陳明珍，譚書明

1(貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽，550025)2(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽，550025)

3(貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽，550025)

糟辣椒(Pickling Pepper)是湖南、貴州等地區(qū)備受歡迎的傳統(tǒng)調(diào)味品。糟辣椒在生產(chǎn)和儲藏過程中很容易受到污染變質(zhì)，出現(xiàn)脹袋、脹罐的現(xiàn)象［1］，主要是糟辣椒中微生物的大量繁殖所致，包括細(xì)菌、霉菌、酵母菌［2-4］。因此，需要選擇合適方法來抑制微生物的生長繁殖，延長貨架期。

目前，國家允許在醬腌菜中添加苯甲酸鈉、山梨酸鉀、脫氫醋酸鈉、尼泊金酯鈉等幾種防腐劑［5-8］，傳統(tǒng)工藝中對糟辣椒的保藏技術(shù)主要是在糟辣椒發(fā)酵過程中添加單一的食品防腐劑:謝田［8］在糟辣椒發(fā)酵前分別加入脫氫醋酸鈉和苯甲酸鈉作對比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)均有一定的抑菌效果;李達(dá)［9］在糟辣椒發(fā)酵前加入殼聚糖對乳酸菌的生長繁殖有一定的抑制作用。由于不同防腐劑的抑菌原理各不相同，可想而知進(jìn)行防腐劑的復(fù)配使用，效果要比單獨(dú)使用好［10］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇脫氫醋酸鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀，對前期從糟辣椒中分離鑒定出的13種腐敗菌進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)的測定和抑菌直徑實(shí)驗(yàn)，確定每種防腐劑的用量范圍和典型菌的選擇。利用響應(yīng)面方法對復(fù)合防腐劑配方進(jìn)行優(yōu)化，在不改變工廠傳統(tǒng)的糟辣椒發(fā)酵工藝的情況下，對已發(fā)酵好的糟辣椒進(jìn)行保藏技術(shù)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種:從糟辣椒中分離出的13種腐敗菌，其中細(xì)菌10種、霉菌2種、酵母菌1種，分別標(biāo)號為X1發(fā)酵乳桿菌、X2馬尿片球菌、X3耐酸乳桿菌、X4同型腐酒乳桿菌、X5消旋乳酸芽孢桿菌、X6植物乳桿菌、X7食糖乳桿菌、X8米酒乳桿菌、X9彎曲乳桿菌、X10嗜熱釋放芽孢桿菌、M1青霉屬、M2毛霉屬、J1酵母菌。防腐劑:脫氫醋酸鈉(食品級)，鄭州超群化工產(chǎn)品有限公司;苯甲酸鈉(食品級)，山東淵智化工有限公司;山梨酸鉀(食品級)，鄭州皇朝化工產(chǎn)品有限公司。培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，虎紅培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基。

1.2 儀器和設(shè)備

超凈工作臺SW-CJ-IFD蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司;恒溫培養(yǎng)箱SPX-150B-I上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;立式壓力蒸汽滅菌鍋LS-875L-I江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;分析天平BSA124S合肥匯聯(lián)電子有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱101-3A天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法

1.3.1 菌懸液的制備

參照王向陽［11］的方法稍作修改，將細(xì)菌、霉菌分別接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，再分別置于37℃、27℃ 150 r/min的搖床上培養(yǎng)18 h(酵母菌的菌懸液的制備與霉菌相同)，再按照GB/4789.2-2010［12］中的計算公式計算出所配菌懸液的活菌數(shù)，將菌懸液調(diào)配成105CFU/mL，于4℃的冰箱中保存。

1.3.2 防腐劑溶液的配制

采用微量稀釋法，根據(jù) GB/2760-2011［13］中的要求，脫氫醋酸鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀的最大使用量分別為0.3、1、0.5 g/kg。將定量的防腐劑溶解于無菌水中，再將試劑分別以以下8種梯度加入相應(yīng)的培養(yǎng)基中，見表1。

表1 防腐劑的濃度梯度Table 1 The concentration gradient of Preservatives

1.3.3 典型菌的選取

采用測定MIC值的方法，選取對防腐劑反應(yīng)遲緩的、生長顯著的作為復(fù)配防腐劑選擇的典型菌。

1.3.4 響應(yīng)面的優(yōu)化

同一功能的食品添加劑(相同色澤著色劑、防腐劑、抗氧化劑)在混合使用時，各自用量占其最大使用量的比例之和不應(yīng)超過1［13］。根據(jù)3種防腐劑對13種腐敗菌的MIC值的平均值結(jié)果，來選取合適的濃度。采用3因素3水平的Box-Behnken的設(shè)計對脫氫醋酸鈉(A)、苯甲酸鈉(B)、山梨酸鉀(C)進(jìn)行復(fù)配，以抑菌圈直徑為響應(yīng)值，確定3種防腐劑的最優(yōu)配比。試驗(yàn)因素編碼和水平見表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計試驗(yàn)因素水平和編碼Table 2 Response surface of experimental factor levels

1.3.5 測定的方法

1.3.5.1 MIC值的測定

在無菌條件下，將防腐劑添加于培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)基凝固后加入0.1 mL的菌懸液，均勻涂布置于的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察(細(xì)菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)，霉菌和酵母菌用虎紅培養(yǎng)基)。細(xì)菌菌懸液置于37℃下培養(yǎng)2 d，霉菌菌懸液置于27℃下培養(yǎng)3 d，酵母菌懸液置于27℃下培養(yǎng)3 d。以不加防腐劑的為空白對照組，以培養(yǎng)基平板上完全無菌生長時的防腐劑濃度為 MIC［14］。

1.3.5.2 抑菌圈直徑的測定

參照吳影［15］的方法，將濾紙用打孔器打成6 mm的大小，滅菌后在相應(yīng)的防腐劑溶液中浸泡40 min后，將其放在已涂布了待測菌的相應(yīng)的培養(yǎng)基平板中，細(xì)菌培養(yǎng)2 d，霉菌和酵母菌培養(yǎng)4 d后測定其抑菌圈的直徑:d=d1-d2

d1:添加防腐劑的抑菌圈直徑;d2:空白組抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 典型菌的確定

不同防腐劑對糟辣椒中的腐敗菌的抑菌效果和差異顯著性結(jié)果如圖1所示。

圖1 三種防腐劑對腐敗菌的MIC值Fig.1 MIC’s of three preservatives against typical spoilage bacteria

從圖1可以看出，脫氫醋酸鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀對13種腐敗菌的抑菌效果各不相同。對于這3種防腐劑的MIC進(jìn)行顯著性分析可以看出:脫氫醋酸鈉對 X1、X3、X5、X7的抑制作用最強(qiáng)，對 X2、X9的抑制作用最弱;苯甲酸鈉對X6、M2的抑制作用最強(qiáng)，對X8、M1有較強(qiáng)的抑制作用，對 X2、X3、X5、X9、X10有較弱的抑制作用;山梨酸鉀對M1、M2的抑制作用最強(qiáng)，對 X3、X6、X8、X10有較強(qiáng)的抑制作用，對 X2、X9的抑制作用最弱?？梢钥闯?3種防腐劑對X2、X9的MIC值最大，因此選擇X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌作為防腐劑復(fù)配試驗(yàn)的典型菌。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果與分析

以菌X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌為試驗(yàn)菌進(jìn)行響應(yīng)面的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以抑菌圈直徑為響應(yīng)值，利用Design-Expert7.0軟件進(jìn)行回歸分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值結(jié)果Table 3 The response value results of response surface experimental

2.2.1 X2馬尿片球菌抑菌圈直徑回歸方程的確定

由表4可知，模型的一次項(xiàng)A(脫氫醋酸鈉)、C(山梨酸鉀)都顯著(P＜0.05)，B(苯甲酸鈉)極顯著(P ＜0.01)，二次項(xiàng) A2、C2顯著(P ＜0.05)，B2顯著(P＜0.01)，交互項(xiàng)AB極顯著(P＜0.01)，BC顯著(P ＜0.05)。

表4 X2馬尿片球菌抑菌圈直徑回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for Bacteriostatic circle diameter of X2Pediococcus urinae-equi

所選模型不同配比間的差異極顯著(P=0.001 5＜0.01)，說明模型間的變量和響應(yīng)值之間存在著極顯著的線性關(guān)系。失擬項(xiàng)P=0.7827＞0.05，沒有顯著性差異，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)無異常點(diǎn)，誤差較小;復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方為0.941 6，說明擬合程度很好，實(shí)驗(yàn)誤差較小。=0.866 5，說明建立的模型能夠解釋86.65%響應(yīng)值的變化，能夠很好的反映出抑菌圈的直徑隨著防腐劑添加量不同的變化規(guī)律，可以對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。對表中所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，通過分析得A、B、C與X2馬尿片球菌抑菌圈直徑之間的二次多項(xiàng)式模型為:

X2馬尿片球菌的抑菌圈直徑=6.47+0.23A+0.45B+0.20C-0.39AB-0.085AC-0.26 BC-0.28A2-0.38B2-0.25C2

式中:A、B、C分別代表不同防腐劑的編碼值。

2.2.2 X9彎曲乳桿菌抑菌圈直徑回歸方程的確定

由表5可知，模型的一次項(xiàng)C(山梨酸鉀)顯著(P＜0.05)，A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)極顯著(P ＜0.01)，二次項(xiàng) A2、B2、C2極顯著(P ＜0.01)，交互項(xiàng)AB、BC顯著(P＜0.05)。

表5 X9彎曲乳桿菌抑菌圈直徑回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis for Bacteriostatic circle diameter of X9Lactobacillus curvatus

所選模型不同配比間的差異極顯著(P＜0.000 1＜0.01)，說明模型間的變量和響應(yīng)值之間存在著極顯著的線性關(guān)系。失擬項(xiàng)0.913 8＞0.05，不顯著，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)無異常點(diǎn);復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.974 7，說明該模型擬合程度好。，說明建立的模型能夠解釋94.21%響應(yīng)值的變化。因此確定可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。對表中所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，通過分析得A、B、C與X9彎曲乳桿菌抑菌圈直徑之間的二次多項(xiàng)式模型為:

X9彎曲乳桿菌抑菌圈直徑=6.65+0.31A+0.42B+0.18C-0.21AB-0.077AC-0.22 BC-0.53A2-0.65B2-0.36C2

式中:A、B、C分別代表不同防腐劑的編碼值。

2.3 不同因素的交互作用分析

根據(jù)回歸方程繪制A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)、C(山梨酸鉀)3個因素對響應(yīng)值的響應(yīng)面圖和等高線圖。

2.3.1 A(脫氫醋酸鈉)和B(苯甲酸鈉)交互后最佳抑菌值的確定

從圖2可以看出，A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)之間的交互作用達(dá)到顯著水平。將C(山梨酸鉀)固定在零水平，可以得到A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)對X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的影響方程分別為:

X2=6.36+0.23A+0.45B-0.39AB-0.30 A2-0.40B2

X9=6.50+0.31A+0.42B-0.21AB-0.55A2-0.67B2

可以看出，隨著A和B添加量的增加，X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑也增加，但是A和B添加量過高都不利于對X2和X9的抑制，所以A(脫氫醋酸鈉)為0.1 mg/mL，B(苯甲酸鈉)為0.22 mg/mL在，X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑最大。

圖2 A(脫氫醋酸鈉)和B(苯甲酸鈉)響應(yīng)面和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot showing the interactive effects of sodium acetate and sodium benzoate

2.3.2 A(脫氫醋酸鈉)和C(山梨酸鉀)交互后最佳抑菌值的確定

從圖3可以看出，A(脫氫醋酸鈉)和C(山梨酸鉀)之間的交互作用不顯著。將B(苯甲酸鈉)固定在零水平，可以得到A(脫氫醋酸鈉)和C(山梨酸鉀)對X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的影響方程分別為:

X2馬尿片球菌 =6.31+0.23A+0.20C-0.085AC-0.30A2-0.27C2

X9彎曲乳桿菌 =6.37+0.31 A+0.18C-0.077AC-0.57A2-0.39C2

同時，隨著A(脫氫醋酸鈉)和C(山梨酸鉀)添加量的增加，X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑也增加，但是A(脫氫醋酸鈉)和C(山梨酸鉀)添加量過高都不利于對X2馬尿片球菌、X9彎曲乳桿菌的抑制，所以A(脫氫醋酸鈉)為0.1 mg/mL，C(山梨酸鉀)為0.14 mg/mL時，X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑最大。

圖3 A(脫氫醋酸鈉)和C(山梨酸鉀)響應(yīng)面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plot showing the interactive effects of sodium acetate and potassium sorbate

2.3.3 B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)交互后最佳抑菌值的確定

從圖4可以看出，B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)之間的交互作用達(dá)到顯著水平。將A(脫氫醋酸鈉)固定在零水平，可以得到B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)對X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的影響方程分別為:

X2馬尿片球菌 =6.35+0.45B+0.20C-0.26BC-0.40B2-0.27C2

X9彎曲乳桿菌 =6.42+0.42B+0.18C-0.22BC-0.68B2-0.39C2

同時，隨著B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)添加量的增加，X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑也增加，但是B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)添加量過高都不利于對X2馬尿片球菌、X9彎曲乳桿菌的抑制，所以B(苯甲酸鈉)為0.22 mg/mL，C(山梨酸鉀)為0.14 mg/mL時，X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑最大。

2.3.4 模型的優(yōu)化和驗(yàn)證

通過分析可以得到最佳的工藝參數(shù)為:A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)最佳添加量分別為0.1 mg/mL、0.22 mg/mL、0.14 mg/mL。做3組平行實(shí)驗(yàn)，得到X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑平均值分別為6.61 mm和6.73 mm，與理論預(yù)測值6.59 mm和6.75 mm非常接近，說明了該模型可以很好的預(yù)測防腐劑的量與抑菌圈直徑的關(guān)系，同時證明響應(yīng)面優(yōu)化得到的最優(yōu)配方的可行性。

3 結(jié)論

通過測定出A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)3種防腐劑對糟辣椒中13種腐敗菌的最低抑菌濃度MIC值，得到X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的繁殖能力和對這3種防腐劑的抗性均較強(qiáng)，為簡化實(shí)驗(yàn)，以這兩種菌作為典型菌進(jìn)行響應(yīng)面的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。通過響應(yīng)面法建立了A(脫氫醋酸鈉)、B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)與抑菌直徑的回歸模型:

X2馬尿片球菌的抑菌圈直徑=6.47+0.23A+0.45B+0.20C-0.39AB-0.085AC-0.26 BC-0.28A2-0.38B2-0.25C2

X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑=6.65+0.31A+0.42B+0.18C-0.21AB-0.077AC-0.22 BC-0.53A2-0.65B2-0.36C2

根據(jù)回歸方程和實(shí)際情況，最終得到最佳配方的添加量為A(脫氫醋酸鈉)0.1 mg/mL、B(苯甲酸鈉)0.22 mg/mL、C(山梨酸鉀)0.14 mg/mL，在最佳配方測得X2馬尿片球菌和X9彎曲乳桿菌的抑菌圈直徑分別為6.61 mm和6.73 mm，具有明顯效果。

圖4 B(苯甲酸鈉)和C(山梨酸鉀)響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot showing the interactive effects of sodium benzoate and potassium sorbate

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