賀春玲，張淑霞，嵇保中

(1.河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471003;2.河南出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南洛陽(yáng) 471000;3.南京林業(yè)大學(xué)森林環(huán)境學(xué)院，南京 210037)

10-羥基-2-癸烯酸((E)-10-hydrox-2-decylenic acid，簡(jiǎn)稱10-HDA)又稱王漿酸，是一種不飽和脂肪酸，是蜂王漿中含有的特殊高效生物活性物質(zhì)(陳盛祿，2001;洪梅和史伯倫，2001;劉曉華和孫文基，2004)。10-HDA 主要由蜜蜂工蜂的上顎腺分泌，另外，從不同蜂產(chǎn)品中也檢測(cè)到10-HDA 的存在，意大利蜜蜂幼蟲(chóng)體內(nèi)含有少量的10-HDA(李全陽(yáng)，1999);蜂膠中10-HDA 平均含量為0.22%(潘建國(guó)等，2005)。從微生物中選育出產(chǎn)10-HDA 菌株，并通過(guò)改良產(chǎn)10-HDA 能力不穩(wěn)定的微生物菌株，提高其產(chǎn)10-HDA 的能力(王騰飛等，2006;王海燕，2008)。10-HDA 有多種生理活性，它具有抗菌、滅菌、強(qiáng)壯機(jī)體和強(qiáng)烈抑制淋巴癌、乳腺癌等多種癌細(xì)胞的作用，還有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等功能(Townsend et al.，1960;倪輝等，2006;賀春玲等，2007;王文鳳等，2007;黃盟盟，2010;陶文卿，2012)。袁耀東(1991)報(bào)道工蜂在采集花粉過(guò)程中，向花粉粒中分泌10-HDA，使花粉迅速喪失了發(fā)芽力。

在蜂糧釀制過(guò)程中，蜂糧中的花粉會(huì)很快失去萌發(fā)力，從而提高蜂糧的保質(zhì)期。蘇松坤等(2002)采用氯化三苯基四氮唑(TTC)花粉活性測(cè)定法測(cè)定蜜蜂茶花粉蜂糧樣品中花粉粒的活力。隨釀制時(shí)間的延長(zhǎng)花粉逐漸失去活力，在第5 d 花粉生活力完全失去活性。文獻(xiàn)報(bào)道蜂糧中花粉失去萌發(fā)力是因?yàn)樵诿鄯溽勝A蜂糧的過(guò)程中加入了唾腺分泌物10-HDA，在10-HDA 的作用下花粉粒很快喪失了發(fā)芽力(袁耀東，1991);10-HDA對(duì)植物的花粉萌發(fā)、花粉管伸長(zhǎng)和生殖核的有絲分裂有強(qiáng)烈的抑制作用(許雅香等，2000);但是，茶花粉蜜蜂蜂糧中沒(méi)有檢測(cè)到10-HDA(蘇松坤，2000)。賀春玲等(2010)報(bào)道長(zhǎng)木蜂Xylocopa tranquebarorum 蜂糧在釀制過(guò)程中花粉活力隨釀制時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸失去活力，在1 日齡蜂糧中花粉活力相比手采花粉明顯下降，3 日齡后均失去萌發(fā)力，并且不同的花粉蜂糧其花粉活力表現(xiàn)一致，本文為進(jìn)一步明確長(zhǎng)木蜂蜂糧中有無(wú)10-HDA的存在及其擔(dān)負(fù)的功能進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 長(zhǎng)木蜂蜂花粉和蜂糧樣品

在南京情侶園花卉公園采集芍藥長(zhǎng)木蜂蜂糧。芍藥花粉蜂糧的采集方法同賀春玲等(2010)。

1.1.2 不同植物花粉的采集

2008年3月下旬至2008年5月下旬，在南京情侶園花卉公園，在植物的盛花期采集已經(jīng)盛開(kāi)的植物花粉(長(zhǎng)木蜂釀貯蜂糧盛期采訪植物的新鮮花粉)，用無(wú)菌的鑷子取其花粉放入滅菌的5 mL離心管中，低溫條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，4℃保存?zhèn)溆谩Ｖ饕杉闹参锘ǚ塾?二月蘭Orychophragmus violaceus、紫藤Wisteria sinensis、芍藥Paeonia lactiflora。

1.1.3 試劑和儀器

試劑:10-羥基-2-癸烯酸(中國(guó)藥品生物制品鑒定所)。

儀器:多功能型全自動(dòng)菌落/顯微圖像分析儀(杭州迅數(shù)科技有限公司);

1.2 方法

1.2.1 芍藥花粉、芍藥長(zhǎng)木蜂花粉和不同日齡的蜂糧樣品處理

稱取芍藥花粉、不同時(shí)間(2007年和2008年)的芍藥長(zhǎng)木蜂蜂糧樣品各0.2 g，分別放入甲醇溶液中用玻璃勻漿器研磨，研磨后的樣品放入10 mL 的離心管中，用無(wú)水甲醇定容至5 mL，超聲提取10 min，以10000 r/min 離心10 min，取上清液;連續(xù)離心三次，合并上清液，用氮吹儀揮去甲醇，待測(cè)定用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品處理和色譜條件

標(biāo)準(zhǔn)品:稱取0.0067 g 10-HDA 對(duì)照品，用色譜甲醇溶解至0.5 mL，再取20μL 稀釋100 倍后備用。

樣品:提取的樣品用色譜甲醇定溶至0.5 mL，

高效液相色譜柱:Zorbax SB C18 150×4.6，3.5μm;采用反相液相色譜，流動(dòng)相:水(0.1%TFA)∶甲醇(7∶3);柱溫:室溫;檢測(cè)波長(zhǎng):213 nm;流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:標(biāo)準(zhǔn)品為1 mL，樣品為20 mL;采用外表法定量，內(nèi)標(biāo)法定性。

1.2.3 10-HDA 對(duì)花粉萌發(fā)的抑制作用

營(yíng)養(yǎng)液為20%蔗糖+0.01%硼酸。在培養(yǎng)液內(nèi)添加HDA，配成1250μg/mL、625μg/mL、312.5μg/mL、156.2μg/mL、78.1μg/mL 五個(gè)濃度梯度。將配制好的不同濃度梯度的培養(yǎng)液用移液槍取200μL 滴人滅菌凹面載玻片的凹槽內(nèi)，將不同樣品的花粉均勻地灑在培養(yǎng)液上，放在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，25℃恒溫箱內(nèi)保濕培養(yǎng)12 h，觀察不同時(shí)間花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。每處理2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨即觀察5個(gè)視野。兩次重復(fù)的平均值為該處理的抑制率。抑制率=(對(duì)照組萌發(fā)率-處理組的萌發(fā)率)/對(duì)照組的萌發(fā)率×100%

1.3 數(shù)據(jù)采集與分析

采用多功能型全自動(dòng)菌落/顯微圖像分析儀(杭州迅數(shù)科技有限公司生產(chǎn))進(jìn)行數(shù)據(jù)采集;采用Microsoft Excel 和SPSS Base Ver.13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂糧中10-HDA 的測(cè)定

10-HDA 標(biāo)準(zhǔn)品在恒溶劑系統(tǒng)中保留時(shí)間為8.367 min，蜂糧樣品在8.365 min 時(shí)出現(xiàn)一個(gè)峰，并且通過(guò)內(nèi)標(biāo)法顯示在標(biāo)準(zhǔn)品和蜂糧樣品混合樣品中在8.379 min 時(shí)出現(xiàn)一個(gè)峰，在該峰的前后沒(méi)有其它峰，初步確定在蜂糧樣品中有10-HDA 的存在。同樣的方法，在芍藥花粉中沒(méi)有檢測(cè)到10-HDA(圖1)。

圖1 蜂糧中10-HDA 的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of 10-HDA content in bee bread

2.2 10-HDA 對(duì)花粉萌發(fā)的抑制作用

2.2.1 10-HDA 對(duì)二月蘭花粉的抑制作用

10-HDA 對(duì)二月蘭花粉的萌發(fā)有非常顯著的抑制作用，在含有156.25μg/mL 10-HDA 的培養(yǎng)液上，其抑制率達(dá)70%以上，10-HDA 抑菌率幾率值與濃度對(duì)數(shù)之間的線性方程為y=1.6154x+1.8141(r2=0.9891)，EC50為93.81μg/mL(表1)。

2.2.2 10-HDA 對(duì)紫藤花粉的抑制作用

10-HDA 對(duì)紫藤花粉的萌發(fā)有顯著的抑制作用，在含有625μg/mL 10-HDA 的培養(yǎng)液上，其抑制率達(dá)76%以上，10-HDA 抑菌率幾率值與濃度對(duì)數(shù)之間的線性方程為y=1.7953x+1.0923(r2=0.9301)，EC50為150.18μg/mL(表2)。

表2 10-HDA 對(duì)紫藤花粉萌發(fā)的影響Table 2 The effect of 10-HDA on the pollen germination ratio of Wisteria sinensis

2.2.3 10-HDA 對(duì)芍藥花粉的抑制作用

10-HDA 對(duì)芍藥花粉的萌發(fā)有明顯的抑制作用，在含有312.5μg/mL 10-HDA 的培養(yǎng)液上，其抑制率接近70%，10-HDA 抑菌率幾率值與濃度對(duì)數(shù)之間的線性方程為y=1.6592x+1.4881(r2=0.9871)，EC50為130.81μg/mL(表3)。

2.3 10-HDA 對(duì)不同花粉的花粉管生長(zhǎng)的影響

10-HDA 對(duì)二月蘭、紫藤、芍藥花粉的花粉管生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用(表4)。在供試的10-HDA濃度梯度下，隨著10-HDA 濃度的增加對(duì)花粉管的生長(zhǎng)抑制表現(xiàn)明顯;對(duì)不同花粉的花粉管生長(zhǎng)的抑制作用不同，二月蘭花粉的花粉管生長(zhǎng)情況表現(xiàn)為10-HDA 各處理和對(duì)照之間表現(xiàn)出明顯差異，而不同10-HDA 濃度梯度之間花粉管的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異;紫藤花粉和芍藥花粉的花粉管生長(zhǎng)情況均表現(xiàn)為10-HDA 各處理和對(duì)照之間有明顯差異，且10-HDA 不同濃度梯度之間花粉管的生長(zhǎng)也有顯著差異。

表3 10-HDA 對(duì)芍藥花粉萌發(fā)的影響Table 3 The effect of 10-HDA on the pollen germination ratio of Paeonia lactiflora

表4 10-HDA 對(duì)不同花粉樣品花粉管生長(zhǎng)的影響Table 4 The effect of 10-HDA on the pollen tube growth of different pollen samples

3 結(jié)論與討論

10-HDA 主要分泌于蜜蜂工蜂的上顎腺。不同日齡的工蜂上顎腺分泌10-HAD 的能力不同，剛出房的工蜂上顎腺中含量極微，隨著日齡的增加，含量有增加的趨勢(shì)，15-20 日齡哺育蜂的上顎腺中含量最高，20 日齡以后開(kāi)始有降低的趨勢(shì)，在蜂群大繁殖期含量極高，而外勤蜂上顎腺中的10-HDA 含量則極低(李全陽(yáng)，1999;荊戰(zhàn)星，2010);長(zhǎng)木蜂屬于野生蜜蜂，雌蜂沒(méi)有職能上的分工，越冬的雌蜂擔(dān)負(fù)筑巢、采集花粉制作蜂糧并產(chǎn)卵(賀春玲等，2009)。在研究過(guò)程中，我們解剖長(zhǎng)木蜂雌蜂的上顎腺和咽下腺，并初步采用高效液相法測(cè)定10-HDA 的有無(wú)，結(jié)果在上顎腺?zèng)]有檢測(cè)到10-HDA，而在咽下腺中檢測(cè)到10-HDA，因檢測(cè)結(jié)果與蜜蜂的研究結(jié)果不同，還有待進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)定和驗(yàn)證。在解剖不同日齡的長(zhǎng)木蜂雌蜂腺體，也發(fā)現(xiàn)腺體的飽滿程度有區(qū)別，其分泌活性有無(wú)差別還有待進(jìn)一步研究。不同花源的蜂王漿樣品中10-HDA 的含量也不同(羅莉萍等，2006)，是否因?yàn)椴煌貐^(qū)蜜源不同對(duì)蜜蜂工蜂分泌能力有影響，也有待進(jìn)一步研究。

蜜蜂在采集花粉上分泌唾腺分泌物，唾腺分泌物中含有的王漿酸(10-羥基-2-癸烯酸)，使花粉迅速喪失發(fā)芽力(袁耀東，1991)。但蘇松坤(2000)在茶花粉蜜蜂蜂糧中未檢測(cè)到10-HDA，花粉活力隨蜂糧釀制過(guò)程而迅速失去活力。賀春玲等(2010)測(cè)定紫藤花粉的長(zhǎng)木蜂蜂糧和芍藥花粉的長(zhǎng)木蜂蜂糧中的花粉活力，測(cè)定結(jié)果表明在1 日齡蜂糧中花粉活力明顯下降，3 日齡后均失去萌發(fā)力，并且不同的花粉蜂糧其花粉活力表現(xiàn)一致。本文采用高效液相色譜法檢測(cè)到芍藥花粉中沒(méi)有10-HDA，長(zhǎng)木蜂蜂糧有10-HDA。通過(guò)采用10-HDA 的標(biāo)準(zhǔn)品在不同濃度下對(duì)花粉萌發(fā)抑制作用測(cè)定結(jié)果看，發(fā)現(xiàn)10-HDA 對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)起到抑制作用，初步推測(cè)長(zhǎng)木蜂蜂糧中花粉萌發(fā)的抑制作用與10-HDA 的存在有關(guān)。長(zhǎng)木蜂蜂糧中抑制花粉萌發(fā)的因素還有待進(jìn)一步研究。長(zhǎng)木蜂屬于野生蜂類，10-HDA 的分泌能力以及分泌場(chǎng)所與家養(yǎng)蜜蜂是否一致，還有待進(jìn)一步研究。關(guān)于家養(yǎng)蜜蜂和野生蜜蜂腺體活性成分之間的差異未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，有待在后續(xù)的研究工作中通過(guò)可靠的理論去證實(shí)。

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