丁 健，高敏杰，侯國力，梁克學(xué)，史仲平，*，于瑞嵩，李 震

(1．江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122;2．上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106)

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一類應(yīng)用廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，因其具有表達(dá)效率高、外源基因遺傳穩(wěn)定、易實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)、產(chǎn)物可分泌和蛋白翻譯后加工等眾多其它表達(dá)載體所無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，受到越來越多的重視和應(yīng)用［1-2］。重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)外源蛋白的發(fā)酵過程，主要包括前期的細(xì)胞培養(yǎng)以及后期的甲醇誘導(dǎo)兩個(gè)階段。在細(xì)胞培養(yǎng)階段，通常以甘油作為碳源，促使菌體大量增殖。經(jīng)過30～35h的培養(yǎng)，細(xì)胞可達(dá)到130～150g-DCW/L的較高濃度。在誘導(dǎo)階段，向發(fā)酵體系中添加誘導(dǎo)劑甲醇，誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)［3］。近年來，細(xì)胞培養(yǎng)階段的研究工作主要集中于通過優(yōu)化甘油流加工藝，提高細(xì)胞的比生長速率，為后期的誘導(dǎo)表達(dá)過程提供盡可能多的菌體［4］。然而，在相同的誘導(dǎo)條件下，影響目的蛋白表達(dá)水平的主要因素并非只有細(xì)胞濃度，細(xì)胞的生理活性與功能同樣重要。本研究室在前期工作中發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母發(fā)酵細(xì)胞培養(yǎng)階段末期甘油過量添加會導(dǎo)致乙醇大量積累，并且提出了改良型的DO-Stat甘油流加策略，有效抑制乙醇的積累，提高了豬α干擾素的表達(dá)水平［5］。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討了甘油流加末期長時(shí)間的高乙醇濃度環(huán)境以及短時(shí)間內(nèi)高乙醇濃度沖擊對目的蛋白表達(dá)水平以及碳源代謝途徑中關(guān)鍵酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇利用慢型菌株P(guān)ichia pastoris KM71H。由上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所構(gòu)建，載體為pPICZa。

平板培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，營養(yǎng)瓊脂2．5%;種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10;罐發(fā)酵初始培養(yǎng)基(g/L):甘油 20，MgSO41，K2SO41，(NH4)2SO45，CaSO40．1，H3PO42(%，v/v)，PTM110(mL/L)，pH6．0;甘油流加培養(yǎng)基(g/L):甘油 500，(NH4)2SO40．5，KH2PO40．5，MgSO40．03，PTM110(mL/L);甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基:甲醇500，(NH4)2SO40．5，KH2PO40．5，MgSO40．03，PTM110(mL/L);山梨醇(共混)流加培養(yǎng)基(g/L):山梨醇500。

BIOTECH-2002 5L發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司;pH和 DO電極 梅特勒公司;LKM2000A尾氣分析儀 韓國LOKAS公司;小型垂直電泳儀 美國Bio-Rad公司;G:Box生物成像系統(tǒng)和Gene Tools軟件 英國SynGene公司;FC-2002甲醇電極流加控制器 華東理工大學(xué)研制;GC112A氣相色譜儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與豬α干擾素的誘導(dǎo)表達(dá)

1．2．1 高密度細(xì)胞流加培養(yǎng)方法 細(xì)胞培養(yǎng)在5L發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行。初始裝液量1．5L，接種量20%，通氣速度4vvm，溫度30℃。使用25%的氨水將pH自動控制于6．0，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速將溶氧濃度(Dissolved oxygen，DO)維持在10%以上。甘油耗盡時(shí)DO迅速上升，啟動文獻(xiàn)中報(bào)道的改良型DO-Stat控制程序［5］、流加甘油培養(yǎng)基。空氣供氧無法控制DO時(shí)，使用純氧供氧。甘油流加末期(誘導(dǎo)前16h)，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求在不同的實(shí)驗(yàn)批次中，分別采用三種乙醇控制模式:批次1和批次2中使用改良型DO-Stat甘油流加控制程序［5］，乙醇濃度的控制水平設(shè)定為2g/L，始終將乙醇控制在較低濃度;批次3和批次4中，在誘導(dǎo)前8h人為添加乙醇，將發(fā)酵液中的乙醇濃度迅速提高至10g/L以上的較高濃度，之后繼續(xù)采用改良型DO-Stat控制過程控制甘油流加，將乙醇濃度維持在10g/L以上，持續(xù)4～5h;批次5中，在誘導(dǎo)前12h人為添加乙醇，將乙醇濃度迅速提高至12g/L以上，之后停止流加甘油，菌體開始利用乙醇。直至誘導(dǎo)前9．5h，乙醇自然耗盡，繼續(xù)采用改良型DO-Stat控制程序?qū)⒁掖紳舛瓤刂圃诘退?。?xì)胞濃度達(dá)到“高密度”要求(130～150g-DCW/L)后，停止甘油流加、進(jìn)行1～2h的“饑餓培養(yǎng)”，直到發(fā)酵液中的甘油和其它有可能充當(dāng)替代碳源的中間代謝物質(zhì)全部消耗殆盡后開始誘導(dǎo)。

1．2．2 豬α干擾素誘導(dǎo)表達(dá)方法 根據(jù)甲醇電極讀數(shù)手動調(diào)節(jié)甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基的流加速度，將甲醇濃度控制于約5g/L的水平。同時(shí)，按照1∶1的體積比加入山梨醇流加培養(yǎng)基。誘導(dǎo)期全程通空氣供氧、通氣速度 4vvm，pH5．5，溫度 30℃。

1.3 分析方法

1．3．1 菌濃測定 測量方法與參考文獻(xiàn)［6］相同。

1．3．2 乙醇和甲醇濃度的離線測定 測量方法與參考文獻(xiàn)［7］相同。

1．3．3 攝氧速率(Oxygen uptake rate，OUR)的測定 測量方法與參考文獻(xiàn)［8］相同。

1．3．4 總蛋白以及豬α干擾素濃度測定 發(fā)酵液中的總蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定［9］。使用軟件分析SDS-PAGE凝膠圖像，計(jì)算得到豬α干擾素濃度。

1．3．5 碳源(甘油、甲醇)代謝關(guān)鍵酶活性的測定 破壁方法:取1mL發(fā)酵液加水定容至10mL，10000r/min離心20min后收集菌體。加入10mL含有蝸牛酶的pH7．5的磷酸緩沖液將菌體懸浮，0℃超聲破碎90次(運(yùn)行5s間隔5s，功率400W)。最后，10000r/min離心20min，上清液即為無細(xì)胞酶液。甲醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶包括:醇氧化酶(AOX)、甲醛脫氫酶(FLD)、甲酸脫氫酶(FDH);甘油代謝途徑中的關(guān)鍵酶為甘油激酶(GK)。上述各酶比活性按照文獻(xiàn)中報(bào)道的方法測定［10-12］。

1．3．6 基因轉(zhuǎn)錄水平測定 本研究所用菌株中，AOX由aox2基因編碼。提取RNA，采用RT-PCR與實(shí)時(shí)定量PCR方法測定aox2基因轉(zhuǎn)錄水平。測定工作委托上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿?。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)末期高乙醇濃度對豬α干擾素表達(dá)水平的影響

批次1～批次4誘導(dǎo)前16h內(nèi)的乙醇控制水平如圖1A所示。批次1和批次2的乙醇濃度始終低于2g/L;批次3中，在誘導(dǎo)前7～3h，乙醇濃度始終維持在10g/L左右;批次4中，誘導(dǎo)前8～3h，乙醇濃度始終維持在12～15g/L之間。當(dāng)菌體濃度達(dá)到130～150g/L時(shí)，停止流加甘油。經(jīng)過短暫的饑餓培養(yǎng)，待發(fā)酵液中以及細(xì)胞內(nèi)部殘留的乙醇以及其它可以作為替代碳源的中間代謝產(chǎn)物完全耗盡后，流加甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基開始誘導(dǎo)豬α干擾素表達(dá)。

圖1 誘導(dǎo)前16h內(nèi)乙醇濃度Fig．1 Ethanol concentrations in 16 h before induction

在誘導(dǎo)的起始階段，菌體需要約5～8h的時(shí)間，用來合成甲醇代謝途徑中的各個(gè)關(guān)鍵酶，以適應(yīng)代謝甲醇的需求。在這一段適應(yīng)期內(nèi)，細(xì)胞活性很低，主要表現(xiàn)為OUR不斷降低或者始終維持在較低水平。如圖2所示，在批次1和批次2誘導(dǎo)起始的5～8h內(nèi)，OUR始終維持在較低水平，約40mmol/(L·h)。之后OUR開始穩(wěn)步上升，在誘導(dǎo)20h時(shí)達(dá)到約140mmol/(L·h)，一直維持至誘導(dǎo)結(jié)束(70h)，同時(shí)甲醇消耗速率分別達(dá)到 3．42g/(L·h)和 3．23g/(L·h)。在批次 3 起始誘導(dǎo)的前8h內(nèi) OUR略有提高，之后始終維持于80mmol/(L·h)的水平。直至誘導(dǎo)20h，OUR未見明顯提高，且甲醇消耗速度極低，僅為0．84g/(L·h)(圖3)，發(fā)酵被迫停止。在批次4起始誘導(dǎo)的前20h內(nèi)，OUR由起始的 80～90mmol/(L·h)穩(wěn)步下降至20mmol/(L·h)以下，同時(shí)甲醇消耗速度下降至0．28g/(L·h)(圖 3)，于20h 時(shí)結(jié)束發(fā)酵。

圖2 誘導(dǎo)期OUR變化Fig．2 OUR in the whole induction phase

圖3 誘導(dǎo)20h時(shí)甲醇消耗速率Fig．3 Methanol consumption rate at 20h of induction

圖4中比較了5個(gè)批次誘導(dǎo)階段發(fā)酵液中總蛋白濃度的變化情況:批次1和批次2的最高總蛋白濃度分別達(dá)到5．51g/L和4．71g/L;提前結(jié)束的批次3和批次4，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)的總蛋白濃度分別達(dá)到0．84g/L和 0．63g/L。選取各批次發(fā)酵結(jié)束時(shí)的樣品，使用SDS-PAGE測定其中的目標(biāo)蛋白濃度，結(jié)果如圖5所示。使用圖像分析軟件，分析得到批次1～批次 5 的豬 α 干擾素最終濃度分別為:3．65、3．08、0．75、0．20 和 0．42g/L。由此可見，生長末期的低乙醇濃度有利于誘導(dǎo)階段細(xì)胞生理活性的恢復(fù)以及目的蛋白的高效表達(dá)。相反地，生長末期的高乙醇濃度，會導(dǎo)致菌體在誘導(dǎo)階段無法恢復(fù)生理活性，最終導(dǎo)致發(fā)酵的失敗。雖然，經(jīng)過誘導(dǎo)前的饑餓培養(yǎng)后，乙醇已經(jīng)完全耗盡，但是高乙醇濃度對外源蛋白表達(dá)的抑制作用是不可逆的，不會隨著乙醇的耗盡而消除。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)末期高乙醇濃度對碳源代謝關(guān)鍵酶活性的影響

圖4 誘導(dǎo)期總蛋白變化Fig．4 Total protein concentration in induction phase

圖5 發(fā)酵最終樣品SDS-PAGE檢驗(yàn)結(jié)果Fig．5 Results of SDS-PAGE of final samples

由前期報(bào)導(dǎo)可知，重組畢赤酵母發(fā)酵過程中，乙醇積累主要出現(xiàn)在甘油流加末期［5］，而在此階段，細(xì)胞的比生長速率與碳源甘油的消耗密切相關(guān)。因此，乙醇積累是否會影響甘油的正常利用是關(guān)鍵問題。以批次2和批次4為例，比較了低乙醇濃度和高乙醇濃度環(huán)境下甘油代謝關(guān)鍵酶GK的比活性。比較結(jié)果如圖6A所示，批次2誘導(dǎo)前4h GK的比活性達(dá)到1．84U/g-DCW，而批次4誘導(dǎo)前4h GK的比活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于批次2，僅達(dá)到批次2的12．5%。由此可以推斷，甘油流加末期乙醇的大量積累，會大幅度降低菌體代謝甘油的速度。

從圖1A和圖3中可以看出，甘油流加末期的高乙醇濃度會降低誘導(dǎo)階段甲醇的消耗速率。即使乙醇在誘導(dǎo)前已經(jīng)被耗盡，它對誘導(dǎo)期的影響仍然無法消除，這可能是由于乙醇影響了功能性細(xì)胞骨架的生成、破壞了細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)而造成的。在圖6B～D中，以批次2和批次4為例，進(jìn)一步比較了整個(gè)誘導(dǎo)階段甲醇代謝途徑中關(guān)鍵酶AOX、FLD以及FDH的比活性。從圖中可知，批次2誘導(dǎo)階段AOX、FLD以及FDH三種酶的比活性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于批次4，達(dá)到批次4的數(shù)十倍。外源蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的過程中，甲醇既作為誘導(dǎo)劑，同時(shí)又為蛋白合成的過程提供碳源和能量。批次4中，甘油流加階段末期的高乙醇濃度大大降低了誘導(dǎo)階段甲醇代謝途徑中各個(gè)關(guān)鍵酶的比活性，使得細(xì)胞甲醇代謝途徑受阻，減少了對蛋白合成途徑碳源和能源的供應(yīng)。蛋白合成途徑無法正常運(yùn)轉(zhuǎn)，最終導(dǎo)致發(fā)酵過程提前結(jié)束，最終的目的蛋白產(chǎn)量僅達(dá)到批次2的6．5%。

圖6 甘油以及甲醇代謝關(guān)鍵酶比活性Fig．6 Specific activities of enzymes in glycerol and methanol metabolism

在甲醇代謝的關(guān)鍵酶中，AOX最為重要，它催化甲醇代謝途徑中的第一步反應(yīng)，直接影響菌體利用甲醇的能力。本研究中所用菌株為Muts型畢赤酵母，因此AOX由aox2基因編碼。批次1～4中，誘導(dǎo)20h時(shí)菌體aox2基因的轉(zhuǎn)錄水平如圖7所示。批次2最高，達(dá)到14．4，分別是批次3和批次 4的 17．1倍和25．7倍。由此可知，誘導(dǎo)階段末期的高乙醇濃度會抑制誘導(dǎo)期aox2基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低菌體內(nèi)部AOX比活性，影響甲醇的正常利用，最終降低目的蛋白的表達(dá)水平。

2.3 高乙醇濃度的短期沖擊對發(fā)酵性能及酶活的影響

圖7 aox2基因轉(zhuǎn)錄水平Fig．7 Transcriptional level of aox2 gene

如圖2所示，批次5誘導(dǎo)前20h內(nèi)，OUR由48mmol/(L·h)降低至 15mmol/(L·h)。并且，在誘導(dǎo)20h時(shí)，甲醇消耗速度僅有0．16g/(L·h)(圖 3)，甲醇消耗幾乎停止，發(fā)酵實(shí)驗(yàn)被迫終止。如圖4所示，誘導(dǎo)期內(nèi)發(fā)酵液中最高總蛋白濃度達(dá)到1．9g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于批次3和批次4，與批次1和批次2同一時(shí)刻的總蛋白濃度相近。但是，使用SDS-PAGE測定該樣品后發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中有大量雜蛋白存在，豬α干擾素濃度只達(dá)到0．42g/L(圖5)。從圖6A中可以看出，批次5誘導(dǎo)前4h GK比活性為1．01U/g-DCW，高于批次4，但是低于批次2。同樣地，批次5誘導(dǎo)期內(nèi)AOX、FLD以及FDH比活性也高于批次4和批次5，低于批次1和批次2(圖6B、6C、6D)。最后，從圖7中可以看出，誘導(dǎo)20h時(shí)批次5的aox2基因轉(zhuǎn)錄水平雖然高于批次4，但是仍然處于較低水平。由此可以得出結(jié)論，高乙醇濃度沖擊對發(fā)酵性能以及各關(guān)鍵酶比活性的破壞作用會隨著持續(xù)時(shí)間的延長而增加。但是，即使是極短時(shí)間的高乙醇濃度沖擊，仍然會導(dǎo)致發(fā)酵過程的失敗。因此，在重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)外源蛋白的過程中，必須避免細(xì)胞培養(yǎng)末期的乙醇積累。

3 結(jié)論

本論文研究了畢赤酵母發(fā)酵細(xì)胞培養(yǎng)末期乙醇積累對豬α干擾素表達(dá)性能以及碳源代謝關(guān)鍵酶比活性的影響。結(jié)果表明，低乙醇濃度對豬α干擾素的表達(dá)最有利，豬 α干擾素最高濃度可以達(dá)到3．65g/L。而10g/L以上的高乙醇濃度，不論持續(xù)時(shí)間長短，均會大幅度抑制甘油和甲醇代謝關(guān)鍵酶的活性，使得豬α干擾素濃度始終維持在0．20～0．75g/L的低水平。

［1］高力虎，楊樹林，儲衛(wèi)華，等．類人膠原蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及在畢赤酵母中的表達(dá)［J］．南京理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，32(2):252-256．

［2］梁達(dá)奉，黃曾慰，曾練強(qiáng)，等．α-葡聚糖酶在畢赤酵母中的組成型表達(dá)［J］．華南理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，40(5):96-100．

［3］Jin H，G Liu，X Ye，et al．Enhanced porcine interferon-alpha production by recombinant Pichia pastoris with a combinational control strategy of low induction temperature and high dissolved oxygen concentration［J］．Biochem Eng J，2010，52(1):91-98．

［4］Jin H，Z Y Zheng，M J Gao．Effective induction of phytase in Pichia pastorisfed-batch culture using an ANN pattern recognition model-based on-line adaptive control strategy［J］．Biochem Eng J，2007，37(1):26-33．

［5］Ding J，M Gao，G Hou，et al．Stabilizing porcine interferon-α production by Pichia pastoriswith an ethanolon-line measurement based DO-Stat glycerol feeding strategy［J］．J Chem Technol Biotechnol，2013，DOI 10．1002/jctb．4281．

［6］Yu R，S Dong，Y Zhu，et al．Effective and stable porcine interferon-alpha production by Pichia pastoris fed-batch cultivation with multi-variables clustering and analysis［J］．Bioprocess Biosyst Eng，2010，33(4):473-483．

［7］Gao M，Z Li，R Yu，et al．Methanol/sorbitol co-feeding induction enhanced porcine interferon-alpha production by P．pastoris associated with energy metabolism shift［J］．Bioprocess Biosyst Eng，2012，35(7):1125-1136．

［8］Shi H D，K Shimizu．On-line metabolic pathway analysis based on metabolic signal flow diagram［J］．Biotechnol Bioeng，1998，58(2-3):139-148．

［9］Sedmak J J，S E Grossberg．A rapid，sensitive，and versatile assay for protein using Coomassie brilliant blue G250［J］．Anal Biochem，1977，79(1-2):544-552．

［10］Suye S，A Ogawa，S Yokoyama．Screening and identification of Candida methanosorbosa asalcoholoxidase-producing methanol using yeast［J］．Agric Biol Chem，1990，54(5):1297-1298．

［11］Schute H，J Flossdorf，H Sahm，et al．Purification and properties of formaldehyde dehydrogenase and formate dehydrogenase from Candida boidinii［J］．Eur J Biochem，1976，62(1):151-160．

［12］辛渝．Debaryomyces sp．甘油激酶的分離純化及基本性質(zhì)研究［D］．成都:四川大學(xué)，2006．