黃 芳，酈衛(wèi)弟，時(shí) 敏，呂要斌，陳學(xué)新*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)和微生物研究所，杭州 310021;2.浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所，杭州 310058)

小菜蛾P(guān)lutella xylostella 在進(jìn)入蛹變態(tài)期前，會(huì)吐絲結(jié)繭，將蛹包裹在絲繭內(nèi)得到保護(hù)。絲以氨基酸順序高度重復(fù)的蛋白為主要成分，以液體形式存在于昆蟲體內(nèi)。在幼蟲發(fā)育至近蛹期時(shí)，這些液體蛋白經(jīng)由絲腺分泌排出體外。絲腺是一對(duì)管狀的、具有合成和分泌絲線的腺體。有研究表明，鱗翅目昆蟲用絲進(jìn)行信息交流，控制周圍的環(huán)境和自我保護(hù)(Schaller，1971)。菜蛾盤絨繭蜂是小菜蛾的優(yōu)勢(shì)寄生蜂，大量的研究表明其寄生對(duì)寄主的生理具有顯著的影響，如功能血細(xì)胞死亡(Yu et al.，2007);脂肪體的結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞功能缺失，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無法大量積累(白素芬等，2009);精巢、中腸、前胸腺等器官結(jié)構(gòu)發(fā)生異變，相關(guān)酶活性降低(狄蕊等，2006;Bai et al.，2009);此外，翅芽分化(白素芬等，2003)、精子發(fā)生(蔡?hào)|章等，2006)等生理過程也受到不同程度的破壞。但到目前為止，尚未有任何研究涉及該寄生蜂對(duì)寄主幼蟲絲腺的影響。菜蛾盤絨繭蜂的前期個(gè)體發(fā)育在寄主體內(nèi)完成，在進(jìn)入蛹期之前，會(huì)在寄主體壁上鉆孔爬出后化蛹;此時(shí)，寄主小菜蛾已喪失吐絲結(jié)繭的能力，寄主絲繭不成為幼蜂脫離寄主的阻礙。據(jù)此推測(cè)，菜蛾盤絨繭蜂通過抑制寄主絲繭的形成以便于完成自身個(gè)體發(fā)育。鑒于此，本文擬對(duì)菜蛾盤絨繭蜂寄生后小菜蛾絲腺相關(guān)的生理過程進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步了解并補(bǔ)充該寄生蜂對(duì)寄主小菜蛾的生理調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 昆蟲飼養(yǎng)

小菜蛾的飼養(yǎng)條件為:22±1℃，60%-80%相對(duì)濕度，光周期L14∶D10;每天供給20%(體積比)的蜂蜜水。

菜蛾盤絨繭蜂飼養(yǎng)條件同上，每天供給10%的蜂蜜水。

1.2 供試?yán)ハx的選取

小菜蛾2 齡幼蟲大小及生理狀態(tài)具有高度的一致性，因此為保證實(shí)驗(yàn)中處理與對(duì)照的可比性，供實(shí)驗(yàn)用蟲均采用剛進(jìn)入3 齡的幼蟲。

寄生后小菜蛾幼蟲的獲取:采用單頭寄生的方法，即在小試管(長(zhǎng)8 cm、直徑1.5 cm)內(nèi)引入羽化2 d 已交配過的雌蜂1 頭，然后用毛筆挑取小菜蛾幼蟲1 頭放入管內(nèi)，觀察產(chǎn)卵行為發(fā)生1 次后用毛筆移出幼蟲，換另1 頭未寄生的幼蟲重復(fù)操作，控制每頭雌蜂寄生30 頭左右。將寄生過的小菜蛾幼蟲接到事先準(zhǔn)備好的葉片或盆菜上飼養(yǎng)，用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 絲腺的解剖及獲得

菜蛾盤絨繭蜂寄生后的小菜蛾，在寄生后，每隔24 h 取樣，直至繭蜂幼蟲從寄主小菜蛾體內(nèi)鉆出為止。

在PBS 中解剖蟲體，將完整的絲腺取出后在相同的緩沖液中清洗三次，然后將絲腺挑入冰浴中的PBS 中，研磨后，800 g 離心10 min，上清為絲腺內(nèi)分泌物樣品，于-80℃儲(chǔ)存。

1.4 絲腺蛋白分析

以SDS-PAGE 電泳的方法分析絲腺蛋白組分，電泳條件為:12%的分離膠，2.5%濃縮膠，電極緩沖液為Tris-甘氨酸電極緩沖液系統(tǒng);電泳電壓80 V。Bradford 方法測(cè)蛋白濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 寄生對(duì)寄主小菜蛾絲腺形態(tài)的影響

正常小菜蛾幼蟲絲腺形態(tài)的變化過程:2 齡小菜蛾幼蟲絲腺細(xì)胞已清晰可見，頂端兩列分泌類細(xì)胞交替有序排列，圓形胞核位于細(xì)胞中央，可以觀察到濃縮后呈條帶相互纏繞的DNA(圖1A);發(fā)育至3 齡后，細(xì)胞縱向成長(zhǎng)為原來的2 倍，胞核亦隨之?dāng)U大，呈橢圓位于細(xì)胞中央，核內(nèi)物質(zhì)均勻，但電子緊密度低于2 齡幼蟲(圖1B);發(fā)育至4 齡初，胞質(zhì)密度加大，胞核被擠至細(xì)胞邊緣(圖1C)，至4 齡末，胞內(nèi)無明顯核質(zhì)分界，兩列細(xì)胞間出現(xiàn)直徑勻一的管道空腔，可以看到均勻膨大的管道內(nèi)充滿透明的液體(圖1D);至預(yù)蛹時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，空腔亦消失(圖1E)，此后12 h，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全消失(圖1F)。

圖1 未寄生小菜蛾不同齡期絲腺頂端分泌細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察Fig.1 Structure of anterior cells in the silk gland of Plutella xylostella larvae

被菜蛾盤絨繭蜂寄生后2 齡小菜蛾發(fā)育至3 齡時(shí)，其絲腺細(xì)胞胞核腫脹，占據(jù)細(xì)胞大部分空間，細(xì)胞形狀不勻一，有時(shí)兩列細(xì)胞間可出現(xiàn)畸形的空腔(圖2A);發(fā)育至4 齡初，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)消失，但胞間分隔仍清晰可見(圖2B)，至4 齡末，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失(圖2C)。

圖2 菜蛾盤絨繭蜂寄生后小菜蛾不同齡期絲腺頂端分泌細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察Fig.2 Structure of anterior cells in the silk gland of Plutella xylostella larvae parasitized by Cotesia vestalis

2.2 寄生對(duì)寄主小菜蛾絲腺長(zhǎng)度及蛋白濃度的影響

小菜蛾被菜蛾盤絨繭蜂寄生后，其絲腺長(zhǎng)度及蛋白濃度變化如圖3 所示。寄生后小菜蛾幼蟲的絲腺長(zhǎng)度顯著短于對(duì)照;同時(shí)絲腺內(nèi)蛋白含量也顯著低于對(duì)照。

2.3 寄生對(duì)寄主小菜蛾絲腺蛋白組分的影響

菜蛾盤絨繭蜂寄生后對(duì)寄主小菜蛾幼蟲絲腺分泌蛋白組成的影響如圖4 所示:寄生后0-12 h之內(nèi)，不管是絲腺分泌腔內(nèi)還是絲腺分泌細(xì)胞的蛋白組分都沒有發(fā)生變化;在寄生后24 h 時(shí)，對(duì)照絲腺分泌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)分子量大小約為80 kDa的蛋白，隨著時(shí)間發(fā)展，這個(gè)蛋白的分泌量越來越大，而寄生后則沒有;在寄生后12 h 和24 h，對(duì)照和寄生后的幼蟲均存在大小為180 kDa 左右的蛋白，但是經(jīng)過36 h 后對(duì)照樣品內(nèi)此蛋白消失，而在寄生后的幼蟲中則一直存在;同時(shí)對(duì)照內(nèi)出現(xiàn)了分子量在80-90 之間、30-60 之間的大量蛋白，但是寄生后則沒有，除了一個(gè)分子量為20 kDa 的蛋白?？偟膩碚f，被繭蜂寄生后的寄主小菜蛾幼蟲絲腺的分泌蛋白與對(duì)照的主要區(qū)別在于50 kDa以上的蛋白含量和種類的不同。

圖3 菜蛾盤絨繭蜂寄生對(duì)小菜蛾絲腺長(zhǎng)度及蛋白含量的影響Fig.3 Effects of parasitism by Cotesia vestalis on the length and protein concentration in the silk gland of the diamondback moth

圖4 菜蛾盤絨繭蜂寄生對(duì)小菜蛾幼蟲絲腺蛋白組分的影響Fig.4 Effects of parasitism by Cotesia vestalis on the protein profiles in the silk gland of the diamondback moth

3 結(jié)論與討論

小菜蛾幼蟲絲腺屬于下唇型原生絲腺，與家蠶的絲腺功能相同，主要用于泌絲(Marsh et al.，1955;王孟卿和彩萬志，2004);但另有研究證實(shí)，絲腺細(xì)胞的分泌物質(zhì)還與蟲體的其他生理過程密切相關(guān)，如免疫系統(tǒng)(Kim et al.，2010a)、鈣離子內(nèi)平衡(Kim et al.，2010b)等。家蠶幼蟲期絲腺體積的增加全靠細(xì)胞的膨大，當(dāng)幼蟲完成吐絲結(jié)繭進(jìn)入預(yù)蛹期開始變態(tài)時(shí)絲腺細(xì)胞被消化，化蛹后腺細(xì)胞全部消失(Terashima et al.，2000)。小菜蛾絲腺的發(fā)育過程與家蠶類似，其消亡過程為一系列的細(xì)胞凋亡過程(鐘仰進(jìn)等，2005)。被菜蛾盤絨繭蜂寄生的小菜蛾體內(nèi)的大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被寄生蜂吸收(白素芬等，2009)，同時(shí)，寄主幼蟲體內(nèi)的激素水平會(huì)發(fā)生一系列的變化(Lee and Kim，2004)，以上代謝過程的改變都可能是導(dǎo)致絲腺細(xì)胞無法膨大的原因;同時(shí)，絲腺細(xì)胞分泌功能的衰減或喪失可能導(dǎo)致小菜蛾幼蟲的免疫系統(tǒng)進(jìn)一步變?nèi)?，以利于寄生蜂幼蜂的生長(zhǎng)發(fā)育。張義成等通過比較18種鱗翅目昆蟲絲腺的形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)，認(rèn)為絲腺細(xì)胞的膨大及數(shù)量直接與絲腺細(xì)胞對(duì)血淋巴中的氨基酸利用率的高低相關(guān);因此，小菜蛾被菜蛾盤絨繭蜂寄生后絲腺的形態(tài)變化可能源于寄主體內(nèi)免疫系統(tǒng)紊亂，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺失，寄主體內(nèi)的能量重新分配和激素水平改變，但以上推測(cè)仍需進(jìn)一步的研究進(jìn)行證實(shí)。

被菜蛾盤絨繭蜂寄生后的寄主小菜蛾幼蟲絲腺的分泌蛋白與對(duì)照的主要區(qū)別在于寄生后幼蟲絲腺內(nèi)容物缺失了幾種大小在50 kDa 以上的蛋白，而該類大分子蛋白是鱗翅目幼蟲絲繭形成的主要蛋白;此類蛋白的缺失可能是由于絲腺前端分泌類細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損造成的。

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