薛海燕，秦婧，宋宏新，韓芳，潘潔

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710021)

0 引 言

牛乳κ-酪蛋白（κ-CN）占總酪蛋白的13%，僅由169個(gè)氨基酸組成[1]，主要分布在在酪蛋白膠束外部，起穩(wěn)定膠束作用[2]，是牛乳保持乳濁液狀態(tài)的重要因子。它還是凝乳酶的特異性底物，所以乳中κ-CN的質(zhì)量濃度會(huì)影響凝乳時(shí)間和強(qiáng)度，同時(shí)乳中κ-酪蛋白質(zhì)量濃度較少受季節(jié)、飼料等的影響[3-4]，相對比較穩(wěn)定，因此定量檢測κ-酪蛋白質(zhì)量濃度對牛乳原料及乳酪生產(chǎn)質(zhì)量控制等乳品加工過程具有重要意義。κ-CN抗原專一性較強(qiáng)，熱處理對其抗原性影響較小，因此可用免疫學(xué)技術(shù)進(jìn)行特異性檢測。雞IgY屬IgG類抗體，是卵黃中唯一的Ig[5-6]，具有不與補(bǔ)體結(jié)合，易對保守抗原產(chǎn)生應(yīng)答，收集方便，產(chǎn)量大等特點(diǎn)，在免疫檢測方面應(yīng)用前景廣闊[7-9]。本研究針對牛乳κ-酪蛋白制備了IgG與IgY兩種抗體，將經(jīng)免疫吸收后的抗體用于間接ELISA檢測κ-CN，實(shí)現(xiàn)了κ-CN的定量檢測，為牛乳原料及產(chǎn)品控制提供技術(shù)支持。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：新西蘭大白兔3只，雄性，17～18周齡，2～3 kg/只，無前期病史。免疫用雞為3個(gè)月臨產(chǎn)蛋母雞（狀態(tài)良好，生長整齊，重約1.2 kg，前期無病史）。

牛乳κ-酪蛋白(κ-CN)標(biāo)準(zhǔn)品，弗式完全佐劑及不完全佐劑，標(biāo)準(zhǔn)兔IgG，標(biāo)準(zhǔn)雞IgY，HRP酶聯(lián)羊抗兔IgG及HRP酶聯(lián)兔抗雞IgG，其他試劑均為優(yōu)級純或分析純。

儀器：Multiskan MK3酶標(biāo)儀，?KTA purifier 10快速純化系統(tǒng)，HiTrapTM IgY Purification HP（柱體積5 mL），親和色譜HiTrap rProtein A FF（柱體積1 mL），96孔酶標(biāo)板孔，混合纖維素酯微孔濾膜 （0.45 μm，Φ50 mm）。

1.2 方法

1.2.1 抗牛κ-CN特異性IgG和IgY的制備

抗牛κ-CN特異性兔血清抗體IgG參照文獻(xiàn)[10]，標(biāo)準(zhǔn)κ-CN加等體積完全弗氏佐劑乳化，免疫新西蘭大白兔3只，每間隔12天加強(qiáng)免疫1次，加強(qiáng)免疫時(shí)，κ-CN與等體積不完全弗氏佐劑乳化，共加強(qiáng)3次，檢測血清效價(jià)，最終ELISA效價(jià)達(dá)到1:10 000，采血收集分離血清。采用硫酸銨分級沉淀及蛋白A親和色譜柱進(jìn)一步純化，獲得anti-κ-CN-IgG，冷凍干燥備用?？古＆?CN特異性卵黃抗體IgY制備，免疫方法與IgG制備方法類似，純化方法參照文獻(xiàn)[11]，采用水稀釋-凍融-微濾-超濾-硫酸銨鹽析-IgY親和色譜的方法進(jìn)行，獲得anti-κ-CN-IgY，冷凍干燥備用。

1.2.2 兩種anti--κ-CN抗體的交叉反應(yīng)性

通過間接ELISA法分別檢測兩種抗體與乳中常見成分的交叉反應(yīng)性，分別用κ-CN、β-酪蛋白、α-乳白蛋白（α-LA）和乳清粉作抗原包被酶標(biāo)板，加入待測IgG或IgY （或免疫吸收后抗體），HRP酶聯(lián)羊抗兔IgG或HRP酶聯(lián)兔抗雞IgG為二抗，設(shè)置陰性對照包括空白孔和陰性血清（卵黃）孔，間接ELISA法測定A450nm值，分析各蛋白與所制備的anti-κ-CN抗體交叉反應(yīng)性的強(qiáng)弱。

1.2.3 兩種anti--κ-CN抗體的免疫吸收

為提高檢測的特異性，抗體在用于定量檢測前進(jìn)行抗體免疫吸收，步驟如下：①用PBST將anti-κ-CN-IgG及anti-κ-CN-IgY稀釋至質(zhì)量濃度為1 g/L；②牛乳β-酪蛋白 （β-CN質(zhì)量濃度為1 g/L)、α-乳白蛋白（α-LA質(zhì)量濃度為1 g/L)及乳清粉(質(zhì)量濃度10 g/L)等體積混合后，再與步驟①所得液體等體積混合，37℃孵育2 h后，4℃過夜放置，得到修飾的抗體(blocked anti-β-CN-IgG)。由于ELISA檢測中有較多的的洗滌步驟，形成的免疫復(fù)合為不必去除，直接用于定量檢測中。比較吸收前后IgG與IgY抗體特異性。

1.2.4 牛乳κ-酪蛋白間接ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參見文獻(xiàn)[12]，分別用包被稀釋液（濃度為0.05 mol/L，pH值為9.6碳酸鹽緩沖液）將標(biāo)準(zhǔn)κ-CN梯度稀釋（質(zhì)量濃度50～1.5625 mg/L）包被酶標(biāo)板，采用棋盤滴定法，間接ELISA測試確定最佳檢測條件后，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測樣品時(shí)，用樣品稀釋替代標(biāo)準(zhǔn)κ-CN。

根據(jù)A450 nm值，以IgG和IgY為檢測抗體時(shí)，κ-CN最佳抗原包被質(zhì)量濃度分別為6.25 μg/mL和25 μg/mL。抗體起始質(zhì)量濃度為1g/L時(shí)，免疫吸收后的anti-κ-CN-IgG及anti-κ-CN-IgY工作質(zhì)量濃度均分別為1:20和1:10。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗κ-CN特異性抗體IgG和IgY純化與制備

2.1.1 兩種抗體純化結(jié)果的SDS-PAGE分析

經(jīng)不同方法分離，最后經(jīng)不同親和色譜柱純化后anti-κ-CN IgG及IgY用8%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE（不加β-巰基乙醇）電泳圖譜如圖1所示。圖1中,分別以標(biāo)準(zhǔn)兔IgG和雞IgG為對照品，采用凝膠成像儀分析可見經(jīng)親和色譜純化的IgG與IgY電泳純度可達(dá)90%。IgG （起始質(zhì)量濃度1 g/L）的ELISA效價(jià)在1:5120，IgY效價(jià)1:12800，可用于免疫檢測。

圖1 IgY與IgG分離純化效果電泳圖譜

2.1.2 兩種抗體的特異性與免疫吸收效果

抗體用于檢測不僅要求蛋白純度高，更重要的不與乳樣品中其他成分發(fā)生交叉反應(yīng)，即具有較高的特異性。檢測兩種抗體對κ-CN的特異性，并比較免疫吸收前后兩者特異性的變化。由圖2a和圖2b可知，antiκ-CN-IgG抗體在未封閉前雖與κ-CN結(jié)合性較強(qiáng)，遠(yuǎn)大于與β-CN、α-LA和乳清粉的結(jié)合能力，與乳清粉的交叉反應(yīng)性最強(qiáng)，可能因?yàn)棣?酪蛋白分子較小不易沉淀，在乳清粉中存在微量小分子片段的緣故。未免疫吸收前，兩種抗體與其他三種非特異性抗原反應(yīng)后的A450nm值較高，大于陰性對照吸收值的2.1倍，在檢測中易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。Anti-κ-CN-IgG抗體經(jīng)免疫吸收后,與乳清粉交叉反應(yīng)A450nm值從0.6左右降至0.3以下，而β-CN和α-LA的A450nm吸收值與陰性對照更為接近，大大提高了與κ-酪蛋白反應(yīng)的特異性。由圖2c和2d可知，anti-κ-CN-IgY抗體經(jīng)免疫吸收后，對κ-CN的特異性也大大增強(qiáng)，減低了非特異性反應(yīng)，可用于乳中κ-CN的檢測。

2.2 間接ELISA定量檢測牛乳κ-酪蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.1 κ-CN檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)κ-酪蛋白（質(zhì)量濃度25 mg/L）按2n稀釋包被酶標(biāo)板并封閉，分別采用免疫吸收后的IgG和IgY進(jìn)行間接ELISA檢測。結(jié)果如圖3所示。用anti-κ-CNIgG建立的間接ELISA法，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)κ-CN質(zhì)量濃度在0.098～3.125 mg/L時(shí)，A450 nm值與κ-CN的質(zhì)量濃度具有較好線性相關(guān)性，線性系數(shù)R2為0.9992；用antiκ-CN-IgY建立的間接ELISA法，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)κ-CN質(zhì)量濃度在0.098～6.25 mg/L時(shí)，A450 nm值與κ-CN的質(zhì)量濃度成良好的線性關(guān)系，線性系數(shù)R2為0.9987。

圖2 IgG和IgY抗體的交叉反應(yīng)及抗體封閉效果

2.2.2 κ-CN檢測方法的穩(wěn)定性

按間接ELISA操作程序重復(fù)檢測同濃度梯度κ-酪蛋白，用工作曲線計(jì)算κ-酪蛋白值，比較驗(yàn)檢結(jié)果的重復(fù)性，IgG及IgY所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線測量結(jié)果分別如表1和2所示。

圖3 κ-酪蛋白間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表1可以看出，應(yīng)用anti-κ-CN-IgG建立間接ELISA法板內(nèi)檢測的A450 nm值的變異系數(shù)小于1%，回收率在99.10%～101.1%之間；由表2可以看出，應(yīng)用anti-κ-CN-IgY建立間接ELISA法板內(nèi)檢測的A450 nm值的變異系數(shù)小于2%，回收率在98%～100.8%之間，說明兩種κ-CN抗體建立的間接法板內(nèi)檢測都有較好重復(fù)性，系統(tǒng)穩(wěn)定。免疫吸收后的anti-κ-CNIgY建立的間接ELISA法具有相似的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可替代IgG用于乳品中κ-CN蛋白的檢測。所建立的方法能夠用于κ-CN定量，為以κ-CN為目標(biāo)的蛋白質(zhì)檢測及乳品的的質(zhì)量檢測提供快捷手段。

2.2.3 牛乳樣品三聚氰胺摻假檢測

以三聚氰胺為模擬摻假物將本方法用于牛乳摻假檢驗(yàn)中。 三聚氰胺按梯度0，5%，8%，10%，15%，20%，30%，40%摻入原料乳中作為待測樣品，建立間接ELISA試驗(yàn)。應(yīng)用IgG間接ELISA法檢測時(shí)，當(dāng)三聚氰胺摻入量在0～20%的范圍時(shí)，線性回歸方程為：y=-0.0013x+0.7218，R2=0.9993；應(yīng)用IgY間接ELISA法檢測時(shí)，當(dāng)三聚氰胺摻入量在0～20%的范圍時(shí)，其呈線性回歸方程為：y=-0.0031x+0.698， R2=0.9946。

用兩種抗體建立的間接ELISA法檢測牛乳樣品結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，相對誤差分別在-0.9%～1.3%和-4.0%～2.7%范圍內(nèi)，變異系數(shù)均小于5%；建立的各ELISA體系測定牛乳蛋白含量的準(zhǔn)確性及精密性均符合要求，可實(shí)現(xiàn)對牛乳含量的定性定量檢測。IgG抗體與IgY抗體建立間接ELISA法相比，在用于牛乳樣品檢測中，相對誤差較小，變異系數(shù)及回收率指標(biāo)均表明該系統(tǒng)穩(wěn)定性更好。

3 結(jié) 論

通過免疫動(dòng)物所制備的anti-κ-CN-IgG和anti-κ-CN-IgY抗體對牛乳κ-CN有一定特異性，但兩者均與牛乳β-CN、α-LA和乳清粉有交叉反應(yīng)性，通過免疫吸收能成功封閉其中交叉反應(yīng)成分，提高反應(yīng)特異性，且免疫吸收后的抗體用于ELISA檢測無須去除產(chǎn)生的免疫復(fù)合物，操作簡便。利用吸收后抗體建立以κ-CN為目標(biāo)蛋白檢測牛乳蛋白的定量間接ELISA方法，IgG和IgY分別在κ-CN質(zhì)量濃度 0.098～3.125 mg/L和0.098～6.25 mg/L范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，建立的定量間接法板內(nèi)檢測樣品變異系數(shù)小，有較好重復(fù)性，系統(tǒng)穩(wěn)定。IgY可作為IgG的檢測替代抗體。所建立的定量間接ELISA方法可用于κ-CN快速檢測與乳品質(zhì)量及摻假檢測控制中。

表1 基于IgG的κ-CN間接ELISA檢測重復(fù)性

表2 基于IgY的κ-CN間接ELISA檢測重復(fù)性

表3 牛乳三聚氰胺摻假樣品蛋白含量檢測

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