李惠萍,王靜慧,張龍霞,劉海峰,劉曉琳
(山西出入境檢驗(yàn)檢疫局,太原 030024)
球蚧類蚧蟲在分類學(xué)上屬于蚧科(Coccidae),因其雌成蟲在發(fā)育過程中蟲體膨大成半球狀并變硬,而被歸為球蚧類(湯祊德,1991)。球蚧類雌成蟲發(fā)育前期蟲體較扁,易于制作玻片標(biāo)本,形態(tài)比較規(guī)則,鑒定特征明顯(湯祊德,1991),但此期較短,甚至只有幾天,因此樣本的獲得變得困難;發(fā)育中期蟲體體壁鼓起成半球狀,有些種類高達(dá)14 mm;發(fā)育后期蟲體皺縮干枯,變脆變硬,甚至木質(zhì)化,幾乎不能用來制作標(biāo)本,實(shí)現(xiàn)對(duì)種類的鑒定(謝映平,1998)。
目前,生物技術(shù)已越來越廣泛地運(yùn)用于生物領(lǐng)域,已開始從分子水平上探討物種進(jìn)化以及相似種的鑒定。在蚧蟲的系統(tǒng)進(jìn)化方面,國外科學(xué)家在功能基因,親本起源和協(xié)同進(jìn)化等方面進(jìn)行了部分研究,也有運(yùn)用分子標(biāo)記做蚧蟲近似種的區(qū)分或復(fù)合種鑒別(Rung et al.,2008;Edwards et al.,2008;Provencher et al.,2005),Park 等(2011)對(duì)粉蚧和盾蚧兩科的蚧蟲進(jìn)行了DNA 條碼數(shù)據(jù)的研究。在我國,蚧蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究剛剛起步,僅高寶嘉等(2007)采用RAPD 技術(shù)測(cè)定分析了河北省皺大球蚧和瘤堅(jiān)大球蚧8個(gè)地理種群的遺傳結(jié)構(gòu)。馬力等(2007)篩選出了適合蚧蟲DNA 擴(kuò)增的引物“AGAGGTGGGCAGGTG”。
基因組DNA 的提取是任何分子學(xué)研究的前提,因此許多研究致力于建立快速、穩(wěn)定地提取高質(zhì)量基因組方法。果蠅、瓢蟲、蝗蟲等大型昆蟲,因材料易取,運(yùn)用常規(guī)提取方法(SDS)或改進(jìn)的提取方法或提取試劑盒即可完成基因組DNA的提取(Harrison 1987;Taylor,1993;代金霞等,2004),對(duì)于小型昆蟲如蚧蟲,因其活動(dòng)器官嚴(yán)重退化,只剩下膜質(zhì)或革質(zhì)或木質(zhì)化的體壁和體液,使得其基因組的提取難度加大。因此國內(nèi)外學(xué)者正努力嘗試多種提取方法來獲得基因組,如采用試劑盒方法(Edwards et al.,2008;Provencher et al.,2005),sunnucks 鹽析法(Morse et al.,2006),silica 方法或玻璃纖緯方法替代了酚氯仿抽提(Park et al.,2011),CTAB 和NaCL 方法(石晶等,2005)等等均有報(bào)道。
但這些報(bào)道大多是對(duì)盾蚧和粉蚧的研究,材料常選擇高濃度酒精浸泡的新鮮蟲體。石晶等(2005)和高寶嘉等(2007)對(duì)棗大球蚧和皺大球蚧的研究中,同樣選擇了新鮮蟲體試驗(yàn),而且對(duì)于材料的前處理過程描述不多或簡(jiǎn)單。這些方法在蚧蟲分子研究的實(shí)際應(yīng)用中會(huì)有些限制,如材料不一定新鮮,或用常規(guī)濃度的酒精固定的樣本,或遇到特殊的體壁極其硬化甚至木質(zhì)化的球蚧類蚧蟲。那么材料前處理是否成為解決基因組提取的關(guān)鍵環(huán)節(jié)也有待研究。本文嘗試在材料的選擇和前處理過程兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行試驗(yàn),并進(jìn)行SDS、CTAB、TES、NaCl 和TNES 五種提取方法的篩選,旨在獲得一種適合球蚧基因組DNA 提取的有效方法。
本實(shí)驗(yàn)以棗大球蚧 Eulecanium gigantea(Shinji)、皺大球蚧Eulecanium kuwanai(Kanda)、盔蚧屬一種 Saissetia sp.、沙里院褐球蚧Rhodococcus sariuoni Borchsenius、朝鮮毛球蚧Didesmococcus koreanus Borchsenius、扶桑綿粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley、白蠟綿粉蚧Phenacoccus fraxinus Tang 和桔小粉蚧Pseudococcus cryptus Hempel 為研究對(duì)象(表1)。所有標(biāo)本的成蟲都經(jīng)準(zhǔn)確的鑒定,供試材料置于-20℃冰箱中保存待用。
表1 供試的蚧蟲種類一覽表Table 1 The list of scale insect species for testing
1.2.1 試劑:
CTAB、EDTA、TRIS 購自上海索萊寶生物科技有限公司;蛋白酶K、RNA 酶購自Takala 寶生物工程(大連)有限公司;Agarose 購自Invitrogen公司;β-巰基乙醇購自美國Amresco。
1.2.2 儀器:
EYEL4 恒溫水槽(日本)、Miniplus 離心機(jī)(德國Eppendorf)、Bio-RAD Power Pac 300 電泳系統(tǒng)(美國伯樂)、GENE GENIUS 全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(英國Syngene)、微量紫外分光光度儀(德國jena)。
采集球蚧樣品時(shí),一部分用75%酒精溶液直接固定,盡快置于-4℃冰箱保存,一部分連同寄主枝干一起采回。盡快將采回的樣品在室內(nèi)剝離寄主置-20℃冰箱冷凍保存。本實(shí)驗(yàn)所用樣品大都在此條件下保存1-3年。
本實(shí)驗(yàn)選擇不同的樣品材料,一是整頭蟲體,二是蟲體外骨髂,即表皮。試驗(yàn)前,對(duì)于整頭蟲體的材料須進(jìn)行顯微檢查,選擇單頭非寄生的蟲體,用100%酒精清洗至蟲體表面干凈,再用蒸餾水浸泡清洗三次,每次浸泡30 min,自然晾干;對(duì)于蟲體外骨骼的材料,同樣要用100%酒精清洗干凈體內(nèi)物質(zhì),再用蒸餾水洗滌4-5 次,涼干待用。
本實(shí)驗(yàn)將選擇好的樣品材料放入1.5 mL 離心管中,分別加入 SDS、CTAB、TES、NaCL 和TNES 法的提取緩沖液或裂緩沖液以剛剛淹沒材料,始終保持在冰上剪碎。
1)SDS 法(童麗娟等,2002)
在本文1.5 剪碎樣品的EP 管中,補(bǔ)加入SDS法裂解緩沖液(100 mmol/L NaC1,10 rnmol/L Tris-HCl,50 mmol/L EDTA,0.5% SDS,蛋白酶K100 ug,0.2% β-巰基乙醇)至400μL,65℃水浴1 h。室溫下,12000 r/min 離心10 min。取上清液加入300μL 飽和NaC1 溶液混勻,12000 r/min離心10 min。取上清液移加等體積異丙醇,輕輕混勻后置-20℃冰箱1 h。在4℃下,12000 r/min離心15 min。棄液體,用70%酒精洗滌沉淀,待完全干燥后加適量TE 溶解DNA,4℃或-20℃保存待用。
2)CTAB 法(Boyce T.M.等,1989)
在本文1.5 剪碎樣品的EP 管中,補(bǔ)加入CTAB 法提取緩沖液(Tris-HC1 100 mmol/L,20 mmol/L EDTA,1.4 mol/L NaC1,0.2% β-巰基乙醇,50 mmol/L CTAB,pH 8.3)至400μL,65℃水浴1 h。加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25∶24∶1),12000 r/min 離心10 min。取上清加入等體積的氯仿:異戊醇(24∶1),12000 r/min離心10 min。取上清加入等體積預(yù)冷的異丙醇,輕輕混后置-20℃ 沉 淀 1 h,4℃,12000 r/min離心15 min。棄液體,用500μL 70%乙醇溶液洗滌DNA,4℃,12000 r/min 離心1 min。棄液體,待完全干燥后,加入適量TE 溶解,4℃或-20℃保存待用。
3)TES 法(張敏等,2008)
在本文1.5 mL 剪碎樣品的EP 管中,補(bǔ)加入TES 法提取沖液(100 mmol/L Tris-HCl,1.4 mol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,pH8.0,l%SDS,0.2 mg/mL 蛋白酶K)至400μL,55℃水浴10 h。加入等體積飽和酚,顛倒混勻,12000 r/min離心10 min。取上清,加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25∶24∶1),12000 r/min 離心10 min。取上清加入等體積的氯仿:異戊醇(24∶1),12000 r/min 離心10 min。取上清液加入2 倍體積預(yù)冷的無水乙醇,-20℃沉淀1 h,4℃,12000 r/min離心15 min。棄液體加500μL 70%乙醇溶液,洗滌DNA,4℃,12000 r/min 離心1 min。棄液體,待完全干燥后,加入適量TE 溶解,4℃或-20℃保存待用。
4)NaCl 法(石晶等,2005)
在本文1.5 mL 剪碎樣品的EP 管中,補(bǔ)加入NaCl 法提取緩沖液(10 mmol/L Tris-HCI,pH 8.0,100 mmol/LNaCl,1 mmol/L EDTA)至400μL,加90-100μL 10%SDS、4-5 uLRNA酶,37℃水浴1 h。加4-5μL 蛋白酶K,55℃消化6-12 h 或者過夜消化,12000 r/min 離心10 min。取上清,加6 mol/L NaCl 溶液600μL,12000 r/min 離心30 min。取上清加2 倍體積預(yù)冷的無水乙,-20℃冰箱靜 1 h,4℃,12000 r/min離心15 min。棄液體加500μL 70%乙醇溶液洗滌DNA,4℃,12000 r/min 離心1 min。棄液體,待完全干燥后,加入適量TE 溶解,4℃或-20℃保存待用。
5)TNES 法(Paul Sunnucks 等,1996)
在本文1.5 剪碎樣品的EP 管中,補(bǔ)加入TNES 法提取緩沖液(50 mmol/L Tris-HCI,pH 8.0,400 mmol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,0.5 %SDS)至300 ul,加入0.1 mg/mL 蛋白酶K,37℃中水浴8 h。加入5 mol/L 氯化鈉溶液85μL,劇烈搖晃20 s,13000 r/min 離心10 min。取上清,加入2 倍體積預(yù)冷的無水乙醇,輕輕混勻后置于-20℃冰箱中沉淀1 h,4℃ 12000 r/min 離心15 min。棄液體加入500μL 70% 乙醇溶液洗滌DNA,4℃,12000 r/min 離心1 min。棄液體,加入適量TE 溶解,4℃或-20℃保存待用。
用1%瓊脂糖凝膠、1×TAE 電泳緩沖液檢測(cè)所提取的DNA,各取5μL;電壓120 V,室溫下電泳30-45 min,EB 染色,用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。用微量紫外分光光度儀測(cè)定OD260nm和OD280nm,以O(shè)D260nm/OD280nm比值分析DNA 的純度。
對(duì)運(yùn)用CTAB 法提取的球蚧基因組DNA,采用C.Simon 等(1994)報(bào)道的mtDNA 中COⅠ和CO Ⅱ通用引物 C1-J-2753ywr(5'-GTAAACCTAACATTTTTYCCWCARCA-3')和C2-N-3662(5'-CCACAAATTTCTGAACATTGACC-3')進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。
擴(kuò)增體系:Taq DNA 聚合酶0.25μL、10×Buffer 5μL、dNTP 4μL、上游引物1μL、下游引物1μL,模板5μL,ddH2O 補(bǔ)足50μL。擴(kuò)增條件:94 ℃3 min 后,按94 ℃,1 min;50-40℃(-2℃/1 cycle),1 min;72 ℃,2 min 進(jìn)行33個(gè)循環(huán),72 ℃,10 min。4℃保存。
PCR 擴(kuò)增結(jié)束后取6μL 擴(kuò)增產(chǎn)物與溴酚藍(lán)混勻,以1×TAE 緩沖液、1%瓊脂糖凝膠電泳,附帶Marker 檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,球蚧類蚧蟲材料無論是冷凍保存還是75%酒精固定液-4℃保存均可完成基因組的提取。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)于球蚧類蚧蟲,蟲體體壁更容易提取出全基因組。表2 給出用五種蚧蟲整蟲提取的DNA OD 值為1.3-1.5,而用體壁提取的DNA OD 值為1.7-1.8。顯然選擇蚧蟲體壁作為提取材料,更適全基因組的獲得。
表2 用不同材料提取DNA 的OD 值Table 2 OD value of genomic DNA from different samples
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用剪刀剪碎的方式更適合球蚧類蚧蟲的基因組的提取,實(shí)驗(yàn)過程中不難發(fā)現(xiàn),球蚧類蚧蟲的外骨骼木質(zhì)化,有韌性,研磨杵很難將其分開磨碎。
圖1 五種方法提取基因組的電泳圖Fig.1 The electrophorgram of genomic DNA abstracted using SDS、CTAB、TES、NaCL and TNES methods
由圖1 可知,CTAB 法、TES 法和TNES 法對(duì)五種球蚧均可提出較為完整的基因組,而用SDS法和NaCl 法對(duì)棗大球蚧則沒能獲得基因組。同時(shí)結(jié)果表明TES 和TNES 法獲得的基因組DNA 混有或多或少蛋白質(zhì)、色素或RNA,而CTAB 法提取的基因組DNA 主條帶清晰整齊,無拖尾降解現(xiàn)象,DNA 純度很高。
總體來看,材料選擇和樣品前處理方法對(duì)后續(xù)的基因組提取至關(guān)重要,本研究所嘗試的以球蚧體壁作為提取材料及運(yùn)用剪碎的樣品處理方法,更是五種后續(xù)提取方法得以成功獲得基因組DNA的關(guān)鍵所在,圖1 也可看出,除棗大球蚧外,其它球蚧運(yùn)用這五種方法,均獲得了基因組,只是基因組的純度有差異而已,完全可通過修改純化步驟來改進(jìn)。
圖2 五種球蚧基因擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Gene amplification electrophorgram of five scale insect species
經(jīng)過后續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn),表明利用CTAB 法提取的五種球蚧基因組DNA 擴(kuò)增的目的片段穩(wěn)定,且擴(kuò)增條帶單一、亮度高,顯然CTAB 法提取球蚧基因組DNA 的效果非常好。
用于分子試驗(yàn)的生物樣本,采用冷凍低溫保存是目前最好的保存方法,無水乙醇保存方法也是有效的,但不宜長期保存(李夢(mèng),2006),用福爾馬林常溫浸泡和75%酒精常溫密封保存的昆蟲數(shù)周后也可用于分子試驗(yàn)(林萬華等,2006)。本試驗(yàn)表明,用75%酒精密封-4℃可保存較長時(shí)間,甚至達(dá)到冷凍低溫保存的時(shí)間和效果。但在試驗(yàn)前,樣本必須經(jīng)過蒸餾水充分洗滌,以置換樣本體內(nèi)酒精,消除酒精對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響。同時(shí)75%酒精溶液保存樣本的方法是常規(guī)的生物學(xué)方法,便于野外采集標(biāo)本的保存和運(yùn)輸,更有利于生物學(xué)研究和分子學(xué)研究的進(jìn)一步開展。
基因組提取的關(guān)鍵步驟是材料的破碎,對(duì)小型昆蟲的破碎,大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道采用勻漿棒搗碎或者研碎,但對(duì)于蚧蟲,由于蟲體極小,在提取緩沖液中容易漂浮;且體壁韌性大,不易搗碎或研碎。同時(shí)如果搗碎或研碎的時(shí)間太長會(huì)使基因組降解。當(dāng)然也有利用液氮研磨以及超聲破碎的(安瑞生等,2002),但這兩種方法卻不適合球蚧類蚧蟲體壁的研碎,且因蟲體小,液氮研磨后,材料粘壁,不易收集。本實(shí)驗(yàn)將蚧蟲放入裝有提取緩沖液的離心管中置于-20℃冰箱中冷凍,然后用預(yù)冷的小剪刀在冰上剪碎,既解決了蟲體在提取緩沖液中漂動(dòng)的問題,又使得基因組不易被自身的核酸酶降解。
本實(shí)驗(yàn)在對(duì)球蚧進(jìn)行基因組DNA 提取過程中,發(fā)現(xiàn)有很多色素和蛋白質(zhì),這就給如何獲得高質(zhì)量的DNA 帶來了困擾。五種提取方法比較表明,CTAB 法的去除效果最好。但DNA 損失較大。另外,我們也嘗試運(yùn)用試劑盒(Qiagen Dneasy tissue kit)進(jìn)行了試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)對(duì)于體壁硬化的球蚧類,無法提取出基因組,而對(duì)于膜質(zhì)的粉蚧類,可以提取出來,這跟國外大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道相一致(Edwards et al.,2008;Provencher et al.,2005)。但蚧蟲種類多,結(jié)構(gòu)差異也大,不會(huì)有固定的提取方法,還需大量的試驗(yàn)來建立相關(guān)類群的有效提取方法。
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