李洪冉，張萬民，陶云荔，樸春樹，張 丹，褚 棟*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東省植物病蟲害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109;2.遼寧省植物保護(hù)站，沈陽 110034)

溫室白粉虱 Trialeurodes vaporariorum(Westwood)和煙粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)均是重要的世界性昆蟲，它們的寄主范圍非常廣泛，主要危害棉花、蔬菜和花卉等植物。兩者危害特征極為相似，均可以通過直接刺吸植物汁液致使植株衰弱矮小，分泌蜜露誘發(fā)煤污病，影響植物光合作用，導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降，以及傳播病毒等多種方式對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成直接或間接的危害(Brown et al.，1995;李清西等，1997;胡敦孝等，2001)。與溫室白粉虱比較，煙粉虱寄主范圍更廣泛、適應(yīng)性更強(qiáng)、危害更嚴(yán)重、抗藥性更強(qiáng)(楊秀清等，2001)。煙粉虱還是傳播雙生病毒如番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)、番茄斑駁病毒(ToMoV)、撒丁島番茄黃化曲葉病毒(TYLCSV)等許多植物病毒的重要媒介(糾敏等，2006)。煙粉虱是含有多種生物型/隱蔽種的復(fù)合種，其中B型與Q 型是入侵性較強(qiáng)、分布較廣的2種。相對(duì)于B 型煙粉虱，Q 型煙粉虱對(duì)許多農(nóng)藥尤其對(duì)新煙堿類農(nóng)藥具有更強(qiáng)更穩(wěn)定的抗藥性，還具有更強(qiáng)的傳毒能力(褚棟等，2007;Pan et al.，2012;Liu et al.，2013)。

昆蟲的越冬是長期適應(yīng)自然條件及季節(jié)變遷、完成生活史的一種生活對(duì)策。昆蟲越冬基數(shù)的大小以及越冬后能否在初春合適的發(fā)育溫度下正常羽化將決定著來年該蟲的發(fā)生及危害程度。已有的研究表明，隨著溫室、大棚等保溫栽培設(shè)施的大量出現(xiàn)，煙粉虱可以在我國從南到北的溫室、大棚內(nèi)越冬(崔洪瑩等，2011;張萬民等，2013)。我們前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)遼寧省溫室白粉虱與煙粉虱偽蛹能在最冷月份(1月)的溫室大棚內(nèi)存活(張萬民等，2013);在該地區(qū)所有采集的煙粉虱樣品中，Q 型煙粉虱所占比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過B 型。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)越冬的煙粉虱偽蛹攜帶雙生病毒—番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)(張萬民等，2013)。那么，2種越冬粉虱偽蛹在初春溫度升高后是否可以正常羽化及生長發(fā)育，煙粉虱偽蛹羽化成蟲是否仍然攜帶TYLCV，尚需進(jìn)一步的系統(tǒng)調(diào)查。該方面的研究是科學(xué)制定煙粉虱防治技術(shù)方案的基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)于番茄黃化曲葉病毒病的早春防控也具有重要的指導(dǎo)意義。

為了進(jìn)一步明確溫室內(nèi)越冬后的粉虱偽蛹初春能否正常發(fā)育以及煙粉虱攜帶TYLCV 的情況，我們于2013年4月份中旬(可揭棚的時(shí)期)在遼寧省部分縣市區(qū)的溫室作物上采集了粉虱偽蛹，通過在顯微鏡下的觀察統(tǒng)計(jì)了粉虱偽蛹羽化情況;鑒別了粉虱種類并對(duì)煙粉虱生物型進(jìn)行了鑒定;然后檢測了新羽化煙粉虱攜帶TYLCV 的情況。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源采集

試驗(yàn)所用的粉虱偽蛹均是在2013年4月中旬采自于遼寧省部分縣市區(qū)的溫室作物上。摘取有粉虱偽蛹的寄主植物葉片(一個(gè)地點(diǎn)至少采集10片作為一份樣品)，然后將寄主葉片帶入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行觀察鑒定，其采集地點(diǎn)、寄主作物及樣品代碼如表1 所示。

1.2 粉虱羽化率

每樣品隨機(jī)挑取30 頭活的粉虱偽蛹于另一新鮮寄主葉片，放在墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿(加數(shù)滴水保持一定濕度)中讓其羽化。每天觀察粉虱偽蛹的羽化情況(直到不再有偽蛹羽化為止)，并記錄羽化的粉虱數(shù)量。

表1 遼寧省各地粉虱偽蛹采樣信息Table 1 Information of samples of whitefly pseudo-pupae in Liaoning，China

1.3 鑒定粉虱種類

在遼寧省部分地區(qū)所采集的每個(gè)樣品中隨機(jī)取15 頭羽化出的粉虱成蟲(JP1 地區(qū)取14 頭)。將粉虱成蟲標(biāo)本放在載玻片上，將其置于Nikon 光學(xué)顯微鏡下(目鏡16×、物鏡10×)，不使用電源光，僅在自然光較亮的環(huán)境下，調(diào)整好成蟲的復(fù)眼角度進(jìn)行觀察，比較種間復(fù)眼形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異以確定粉虱種類(褚棟等，2008)，分別記錄2種粉虱的數(shù)量(表1)。同時(shí)，利用能夠鑒別溫室白粉虱與煙粉虱的特異性引物進(jìn)一步進(jìn)行了區(qū)分(專利申請(qǐng)?zhí)?201310192726.5)。

1.4 煙粉虱生物型鑒定

將鑒定出的煙粉虱利用PCR-RFLP 方法快速鑒別其B 型與Q 型(Chu et al.，2010)。單頭煙粉虱DNA 提取方法參照褚棟等(2005)，煙粉虱mt COI 片段擴(kuò)增參照Chu 等(2010)，所用引物為Cl-J-2195(5'-TTBATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3')和R-BQ-2819(5'-CTGAATATCGAGGCATTCC-3')，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為620 bp 左右。分別以已知B 型、Q 型煙粉虱DNA 為模板進(jìn)行PCR 作為B 型、Q 型煙粉虱的對(duì)照。PCR 產(chǎn)物酶切后以1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB 染色后在紫外透視儀上觀察，記錄結(jié)果。每份樣品檢測10 頭(其中鞍山岫巖XY樣品含有6 頭)。同時(shí)，為了進(jìn)一步確定煙粉虱生物型，每份樣品的3 頭煙粉虱的mt COI 的PCR 產(chǎn)物直接進(jìn)行雙向測序。

1.5 煙粉虱攜帶TYCLV 檢測

使用 TYLCV 特異引物(上游引物5'-CGCCCGTCTCGAAGGTTC-3';下游引物5'-GCCATATACAATAACAAGGC-3')(Picó et al.，1988)對(duì)14 份樣品中的煙粉虱進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每份樣品中所有煙粉虱進(jìn)行檢測(其中鞍山岫巖XY樣品含有6 頭)，反應(yīng)體系參照Picó et al.(1998)。以已知TYLCV 基因組為模板作為陽性對(duì)照，以水為模板作為陰性對(duì)照。取5μL PCR 產(chǎn)物，在1.0%瓊脂糖上電泳后，EB 染色，凝膠成像觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 粉虱羽化率與物種

粉虱的羽化率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(圖1)，遼寧省14 份偽蛹樣品均可羽化，平均羽化率77%;其中，4 份樣品的羽化率較高(比例≥90%)，分別為錦州TH1、葫蘆島LSH1、葫蘆島LSH2 和葫蘆島LSH3。僅有一份樣品的羽化率低于50%，為朝陽JP1 樣品。

圖1 遼寧省部分縣市區(qū)粉虱偽蛹羽化率Fig.1 Emergence rate of overwintering whitefly pseudopupae in early spring in Liaoning Province

通過復(fù)眼鏡檢法鑒別粉虱種類發(fā)現(xiàn)(表1)，遼寧省14 份樣品中，10 份樣品為煙粉虱種群，僅4 份樣品為煙粉虱和溫室白粉虱混合種群(占樣品比例29%)，分別為鞍山岫巖XY 樣品、大連WFD樣品、葫蘆島LSH1 樣品和盤錦DW 樣品。并且4 份混合種群樣品中，僅在鞍山岫巖XY 樣品中溫室白粉虱占優(yōu)勢(比例≥50%)。

2.2 煙粉虱生物型鑒定及攜毒檢測

通過mtCOI 基因片段對(duì)遼寧部分地區(qū)煙粉虱生物型進(jìn)行鑒定及系統(tǒng)分析(圖2)，所有檢出的煙粉虱中只檢測到了B 型和Q 型煙粉虱。PCR-RFLP 方法表明，在14 煙粉虱樣品(包括煙粉虱與溫室白粉虱混合樣品)中，僅有2 份樣品為B型與Q 型混合樣品，為盤錦DW 樣品和丹東FCH1樣品(表1)，并且在2 份樣品中Q 型煙粉虱均占優(yōu)勢(比例≥50%)，其他12 份煙粉虱樣品生物型均為Q 型。

利用PCR 檢測新羽化煙粉虱體內(nèi)TYLCV 的檢測，發(fā)現(xiàn)14 份樣品中的所有煙粉虱體內(nèi)均未檢測到TYLCV 的存在。

圖2 遼寧省部分縣市區(qū)煙粉虱生物型比例Fig.2 Biotype of Bemisia tabaci in Liaoning Province

3 結(jié)論與討論

本研究研究發(fā)現(xiàn)遼寧省部分地區(qū)保護(hù)地內(nèi)的粉虱(含有溫室白粉虱與煙粉虱)初春時(shí)期能夠正常羽化(羽化率范圍為47%-93%)。這與崔洪瑩等(2011)田間觀察結(jié)果是一致的。崔洪瑩等(2011)研究發(fā)現(xiàn)煙粉虱可以在中國越冬北界分布線以北地區(qū)的雙膜覆蓋大棚和日光溫室等保護(hù)地設(shè)施中越冬。本研究還發(fā)現(xiàn)，成功羽化的粉虱在多數(shù)樣品中是以煙粉虱為主，表明當(dāng)前遼寧省保護(hù)地內(nèi)煙粉虱種群逐步演變?yōu)閮?yōu)勢粉虱種群。這與露地作物生長季節(jié)田間粉虱調(diào)查是一致的(張萬民等，2012)。同時(shí)，在煙粉虱樣品中，Q 型煙粉虱所占比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于B 型占據(jù)主導(dǎo)地位，這與遼寧省2011年與2012年露地作物生長季節(jié)煙粉虱生物型調(diào)查結(jié)果也是一致的(張萬民等，2012)。這些結(jié)果提示，初春羽化后粉虱種類及煙粉虱生物型與次年粉虱的發(fā)生動(dòng)態(tài)是密切相關(guān)的。

本研究發(fā)現(xiàn)，在初春成功羽化的煙粉虱體內(nèi)沒有檢測到TYLCV，這可能與寄主、蟲齡及研究的種群數(shù)量等相關(guān)。首先，本次研究的煙粉虱種群寄主植物中，TYLCV 傳播寄主植物如番茄等較少，可能導(dǎo)致TYLCV 毒源缺乏，從而使煙粉虱獲毒概率減小，這可能成為我們沒有檢測到TYLCV的主要原因之一。Ghanim 等(1998)發(fā)現(xiàn)取食TYLCV 的煙粉虱在棉花與茄子上的各個(gè)齡期以及下一代成蟲仍然攜帶該病毒。如果番茄寄主較多，其體內(nèi)含有TYLCV 的概率會(huì)較大，下一代成蟲可能攜帶該病毒的概率也會(huì)較大。新羽化成蟲也可能在很短的時(shí)間內(nèi)可以通過取食攜毒植物來獲取TYLCV(糾敏等，2006)。張萬民等(2013)研究發(fā)現(xiàn)遼寧省越冬溫室內(nèi)的煙粉虱偽蛹體內(nèi)含有TYLCV，其采集的煙粉虱種群大多數(shù)來自于番茄寄主。這在一定程度上說明了煙粉虱體內(nèi)的TYLCV 的檢出率與采集的植物是否為TYLCV 感染寄主有關(guān)。

其次，由于煙粉虱傳播TYLCV 出現(xiàn)了依賴蟲齡傳播的模式，攜帶TYLCV 的煙粉虱成蟲可以將病毒垂直傳播到第一代后代的卵期并且這段未成熟的時(shí)期是其傳播TYLCV 頻率最高的階段，而隨著煙粉虱蟲齡的增大，其傳播頻率卻在不斷地減小，在同一代的煙粉虱蛹期和成蟲期就已經(jīng)無法檢測到TYLCV。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的可能解釋是隨著煙粉虱蟲齡的增大體內(nèi)免疫反應(yīng)被激活，包括抗菌肽和自噬性溶酶體的產(chǎn)生，導(dǎo)致煙粉虱體內(nèi)病毒濃度逐漸降低，從而使TYLCV 僅在未成熟的卵期及幼蟲期可以存在，而到了蛹期和成蟲期逐漸降低直至消失(Pan et al.，2012)。因此，這也是本研究中在煙粉虱新羽化成蟲體內(nèi)沒有檢測到TYLCV 另一重要原因。

此外，本研究中我們檢測的種群數(shù)量較少同樣可能影響煙粉虱體內(nèi)TYLCV 檢出率。但是，在溫室內(nèi)的患病植株上如果一直存有著TYLCV，當(dāng)新羽化的煙粉虱成蟲取食攜帶病毒植株上的葉片時(shí)，仍然會(huì)將TYLCV 傳播到健康植株上造成危害。因此，加強(qiáng)越冬代煙粉虱的防控對(duì)于早春煙粉虱和番茄黃化曲葉病毒病的防控具有重要意義。

References)

Brown JK，F(xiàn)rohlich DR，Rosell RC.The sweet potato or silverleaf whiteflies:biotypes of Bemisia tabaci or a species complex［J］?Annual Review of Entomology，1995，40:511-534.

Chu D，Hou LX，Liu GX，et al.Molecular identification of a new tomato yellow leaf curl virus in partial regions of Shandong Province［J］.Shandong Agricultural Sciences，2010，2:13-15，19.［褚棟，侯麗霞，劉國霞，等.山東省局部地區(qū)番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，2:13-15，19］

Chu D，Liu GX，Wan FH，et al.Population dynamics of biotypes Q and B of Bemisia tabaci(Gennadius)and the influential factors［J］.Acta Phytophylacica Sinica，2007，34(3):326-330.［褚棟，劉國霞，萬方浩，等.煙粉虱Q 型與B 型種群動(dòng)態(tài)及其影響因子研究進(jìn)展［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2007，34(3):326-330］

Chu D，Wang B，Zhang SH，et al.Rapid differentiation between Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum adults by microscopic examination of compound eyes［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2008，45(1):154-155.［褚棟，王斌，張四海，等.一種快速鑒別煙粉虱與溫室白粉虱成蟲的方法—復(fù)眼鏡檢法［J］.昆蟲知識(shí)，2008，45(1):154-155］

Chu D，Zhang YJ，Cong B，et al.Sequence analysis of mtDNA COI gene and molecular phylogeny of different geographical populations of Bemisia tabaci(Gennadius)［J］.Scientia Agriculture Sinica，2005，38(1):76-85.［褚棟，張友軍，叢斌，等.煙粉虱不同地理種群的mtDNA COI 基因序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38(1):76-85］

Chu D，Zhang YJ，Wan FH.Cryptic invasion of the exotic Bemisia tabaci biotype Q occurred widespread in Shandong Province of China［J］.Florida Entomologist，2010，93:203-207.

Cui HY，Guo HJ，Ge F.The cold hardiness and northern distribution boundary of overwintering whiteflies，Bemisia tabaci，in China［J］.Plant Protection，2011，37(1):65-69.［崔洪瑩，郭慧娟，戈峰.煙粉虱的耐寒能力與自然越冬北界分析［J］.植物保護(hù)，2011，37(1):65-69］

Ghanim M，Morin S，Zeidan M，et al.Evidence for transovarial transmission of tomato yellow leaf curl virus by its vector，the whitefly Bemisia tabaci［J］.Virology，1998，240:295-303.

Hu DX，Wu XX.Distinctions between Bemisia tabaci Gennadius and Trialeurodes vaporariorum Westwood［J］.Plant Protection，2001，27(5):15-18.［胡敦孝，吳杏霞.煙粉虱和溫室白粉虱的區(qū)別［J］.植物保護(hù)，2001，27(5):15-18］

Jiu M，Zhou XP，Liu SS.Transmission of geminiviruses by whitefly［J］.Acta Entomologica Sinica，2006，49(3):513-520.［糾敏，周雪平，劉樹生.煙粉虱傳播雙生病毒研究進(jìn)展［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2006，49(3):513-520］

Li QX，Zhao L，Zhang J.Review of the biology and control of greenhouse whitefly Trialeurodes vaporariorum(Homoptera，Aleyrodiae)［J］.Journal of Xinjiang Agricultural University，1997，20(2):22-28.［李清西，趙莉，張軍.溫室白粉虱Trialeurodes vaporariorium(Westwood)生物學(xué)及其防治［J］.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，20(2):22-28］

Liu BM，Preisser EL，Chu D，et al.Multiple forms of vector manipulation by a plant-infecting virus:Bemisia tabaci and tomato yellow leaf curl virus［J］.Journal of Virology，2013，doi:10.1128/JⅥ.03571-12.

Pan HP，Chu D，Yan WQ，et al.Rapid spread of tomato yellow leaf curl virus in China is aided differentially by two invasive whiteflies［J］.PLo SONE，2012，7(4):e34817.doi:10.1371/journal.pone.0034817.

Picó B，Díez MJ，Nuez F.Evaluation of whitefly mediated inoculation techniques to screen Lycopersicon esculentum and wild relatives for resistance to tomato yellow leaf curl virus［J］.Euphytica，1998，101:259-271.

Sun ZW，Yang JX，Zhang MZ，et al.Occurrence and control of Tomato yellow leaf curl virus disease in Shandong Province［J］.China Vegetables，2009，21:5-6.［孫作文，楊進(jìn)緖，張美珍，等.山東省番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生及其防治［J］.中國蔬菜，2009，21:5-6］

Xu J，Wang WL，Liu SS.The occurrence and infestation of Bemisia tabaci biotype Q in partial regions of Zhejiang Province［J］.Plant Protection，2006，32(4):121.［徐婧，王文麗，劉樹生.Q 型煙粉虱在浙江局部地區(qū)大量發(fā)生危害［J］.植物保護(hù)，2006，32(4):121］

Yang XQ，Gao XW，Zheng BZ.Comparison of the activity of the enzymes related to insecticide resistance in Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci［J］.Chinese Journal of Pesticide Science，2001，3(4):38-43.［楊秀清，高希武，鄭炳宗.煙粉虱與溫室白粉虱羧酸酯酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶性質(zhì)的比較研究［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，3(4):38-43］

Zhang WM，Li HR，Piao CS，et al.Species identification of whitefly pseudo-pupae and detection of the infection status of Tomato yellow leaf curl virus within Bemisia tabaci(Gennadius)in over-wintering greenhouse in Liaoning，China［J］.Acta Entomologica Sinica，2013，56(8):945-951.［張萬民，李洪冉，樸春樹，等.遼寧省越冬溫室內(nèi)粉虱偽蛹的種類鑒定及煙粉虱體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒的檢測［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2013，56(8):945-951］

Zhang WM，Ma H，Hong XY，et al.Occurrence of tomato yellow leaf curl virus and succession of whitefly populations in Liaoning Province［J］.China Plant Protection，2012，32(7):27-28.［張萬民，馬輝，洪曉燕，等.遼寧省番茄黃化曲葉病毒病發(fā)生及粉虱種群演替情況［J］.植物保護(hù)導(dǎo)刊，2012，32(7):27-28］