str.lactis 354-07)編碼葡萄糖和甘露糖基因大小為23Mdal的質(zhì)粒和乳酸鏈球菌DR1253(Str.Lactis DR1253)中的木糖質(zhì)粒。并成功從1株乳酸鏈球菌71(Str.lactis 71)中將卡鈉徽素抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)進了枯草芽孢桿菌(Bacillus sbtilis)中，這是第1個關(guān)于在乳鏈球菌中存在藥物抗性質(zhì)粒的報告。無機離子抗性和無機離子敏感型特性被鑒定是由質(zhì)粒編碼調(diào)控的。乳酸鏈球菌C2(Str.lactis C2)的乳糖質(zhì)粒控制砷酸鹽、亞砷酸鹽和鉻酸鹽抗性和對銅的敏感特性，乳脂鏈球菌Wg2(Str.cremoris Wg2)中的1個6.1Mdal大小的質(zhì)?？赡苷{(diào)控對銅的抗性特征［16］。菌株的其他特征也可能是質(zhì)粒調(diào)控的，如對乳過氧化物酶-硫氰酸鹽-過氧化氫系統(tǒng)抗性、乳脂鏈球菌(Str.cremoris)菌株菌毛的生長和雙醋酸乳鏈球菌(Str.lactis sub.diacetylactis)菌株精氨酸水解的調(diào)控，仍需進一步研究。

2 基因轉(zhuǎn)移過程

2.1 轉(zhuǎn)導(dǎo)

第1個比較詳細的有關(guān)乳鏈球菌基因轉(zhuǎn)移的敘述是乳酸鏈球菌C2(Str.lactis C2)中的噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)［17］。更早的轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)報道還有乳酸鏈球菌C2(Str.lactis C2)中的鏈霉素抗性基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)和雙醋酸乳鏈球菌18-16(Str.lactis sub.diacetylactis 18-16)中的色氨酸獨立性轉(zhuǎn)導(dǎo)，采用的是烈性噬菌體，而McKay關(guān)于乳酸鏈球菌C2(Str.Lactis C2)的研究和隨后的所有通過轉(zhuǎn)導(dǎo)進行基因轉(zhuǎn)移的實驗都是采用溫和的噬菌體。

McKay等人對乳酸鏈球菌C2(Str.Lactis C2)中染色體標記的麥芽糖和甘露糖基因和質(zhì)粒調(diào)控的乳糖基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進行了檢測［18］。在后續(xù)實驗中發(fā)現(xiàn)選取的乳糖轉(zhuǎn)導(dǎo)子供體中大概有50%的轉(zhuǎn)導(dǎo)子伴隨著非選擇性的蛋白酶基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。使用噬菌體對一個乳酸鏈球菌C2(Str.Lactis C2)乳糖轉(zhuǎn)導(dǎo)子基因進行了轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)實驗，發(fā)現(xiàn)乳糖基因的轉(zhuǎn)移頻率顯著增加了，該現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在了其它轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中，這樣的轉(zhuǎn)導(dǎo)稱為高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)(HFT)。除乳糖質(zhì)粒外，有學(xué)者對一個來自于糞鏈球菌(Str.faecalis)大小為17Mdal的紅霉素抗性質(zhì)粒進行了轉(zhuǎn)導(dǎo)，但并未發(fā)現(xiàn)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)(HFT)現(xiàn)象［19］。

近來，有學(xué)者成功將由溫和噬菌體介導(dǎo)的乳脂鏈球菌C3(Str.cremoris C3)的乳糖基因分別轉(zhuǎn)移到了乳酸鏈球菌(Str.lactis ML3)和一個非攜帶質(zhì)粒的乳酸鏈球菌 C2(Str.lactis C2)突變體中［20］。

轉(zhuǎn)導(dǎo)這種基因轉(zhuǎn)移方式是有限制的，只有具備相應(yīng)噬菌體受體的宿主菌株才可以用來進行基因轉(zhuǎn)移，同時噬菌體的頭部容量限制了轉(zhuǎn)移的DNA的數(shù)量，而頭部容量的限制會影響遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。那些相對于噬菌體頭部來說分子太大難以被全部容納的基因，乳糖質(zhì)粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中會引起基因缺失的產(chǎn)生［13］。這種基因缺失的產(chǎn)生對于質(zhì)粒編碼基因在限制酶切割圖譜中的分析是非常有用的。

此外，轉(zhuǎn)導(dǎo)有時會引起乳糖和蛋白酶質(zhì)?；蛘系郊毦旧w上，產(chǎn)生了2個非常重要的現(xiàn)象，即基因通過轉(zhuǎn)移到染色體上而使遺傳變得非常穩(wěn)定，另外，降低了基因表達水平［20］。有學(xué)者證實染色體上整合蛋白酶基因的菌株乳酸鏈球菌C2(Str.lactis C2)減少了蛋白水解能力，由此降低了苦味物質(zhì)的產(chǎn)生，從而得到了由此菌株發(fā)酵的風味更佳的奶酪產(chǎn)品［21］。

2.2 接合轉(zhuǎn)移

了解乳鏈球菌中通過交配過程進行的基因轉(zhuǎn)移要求對細胞與細胞間的接觸有深入的研究。最早的研究是關(guān)于乳酸鏈球菌712(Str.lactis 712)之間的質(zhì)粒編碼乳糖基因的接合轉(zhuǎn)移和由雙醋酸乳鏈球菌18-16(Str.lactis sub.diacetylactis 18-16)菌株的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到非攜帶質(zhì)粒乳酸鏈球菌C2(Str.lactis C2)突變體的研究［22］。隨后檢測出更多不同菌株間的乳糖質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，如從乳酸鏈球菌ML3(Str.lactis ML3)、乳酸鏈球菌C2(Str.lactis C2)、乳脂鏈球菌C3(Str.cremoris C3)和雙醋酸乳鏈球菌(Str.Lactis sub.diacetylactis DRC3，11007，WM4)轉(zhuǎn)移到同樣突變的乳酸鏈球菌C2(Str.lactis C2)中，從乳脂鏈球菌(Str.cremoris R1，EB7，28，C3)中轉(zhuǎn)移到突變的乳酸鏈球菌ML3(Str.lactis ML3)中，從乳脂鏈球菌C3(Str.cremoris C3)中轉(zhuǎn)移到乳脂鏈球菌B1(Str.cremoris B1)突變體中。一個來自干酪乳桿菌64H(Lb.casei 64H)菌株的乳糖質(zhì)粒已經(jīng)被證明具有接合轉(zhuǎn)移的能力［10］。目前已在一些交配實驗獲得的雜合體菌株中分離出了高頻率的轉(zhuǎn)移供體菌株。這樣的高頻突變菌株最早在乳酸鏈球菌712(Str.lactis 712)菌株中發(fā)現(xiàn)，這些菌株表現(xiàn)了新的細胞聚集現(xiàn)象，該現(xiàn)象使得菌株的菌落形態(tài)和在培養(yǎng)基上的生長特征發(fā)生了顯著的變化。在乳糖質(zhì)粒從乳酸鏈球菌ML3(Str.lactis ML3)轉(zhuǎn)移到一個非攜帶質(zhì)粒的乳酸鏈球菌C2(Str.lactis C2)突變體過程中，也發(fā)現(xiàn)了高頻的子菌株。有學(xué)者將從高頻子菌株乳脂鏈球菌(Str.cremoris C3，Z8)中得到乳糖質(zhì)粒及一代乳酸鏈球菌ML3(Str.lactis ML3)中的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到了另一株乳酸鏈球菌ML3(Str.lactis ML3)宿主菌株中，進行對比，發(fā)現(xiàn)由于插入了新的DNA片段，這些由高頻接合轉(zhuǎn)移得到的子菌株包含了擴大的乳糖質(zhì)粒［23-24］。從進化的觀點來看，細胞聚集也是復(fù)雜的誘導(dǎo)共軛系統(tǒng)中的一個現(xiàn)象并在一些糞鏈球菌(Str.faecalis)菌株中發(fā)現(xiàn)此共軛系統(tǒng)的作用。

開始時僅作為糞鏈球菌DS-5(Str.faecalis DS-5)［25］中的特殊質(zhì)粒的紅霉素抗性質(zhì)粒pAMβ1自發(fā)遺傳到了不同種類的革蘭氏陽性種和屬的細菌中，成為一種在體內(nèi)發(fā)展和載體構(gòu)建方面具有重要作用的質(zhì)粒。該質(zhì)粒首次從一個溶菌素缺陷菌株糞鏈球菌DS-5(Str.faecalis DS-5)中轉(zhuǎn)移到了乳酸鏈球菌712(Str.lactis 712)中，隨后該質(zhì)粒從乳酸鏈球菌712(Str.lactis 712)中被轉(zhuǎn)移到了其他乳酸鏈球菌(Str.lactis)，乳脂鏈球菌(Str.cremoris)，雙醋酸乳鏈球菌(Str.Lactis sub.diacetylactis)和嗜熱鏈球菌(Str.thermophilus)中，此外，該質(zhì)粒還被轉(zhuǎn)移到唾液乳桿菌(Lb.salivarius)，嗜酸乳桿菌(Lb.acidophilus)，干酪乳桿菌(Lb.casei)，羅伊乳桿菌(Lb.reuteri)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中。轉(zhuǎn)移過程中也會遇到一些問題，如一些轉(zhuǎn)移頻率是非常低的，還有些轉(zhuǎn)移是無法被檢測到的，解決這些問題的一種方法就是分離受體能力更強的突變體，該方法已成功應(yīng)用于提高pAMβ1轉(zhuǎn)移到嗜熱鏈球菌1526(Str.Thermophilus 1526)中的轉(zhuǎn)移頻率，每一個受體轉(zhuǎn)移頻率從4.2×10-7提高到2.9×10-2。此外將一個分布廣泛的可遺傳的藥物抗性質(zhì)粒作為對比進行了試驗，Gonzalez＆ Kunka［6］成功將氯霉素和紅霉素抗性質(zhì)粒pIP501轉(zhuǎn)移到了戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和乳酸片球菌(Pediococcus acidilaciti)菌株中，質(zhì)粒pAMβ1在這些菌株中卻不能成功轉(zhuǎn)移。很多細菌素質(zhì)粒、控制蔗糖利用質(zhì)粒、nisin和雙球菌素產(chǎn)生質(zhì)粒類似基因模塊可以通過接合轉(zhuǎn)移來影響他們自身的轉(zhuǎn)移。

接合轉(zhuǎn)移在構(gòu)建新的乳制品發(fā)酵劑菌株方面具有廣泛應(yīng)用潛力。該方法沒有轉(zhuǎn)移DNA容量的理論極限。pAMβ1接合轉(zhuǎn)移的混雜性質(zhì)使得在差異較大的菌株間的轉(zhuǎn)移成為可能。乳糖質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)移非自身的可遺傳的乳酸鏈球菌(Str.lactis)菌株中的隱秘的質(zhì)粒。另外還發(fā)現(xiàn)了一種新型的具有潛力的接合轉(zhuǎn)移，即轉(zhuǎn)座子，并在糞鏈球菌(Str.faecalis)菌株中得到驗證?？蛇z傳的四環(huán)素抗性轉(zhuǎn)座子Tn916被成功轉(zhuǎn)移到了乳酸鏈球菌(Str.lactis M1中)，這種在乳鏈球菌中結(jié)合了轉(zhuǎn)位技術(shù)的新型基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

2.3 轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染

將純化的DNA導(dǎo)入可繁殖細菌這一過程對于基因轉(zhuǎn)移有重要的意義，因為它是基因克隆技術(shù)出現(xiàn)的前提條件。目前還不能將整個細胞倒入繁殖細菌，主要是將DNA導(dǎo)入細菌原生質(zhì)體的方法進行轉(zhuǎn)化。原生質(zhì)體溶解和再生主要依賴細胞壁的溶解，溶解使用的酶有溶菌酶、變?nèi)芫鼗蚪Y(jié)合的淀粉酶和溶菌酶。目前為止，僅有Kondo和 McKay［26］使用的聚乙二醇轉(zhuǎn)化實驗成功，他們對乳酸鏈球菌ML3(Str.lactis ML3)原生質(zhì)體進行處理，引入了一個縮短的乳糖質(zhì)粒，目前已經(jīng)成功獲得了大約105/μg DNA轉(zhuǎn)化子的頻率。

2.4 原生質(zhì)體融合

通過聚乙二醇來融合原生質(zhì)體已成功實現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)移。有學(xué)者使用帶有遺傳標記的乳酸鏈球菌712(Str.lactis 712)間的質(zhì)粒和染色體基因進行轉(zhuǎn)移。原核生物的原生質(zhì)體融合是一種特殊基因轉(zhuǎn)移過程，因為它是非特異性且包含整個基因組的轉(zhuǎn)移而不是部分DNA的單向轉(zhuǎn)移，這對于開發(fā)新型發(fā)酵劑菌株來說是一種非常有效的技術(shù)。針對發(fā)酵劑菌株用途的偏好性進行遺傳是非常困難的，而且該性質(zhì)特也可能是被多基因控制的，有可能分布在染色體周圍。但通過原生質(zhì)體融合技術(shù)可以得到混合的基因遺傳產(chǎn)物，此項技術(shù)將會使這種復(fù)雜的性狀轉(zhuǎn)移在一定程度上成為可能。

2.5 基因克隆技術(shù)

基因克隆技術(shù)是解決遺傳復(fù)雜性的有效手段之一。它為分離一個單獨組織的基因提供了可能，也為引入這些基因來構(gòu)建一個新的發(fā)酵劑菌株提供了可能。有學(xué)者將氯霉素和紅霉素抗性基因克隆到一個乳脂鏈球菌Wg2(Str.Cremoris Wg2)小的隱蔽性質(zhì)粒中，并成功獲得了一個抗性載體。這種雜交分子具有特殊的限制酶BclⅠ和BglⅡ的酶切位點，從而可以利用插入失活這一特性。該質(zhì)粒不僅可以在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中復(fù)制，也可以在大腸桿菌(Escherichia coli)復(fù)制，它可以在多宿主細胞中作為穿梭載體，這一性質(zhì)是非常有價值的?；蚬こ叹赀€未用于食品和乳制品工業(yè)相關(guān)應(yīng)用中，有人認為將含藥物抗性基因的傳統(tǒng)克隆載體直接在食品工業(yè)上使用是不安全的，所以有必要使用乳鏈球菌和乳桿菌等原始乳制品相關(guān)菌株的代謝質(zhì)粒進行載體的構(gòu)建。目前有許多實驗室正使用現(xiàn)有的基因工程構(gòu)建系統(tǒng)克隆，從而進行合適的代謝質(zhì)粒的分子分析及相關(guān)發(fā)酵劑基因的分離。

3 質(zhì)粒和基因轉(zhuǎn)移的分子學(xué)研究

限制酶圖譜是研究質(zhì)粒分子之間的關(guān)系及發(fā)生變化的有效手段。結(jié)合缺失定位法和克隆可以將特殊的基因功能植入DNA中，同時可以推進對基因轉(zhuǎn)移過程的分子生物學(xué)分析。

3.1 限制酶圖譜

目前已經(jīng)繪出了已知代謝功能的多種質(zhì)粒和可以進行轉(zhuǎn)染的噬菌體的限制酶圖譜。圖1顯示的是雙醋酸乳鏈球菌176(Str.lactis subsp.diacetylactis 176)的檸檬酸質(zhì)粒pCT176限制酶圖譜，該質(zhì)粒與其它菌株的檸檬酸質(zhì)粒大致是一樣的，并且可以用作代謝載體的基礎(chǔ)。這是惟一一個了解其功能及了解其在簡單鑒別培養(yǎng)基中生長中表型特征的多拷貝質(zhì)粒，該質(zhì)粒的限制酶圖譜顯示了特殊的臨近的配對位點，這些位點對應(yīng)的限制酶有 Bam HI、BclⅠ、BglⅡ、ClaⅠ、Eco RⅠ和XhoⅠ，所有這些限制酶都可用于基因克隆。

圖1 檸檬酸質(zhì)粒pCT176限制酶切圖譜Fig.1

Loof等人發(fā)現(xiàn)噬菌體 P008基因組包含一個19.6Mdal具有粘性末端的雙鏈DNA，并繪制了它的限制酶圖譜，發(fā)現(xiàn)了限制酶BclⅠ、BglⅡ和HindⅢ的特殊的位點［27］。因為該噬菌體的DNA可以被轉(zhuǎn)移進入原生質(zhì)體，所以它可作為一個有潛力的噬菌體載體。

有學(xué)者采用38種不同的限制酶對來自乳酸鏈球菌712(Str.lactis 712)的55kb的pLP712質(zhì)粒進行了分析，并且繪制出了綜合圖譜［13］。圖譜中顯示了pLP712中的消除位點，圖譜中還將控制乳糖利用、蛋白酶生產(chǎn)和質(zhì)粒復(fù)制的區(qū)域劃分出來。Kok等人使用7種不同的限制酶繪制了來自乳脂鏈球菌Wg2(Str.Cremoris Wg2)的17Mdal的蛋白酶質(zhì)粒［28］。

3.2 乳酸菌的克隆基因

目前已有學(xué)者成功進行了發(fā)酵劑菌株在宿主細胞中的的基因表達和克隆。使用鏈狀球菌的載體pDB101將來自乳酸鏈球菌C2(Str.lactis C2)菌株的乳糖基因克隆進了血鏈球菌Challis(Str.sanguis Challis)菌株的乳糖陰性突變體中。被克隆的乳酸鏈球菌(Str.lactis)基因補充了新宿主細菌的磷酸-β-半乳糖苷酶突變和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)突變。Lee等人［10］構(gòu)建了干酪乳桿菌64H(Lb.casei 64H)乳糖質(zhì)粒大腸桿菌(E.coli)基因庫并且成功分離了一株表達磷酸-β-半乳糖苷酶基因的克隆菌株，檢測了酶活性，同時用大腸桿菌(E.coli)微小細胞驗證了放射性同位素標記蛋白的存在。有學(xué)者試圖克隆pLP712質(zhì)粒中控制蛋白酶活性的基因，使用多拷貝大腸桿菌(E.coli)載體pAT153，通過分離缺失圖中片段，但并未成功。另也曾試圖克隆乳脂鏈球菌(Str.cremoris)質(zhì)粒pWV05的蛋白酶基因到大腸桿菌(E.coli)中，亦未能成功，原因可能為在大腸桿菌(E.coli)中蛋白酶的表達是致死的，目前研究者已開始研究替代大腸桿菌(E.coli)的方法來克隆蛋白酶基因。

3.3 轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)分析

有學(xué)者對乳酸鏈球菌(Str.lactis C2、712、ML3)中的乳糖基因進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，創(chuàng)造了新的乳糖質(zhì)粒，該質(zhì)粒與噬菌體基因組大小匹配，這些質(zhì)粒在轉(zhuǎn)移實驗中增加了轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率，此外，這些質(zhì)?？赡軘y帶了蛋白酶基因［17］。有學(xué)者使用乳酸鏈球菌(Str.lactis 712)的限制酶分析對噬菌體DNA、pLP712質(zhì)粒DNA和一些Lac+Prt+、Lac+Prt-轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒進行了對比。轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒含有部分缺失的pLP712質(zhì)粒DNA，而未攜帶噬菌體DNA。Lac+Prt+轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)物具有單一的基因缺失，并表現(xiàn)一定的一致性。相反，Lac+Prt-轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)物是不一致的，并且含有兩個或多個基因缺失。天然乳糖質(zhì)粒pLP712是不穩(wěn)定的，而且很容易發(fā)生缺失現(xiàn)象［13］。對溶菌原進行誘導(dǎo)后，一個大小合適的自發(fā)缺失的乳糖質(zhì)粒也許會被錯誤的轉(zhuǎn)入噬菌體頭部，缺失的乳糖質(zhì)?？赡芫蜁M行轉(zhuǎn)導(dǎo)，采用pLP712的限制酶圖譜和缺失圖譜可以進一步解釋Lac+Prt-轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)物多個基因缺失發(fā)生的原因。

在對乳糖質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，有學(xué)者對包含隱蔽性質(zhì)粒補體的乳酸鏈球菌(Str.lactis 712)菌株的乳糖質(zhì)粒進行了轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗［19］，同時也進行了插入染色體的實驗，實驗后發(fā)現(xiàn)了大的新的乳糖質(zhì)粒，大小分別是44Mdal和55Mdal。在這些大的乳糖質(zhì)粒轉(zhuǎn)移進入非攜帶質(zhì)粒的菌株后，對其進行了分子生物學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)它們是通過與一個受體隱蔽性質(zhì)粒重組轉(zhuǎn)導(dǎo)后形成的。

3.4 乳糖質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)分析

有學(xué)者將來自乳酸鏈球菌(Str.lactis ML3)的乳糖質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移進入一個非攜帶質(zhì)粒的乳酸鏈球菌(Str.lactis C2)突變體和非攜帶質(zhì)粒的乳酸鏈球菌(Str.lactis 712)后，產(chǎn)生了變異的菌株，變異的菌株具有高供體能力，并且表現(xiàn)為細胞聚集型組成型表達。對這些菌株進行堿變性裂解實驗后發(fā)現(xiàn)這些菌株具有擴大的乳糖質(zhì)粒［23］，同樣有些表型不變的菌株也具有擴大的質(zhì)粒。有學(xué)者對這2種擴大的質(zhì)粒分別與Str.lactis ML3的天然乳糖質(zhì)粒進行了對比，擴大的分子包含了完整的乳糖質(zhì)粒，但插入了新的DNA 分子［24］。

Anderson和McKay［5］使用重組缺陷的乳酸鏈球菌(Str.lactis ML3)菌株驗證了插入過程與宿主細胞生成的重組系統(tǒng)是相互獨立的，并繪制了大量的擴大的乳糖質(zhì)粒的限制酶圖譜，這些乳糖質(zhì)粒有些具有表型變化，有些不具有表型變化，并發(fā)現(xiàn)這些新的DNA的原始結(jié)構(gòu)都是環(huán)形的，可以在乳糖質(zhì)粒的固定位置以不同的指向自發(fā)的進行融合。插入的環(huán)形分子的融合位置決定了雜交的質(zhì)粒是否表現(xiàn)聚集型或(和)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。該項研究表明可能存在乳糖編碼的轉(zhuǎn)移因子以特定的方式編碼生成不同表型的擴大質(zhì)粒。

有學(xué)者通過在pLP712中引入兩個缺失位點而形成一個23.7kb微小乳糖質(zhì)粒，該質(zhì)粒小分子結(jié)構(gòu)更適合于分離和對插入DNA的分析。對大量的擴大的質(zhì)粒進行限制酶分析發(fā)現(xiàn)，插入位點發(fā)生在pLP712限制酶圖譜中一個3kb大小的固定位點，正如Anderson和McKay研究的一樣，插入的DNA不同但表現(xiàn)了一定的相關(guān)性。已成功繪制乳酸鏈球菌(Str.lactis 712)中環(huán)狀分子插入DNA的圖譜，觀察到插入的DNA具有一個相同的末端和一個不同的末端，從而決定了插入DNA分子大小的不同和插入系譜成員的不同。目前亟待解決的問題之一是新插入DNA片段來自哪里，有學(xué)者分析該片段可能是一個難以分離的質(zhì)粒，也可能是一個位于細菌染色體上的轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)移因子或者兩者都有［24］。

3.5 乳鏈球菌體內(nèi)DNA重排

當一個給定的乳鏈球菌的DNA包含一個細菌染色體和一個補體質(zhì)粒時，DNA在體內(nèi)的排列過程會發(fā)生改變。乳酸鏈球菌(Str.lactis 712)的乳糖質(zhì)粒缺失是非常容易發(fā)生的，在通過吖啶黃或升高溫度處理、原生質(zhì)體再生、重復(fù)培養(yǎng)傳代、接合轉(zhuǎn)移之后，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)可以被篩選出來。乳酸鏈球菌(Str.lactis 712、C2)和乳脂鏈球菌(Str.cremoris C3)乳糖質(zhì)粒的乳糖和蛋白酶基因可以在轉(zhuǎn)導(dǎo)后插入到到染色體中。在接合轉(zhuǎn)移過程中有時可以通過插入新的DNA來構(gòu)建擴大的乳糖質(zhì)粒。有學(xué)者已成功將一個擴大的乳糖質(zhì)粒的乳糖基因轉(zhuǎn)移到了一個8.5kb的缺乏重組系統(tǒng)的Str.lactis ML3突變體隱蔽性質(zhì)粒中［29］。在這些實驗中發(fā)現(xiàn)可以將DNA插入到一個乳糖質(zhì)粒的位點上來構(gòu)建通過接合轉(zhuǎn)移生成的擴大的乳糖質(zhì)粒，所有從非攜帶質(zhì)粒的乳酸鏈球菌(Str.lactis 712)菌株中篩選出來的Lac+Prt+質(zhì)粒都具有相同的消除位點，95%通過原生質(zhì)體融合生成的Lac+Prt-質(zhì)粒消除位點也是相同的。由這些有序的分子學(xué)相互作用可以看出在乳鏈球菌的基因組中可能存在插入序列和轉(zhuǎn)座子。Neve等人［15］發(fā)現(xiàn)細菌素質(zhì)粒與多種隱蔽性質(zhì)粒之間有較弱的雜交現(xiàn)象。

4 結(jié)論

乳酸菌遺傳學(xué)將會應(yīng)用到強化和創(chuàng)造新的發(fā)酵劑菌株當中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩條質(zhì)粒調(diào)控的噬菌體抗性、限制修飾和吸附阻塞機制?？刂七@些特性的基因被引用到不同的發(fā)酵劑菌株上，插入到已存在的發(fā)酵劑菌株質(zhì)粒上或通過基因克隆分離后的質(zhì)粒上，并可以由此獲取一套對噬菌體侵染防御更強的發(fā)酵劑菌株防御系統(tǒng)。通過插入染色體的方法，已成功獲取了乳酸鏈球菌(Str.lactis C2和712)中穩(wěn)定的乳糖和蛋白水解酶，這有利于控制蛋白水解酶及它在奶酪成熟過程中發(fā)揮的作用，改善它在干酪制作過程中產(chǎn)生異味物質(zhì)，并且還有可能控制基因的過表達?？梢酝ㄟ^分離藥物抗性菌株的方法進行改善奶酪中存留抗生素而導(dǎo)致發(fā)酵失敗的現(xiàn)象。通過原生質(zhì)體融合技術(shù)可以將抗冷凍基因轉(zhuǎn)移到新的菌株中，從而增加直投式發(fā)酵的應(yīng)用范圍。基因克隆技術(shù)的發(fā)展使乳酸菌在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用取得了更大的突破，如小牛皺胃酶，該基因已成功在大腸桿菌(E.coli)和酵母中克隆。

過去的10年間，乳制品乳酸菌已經(jīng)在遺傳工程和微生物群研究方面取得了重大的突破。在接下來的幾十年中將會看到分子生物學(xué)技術(shù)在實踐中的應(yīng)用及遺傳工程在乳酸菌中的應(yīng)用，對近年來難以攻克的遺傳現(xiàn)象將會有更加深入的理解。這些已經(jīng)成熟的傳統(tǒng)遺傳學(xué)分析手段將會在不久的將來用于生產(chǎn)乳業(yè)工業(yè)中新型的發(fā)酵劑菌株，例如質(zhì)粒轉(zhuǎn)移會應(yīng)用到生產(chǎn)噬菌體抗性更強或具有新的蛋白水解酶活性的菌株當中。遺傳學(xué)研究的未來是被肯定的，我們已經(jīng)進入到了乳業(yè)生物技術(shù)的時代中。

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