付立偉+陳歡+楊進+侯宏衛(wèi)+胡清源

摘 要 基于酶聯(lián)免疫原理，建立了定量測定細胞中磷酸化組蛋白H2AX（γH2AX）含量的新方法，并用于評價卷煙煙氣的基因毒性。采用不同劑量的煙氣氣相物與煙氣粒相物暴露于中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞），通過測定不同染毒時間下細胞中γH2AX含量水平變化，考察煙氣染毒與細胞DNA損傷的劑量效應(yīng)關(guān)系， 以及不同煙氣組分基因毒性的差異。此外，通過定量監(jiān)測細胞中活性氧的變化，探討卷煙煙氣暴露誘發(fā)細胞DNA雙鏈斷裂損傷的作用機理。結(jié)果表明， 隨煙氣暴露時間的增加，細胞中γH2AX的含量在幾小時內(nèi)達到峰值，然后逐漸下降；染毒濃度越高，細胞中γH2AX含量達到峰值的時間越長；隨著煙氣粒相物或氣相物染毒濃度的增高，細胞中γH2AX含量水平呈上升趨勢；煙氣粒相物染毒相比煙氣氣相物對細胞中γH2AX含量的影響更為顯著；此外，煙氣成分直接染毒會引起細胞內(nèi)活性氧的含量增加。細胞內(nèi)活性氧的含量變化與細胞DNA雙鏈斷裂標志物γH2AX的含量變化有較強相關(guān)性，卷煙煙氣中自由基成分可能是誘發(fā)細胞DNA雙鏈斷裂的原因之一。

關(guān)鍵詞 磷酸化組蛋白H2AX；酶聯(lián)免疫方法；基因毒性

1 引 言

H2AX是組蛋白2A家族成員之一，在 DNA雙鏈斷裂（DNA double stranded breaks，DSBs）修復中起主要的信號傳輸作用。當細胞發(fā)生DSBs后，H2AX的絲氨酸殘基可以被毛細血管共濟失調(diào)突變基因（Ataxia telangiectasia mutated，ATM）和DNA依賴性蛋白激酶（DNA dependent protein kinase，DNA PK）等磷酸化，形成磷酸化組蛋白H2AX（γH2AX）[1～3]。γH2AX迅速在DSBs位點簇集，且γH2AX的形成與雙鏈斷裂的數(shù)量成正比[4]，從而使γH2AX成為DNA損傷/雙鏈斷裂的重要的特異性生物標志物。煙氣中某些組分（如自由基）能直接作用于細胞中DNA[5]，或通過活化多環(huán)芳烴（例如苯并芘）生成多環(huán)芳烴DNA加合物[6]，最終導致各種形式的DNA損傷。其中，DNA雙鏈的斷裂被認為是最嚴重的DNA損傷，DSBs修復失敗可觸發(fā)細胞凋亡，甚至破壞DNA信息，繼而導致突變、癌癥和遺傳損害。因此，基于γH2AX這一特異性生物標志物檢測卷煙煙氣暴露引起的細胞DNA損傷，尤其是DSBs，將有助于評價卷煙煙氣的基因毒性。Albino等[7]通過熒光顯微鏡觀測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過煙氣冷凝物暴露后細胞內(nèi)γH2AX的熒光焦點數(shù)量增多，且與暴露劑量呈正相關(guān)；此外，Toyooka和Ibuki[8]檢測出細胞中γH2AX含量與煙氣暴露呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。其采用的熒光顯微鏡方法可以獲得單個細胞中γH2AX的焦點數(shù)量，但使用人工計數(shù)，通量低，且無法避免檢測過程的主觀性。酶聯(lián)免疫方法（ELISA）具有操作簡單快速，通量高，靈敏度高的優(yōu)勢[9]。本研究基于ELISA原理，建立了一種定量測定細胞中γH2AX含量的新方法，并用于考察不同的煙氣組分染毒、染毒時間、不同染毒劑量條件下，細胞中γH2AX含量水平變化。同時檢測細胞中的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），分析DNA損傷與活性氧的關(guān)系，探討煙氣自由基成分對細胞DNA雙鏈斷裂的影響。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CO2培養(yǎng)箱（Thermo SERIES II WATER JACKET）；倒置顯微鏡IX7（Olympus IX73）；酶標儀（MD Spectra Max M5）；自動轉(zhuǎn)盤式吸煙機（Bolgwaldt RM200A）。

小鼠抗γH2AX單克隆抗體，兔抗總H2AX（不區(qū)分磷酸化）多克隆抗體（美國Biolegend公司）；過氧化辣根酶（Horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗鼠抗體，堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）標記驢抗兔抗體（中杉金橋公司）；磷酸4 甲基散酮（Phosphoric acid 4 methyl ketone，4 MUP，欣百諾生物公司），10 乙?；?3，7 二羥基吩嗪（10 Acetyl 3， 7 dihydroxy phenazine，ADHP，欣百諾生物公司）；DMEM細胞培養(yǎng)基，胎牛血清（美國Gibco公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）、胰蛋白酶、聚乙二醇單辛基苯基醚（Triton X 100）、4%多聚甲醛（Solarbio公司）；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，美國Amresco公司）；活性氧檢測試劑盒（碧云天公司）；中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）。

細胞膜通透液：0.5% Triton X 100的PBS緩沖液；封閉劑：2%牛血清白蛋白（Bovine serum adbumin， BSA）溶液；混合一抗溶液：使用前取適量兔抗H2AX抗體和小鼠抗γH2AX抗體混合，用2% BSA溶液稀釋至所需濃度；混合二抗溶液：使用前取適量HRP標記驢抗鼠抗體和AP標記羊抗兔抗體混合，用2% BSA溶液稀釋至所需濃度；HRP酶底物：用PBS緩沖溶液配制0.2 mmol/LADHP溶液，使用前與等體積的30% H2O2混勻；AP酶底物溶液：用PBS緩沖溶液配制0.3 mmol/L 4 MUP溶液。

2.2 實驗方法

2.2.1 卷煙煙氣染毒樣本的制備 實驗流程如圖1所示。卷煙樣品3R4F參比卷煙于溫度（22±1）℃和相對濕度60%±3%條件下平衡48 h。使用轉(zhuǎn)盤式吸煙機在ISO抽吸條件下抽吸卷煙，煙氣總粒相物（Cigarette smoke total particulate matter，TPM）用劍橋濾片收集，根據(jù)TPM質(zhì)量加入相應(yīng)體積的二甲亞砜， 得到最終濃度為10 g/L的TPM標準儲備液。使用前在

Symbolm@@ 80 ℃儲存。在收集煙氣總粒相物的同時將氣相物通入裝有PBS的吸收瓶（冰?。┲?，粒相物收集完畢后，將PBS吸收液定容至與粒相物儲備液中DMSO相同的體積，通過0.2 μm 濾膜除菌后，得到最終濃度為10 g/L TPM的煙氣氣相物（Cigarette smoke condensate，CSC）標準儲備液，且必須在制備后30 min內(nèi)使用。

2.2.2 細胞培養(yǎng)及處理 CHO細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。細胞匯合率70%～80%時，將細胞用0.25%胰蛋白酶消解，培養(yǎng)基重懸制成單細胞懸液后，調(diào)節(jié)細胞濃度至1×105個/mL，按每孔100 μL接種到96孔板，每組設(shè)6個復孔。傳代細胞至對數(shù)生長期時，棄去培養(yǎng)基，加入100 μL不同濃度梯度的煙氣粒相物萃取液或煙氣氣相物吸收液對細胞進行染毒，同時設(shè)立空白對照和陽性對照組。

2.2.3 細胞中γH2AX的測定 （1）細胞固定 染毒后的細胞用PBS洗滌兩次，每次5 min，除去染毒溶液。每孔加入100 μL 4%多聚甲醛，室溫固定15 min；（2）細胞通透 固定好的CHO細胞用PBS洗滌3次，每孔加入100 μL通透液室溫孵育15 min；（3）細胞封閉 PBS洗滌3次，加入封閉液37 ℃孵育1 h； 每孔加入100 μL含有兔抗H2AX抗體和小鼠抗γH2AX抗體組成的一抗混合液，4 ℃過夜；（4）恒溫孵育 PBS充分洗滌3次，加混合二抗溶液，在37 ℃恒溫培育2 h；（5）熒光檢測 PBS洗滌3次，向微孔板中加入75 μL的辣根酶底物，孵育30 min，再加入75 μL堿性磷酸酶底物，孵育30 min后經(jīng)熒光酶標儀（540 nm處激發(fā)， 600 nm處檢測； 360 nm處激發(fā)，450 nm處檢測）測定熒光強度值。本實驗在檢測目標物γH2AX的同時，對細胞中總H2AX（不區(qū)分磷酸化標記）也進行了定量測定。根據(jù)目標物γH2AX與總H2AX熒光檢測信號的比值確定H2AX的磷酸化程度。

2.2.4 細胞中活性氧的檢測 將1×105個/mL細胞以100 μL接種在96孔板，每組設(shè)3個復孔。傳代細胞至對數(shù)生長期時，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 10 μmol/L雙氫乙酰乙酸 二氯熒光黃（Dihydrochloride acetyl acid dichloride fluorescent yellow，DCFH DA），37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育完成后用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，充分除去未進入細胞內(nèi)的DCFH DA。每孔加入100 μL不同濃度梯度的煙氣粒相物萃取液，同時設(shè)立空白對照（只加正常培養(yǎng)基）和陽性對照組。染毒2 h后用酶標儀檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 酶聯(lián)免疫法檢測磷酸化蛋白H2AX的原理

本研究建立了細胞DNA損傷標志物磷酸化組蛋白H2AX（γH2AX）的酶聯(lián)免疫檢測方法，原理如圖2所示。即采用一種特異性γH2AX抗體及酶標二抗對目標蛋白γH2AX特異性夾心識別。加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化為有色產(chǎn)物，可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺實現(xiàn)對γH2AX定量測定的方法。檢測γH2AX的同時，加入特異性H2AX抗體及相應(yīng)酶標二抗對總H2AX特異性識別。檢測的總H2AX蛋白包含磷酸化和非磷酸化H2AX蛋白，目的是消除由細胞個數(shù)差異引起的信號偏差。計算出γH2AX熒光強度比值（γH2AX熒光強度比值=γH2AX熒光值/（H2AX熒光值-空白值注）， 空白值為不加一抗只加二抗條件下γH2AX與H2AX的熒光比值），減小平行樣本熒光檢測信號的偏差，從而實現(xiàn)目標物γH2AX的準確定量。

3.2 抗體濃度的優(yōu)化

酶聯(lián)免疫法對細胞中γH2AX測定的靈敏度取決于特異性識別的一抗與目標物分子的結(jié)合量，其間接影響酶標記的二抗分子對目標分子的特異性識別。為提高檢測靈敏度，分別對實驗中小鼠抗γH2AX抗體及其對應(yīng)的二抗?jié)舛冗M行了優(yōu)化。由圖3A可知， 當小鼠抗γH2AX抗體稀釋濃度范圍在0.6～1.0 mg/L時，發(fā)射波長450 nm處測定的熒光強度最大。因此本實驗中選擇小鼠抗γH2AX抗體的最佳濃度為0.8 mg/L。圖3B所示為使用相同濃度的小鼠抗γH2AX抗體和不同濃度的HRP酶標記的驢抗鼠抗體對相同目標物分析時，在熒光酶標儀上測定的熒光強度值。由圖3B可知，當HRP酶標記的驢抗鼠抗體稀釋濃度為4～6 mg/L時，發(fā)射波長450 nm處測定的熒光強度最大。因此選用的HRP酶標記的驢抗鼠抗體稀釋濃度為5 mg/L。

3.3 不同暴露時間對細胞中γH2AX含量的影響

為研究不同暴露時間對細胞內(nèi)γH2AX含量的影響，采用煙氣粒相物分別暴露于CHO細胞。暴露劑量為25，50，100和150 mg/L，每個劑量暴露時間設(shè)為0，0.5，1，2，4，8，12和24 h。從圖4可見，染毒濃度為25和50 mg/L 的細胞，約暴露2 h，γH2AX含量達到峰值，染毒濃度為100和150 mg/L的細胞分別在4和8 h左右細胞中γH2AX含量達到峰值。γH2AX含量達到最大值后隨時間增加整體呈下降趨勢?？傮w上，24 h后高劑量粒相物暴露的細胞內(nèi)γH2AX的含量仍然高于低劑量暴露水平的細胞。有研究發(fā)現(xiàn)， 煙霧提取物暴露細胞可引起細胞DNA雙鏈斷裂，γH2AX峰值出現(xiàn)在暴露4 h左右，然后逐漸降低[10]。細胞自身存在DNA損傷修復功能，隨著DNA雙鏈斷裂的重新連接修復，γH2AX會發(fā)生去磷酸化。γH2AX可能通過組蛋白交換的方式，從染色體上解離[11]，或者在去磷酸化酶的作用下恢復為H2AX[12]。細胞中存在DNA損傷修復機制，但修復程度與煙氣粒相物暴露濃度有關(guān)，不同濃度粒相物暴露可能觸發(fā)的修復機制不同。

3.4 不同濃度煙氣染毒對細胞中γH2AX含量的影響

為考察煙氣不同組分和濃度暴露對細胞中γH2AX含量的影響，實驗采用煙氣氣相物及粒相物分別暴露于CHO細胞。暴露濃度梯度為10，25，50，75，100，150和200 mg/L，暴露時間根據(jù)前期實驗設(shè)為4 h。同時設(shè)空白對照組（未染毒和不加一抗抗體）。由圖5可知，

結(jié)果表明，煙氣暴露尤其是煙氣粒相物暴露能引起CHO細胞內(nèi)H2AX的磷酸化，且磷酸化程度與暴露劑量呈正相關(guān)。有研究證實，γH2AX的形成與DNA雙鏈斷裂數(shù)量存在一一對應(yīng)關(guān)系[4]，是DNA損傷的重要生物標志物。因此，煙氣暴露能造成細胞的DNA雙鍵斷裂，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。同時實驗發(fā)現(xiàn)煙氣粒相物暴露對細胞中γH2AX含量的影響明顯大于煙氣氣相物。煙氣氣相物中具有直接基因毒性的物質(zhì)，需要進一步體外活化才能造成DSBs，而具有間接基因毒性的物質(zhì)只能對細胞分裂期造成干擾形成DSBs[13]。因此直接將煙氣氣相物暴露于CHO細胞可能對細胞中γH2AX含量的影響較小。但煙氣粒相物和氣相物都是復雜的混合物，有超過150種有毒物質(zhì)[14]。目前仍無法確定煙氣中對形成γH2AX起關(guān)鍵作用的毒性物質(zhì)。

3.5 活性氧檢測

每支卷煙所產(chǎn)生的煙霧中約含有1015個自由基。其中氣相中包括烷氧基（RO·）、烷過氧基（ROO·）及烷基（R·）等不穩(wěn)定自由基，焦油相中則含有高濃度的穩(wěn)定自由基（如半醌自由基和芳香烴自由基等）[5]。卷煙煙氣中的自由基，可誘導細胞產(chǎn)生活性氧直接攻擊DNA造成DSBs，或與DNA上的堿基形成加合物，使堿基脫失形成無嘌呤嘧啶（Apurinic/apyrimidinic，AP）位點，從而發(fā)生DSBs[15]。為探討煙氣染毒誘發(fā)細胞DNA雙鏈斷裂的作用機理，本實驗采用煙氣粒相物和氣相物分別暴露于CHO細胞。染毒劑量為0， 10， 25， 50， 75， 100和150 mg/L，暴露時間為0.5， 1， 2， 3和4 h。利用熒光探針雙氫乙酰乙酸 二氯熒光黃（Dihydrochloride acetyl acid dichloride fluorescent yellow，DCFH DA）檢測活性氧，

這種熒光探針可以自由進入細胞，被細胞內(nèi)的酯酶水解生成2，7 二氫二氯熒光素（2，7 Dihydro dichloride fluorescein，DCFH），而DCFH不能通透細胞膜，細胞內(nèi)的活性氧可以將其氧化生成有熒光物質(zhì)進行檢測。結(jié)果如圖6所示，煙氣粒相物暴露的細胞中活性氧含量均有所上升，且隨暴露濃度增加，活性氧含量逐漸升高。而氣相物暴露后的細胞內(nèi)活性氧含量隨暴露濃度增加也呈上升趨勢，但變化并不明顯。對比圖5和圖6可見，相同暴露條件下CHO細胞中ROS的變化趨勢與γH2AX的變化趨勢相一致。研究表明，煙氣粒相物可誘導CHO細胞產(chǎn)生ROS，且隨著煙氣粒相物劑量的加大，[TS（4][HT5”SS] 圖6 細胞中活性氧檢測熒光強度與染毒濃度的劑量效應(yīng)曲線

Fig.6 Dose effect curve of exposure concentrations of CSC and TPM and reactive oxygen species（ROS） in cellsROS的濃度也逐漸升高。煙氣粒相物暴露后細胞內(nèi)ROS和γH2AX含量的變化具有很好的相關(guān)性。煙氣粒相物中半醌自由基可與DNA堿基特別是鳥嘌呤形成DNA加合物[6]；煙氣粒相物中芳香烴自由基參與多環(huán)芳烴的氧化，生成的親電衍生物可攻擊DNA，或生成DNA加合物[16]。DNA氧化損傷和DNA加合物是卷煙煙氣導致細胞產(chǎn)生DSBs的主要作用機制[17]。因此，煙氣粒相物中穩(wěn)定的自由基可能是DBS的形成原因之一。

4 結(jié) 論

基于ELISA原理，建立了一種定量測定細胞中γH2AX的方法，并應(yīng)用于煙氣不同組分基因毒性的評價。通過同時測定細胞中H2AX含量，有效地消除細胞個數(shù)差異造成的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，煙氣粒相物和氣相物暴露CHO細胞，均會造成細胞中γH2AX含量的升高，且存在時間劑量效應(yīng)關(guān)系，但粒相物相比氣相物對CHO細胞γH2AX含量的影響更為顯著。煙氣成分暴露可導致細胞中ROS含量升高。細胞中ROS的變化趨勢與γH2AX的變化趨勢相一致，煙氣粒相物中穩(wěn)定的自由基可能是DBS的形成原因之一。

References

1 Emmy P， Rogakou D R P， Ann H O， Vessela S I， William M.J. Biol. Chem.，1998， 273（10）： 5858-5868

2 Guler G， Himmetoglu C， Jimenez R E， Geyer S M.； Wang W P， Costinean S， Pilarski R T， Morrison C， Suren D， Liu J.Breast Cancer Res. Tr.， 2011， 129（2）： 421-432

3 Mah L J， El Osta A， Karagiannis T C.Leukemia， 2010， 24： 679-686

4 Sedelnikova O A， Rogakou E P， Panyutin I G， Bonner W M.J. Radiat. Res.， 2002， 158（4）： 486-492

5 Valavanidis A， Vlachogianni T， Fiotakis K.Int. J. Environ. Res. Public Health， 2009， 6（2）： 445-462

6 Nagata C， Kodama M， Ioki Y.Polycyclic Hydrocarbons and Cancer， 1978， 1： 247-260

7 Albino A， Huang X， Jorgensen E， Yang J， Gietl D， Traganos F， Darzynkiewicz Z.Cell Cycle， 2004， 3（8）： 1060-1066

8 Toyooka T， Ibuki Y.Mutat. Res gen. Tox. En.， 2009， 676（1）： 34-40

9 WANG Min， ZHANG Liang， ZHANG Wei， CAO Zhen， TAN Gui Yu， NAN Tie Gui， WANG Bao Min.Chinese J. Anal. Chem.，2013， 41（10）： 1555-1560

王 敏， 張 亮， 張 威， 曹 振， 譚桂玉， 南鐵貴， 王保民. 分析化學， 2013， 41（10）： 1555-1560

10 FU Qiang，CHENG Jing，HAN Zhong Bo，LI Xiao Lan.Chin. J. Cancer，2006， 25（10）： 1191-1197

付 強， 成 靜， 韓中博， 李小蘭. 癌癥， 2006， 25（10）： 1191-1197

11 Benson L J， Gu Y， Yakovleva T， Warner C， Okayasu R， Bedford J S.J. Biol. Chem.， 2006， 281（14）： 9287-9296

12 Gavrilov B， Vezhenkova I， Firsanov D， Solovjeva L， Svetlova M， Mikhailov V， Tomilin N.Biochem. Biophys. Res. Commun.， 2006， 347（4）： 1048-1052

13 Kato T， Nagasawa H， Warner C， Okayasu R， Bedford J S.Int. J. Radiat. Biol.， 2007， 83（9）： 583-591

14 Cunningham F， Fiebelkorn S， Johnson M， Meredith C A.Food. Chem. Toxicol.， 2011， 49（11）： 2921-2933

15 Liu X， Conner H， Kobayashi T， Kim H， Wen F， Abe S， Fang Q， Wang X， Hashimoto M， Bitterman P.Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.， 2005， 33（2）： 121-129

16 Pryor WA. Environ.Health Perspect.， 1997， 105（Suppl. 4）： 875

17 Garcia Canton C， Anadón A， Meredith C.Toxicol. In Vitro， 2012， 26（7）： 1075-1086

7 Albino A， Huang X， Jorgensen E， Yang J， Gietl D， Traganos F， Darzynkiewicz Z.Cell Cycle， 2004， 3（8）： 1060-1066

8 Toyooka T， Ibuki Y.Mutat. Res gen. Tox. En.， 2009， 676（1）： 34-40

9 WANG Min， ZHANG Liang， ZHANG Wei， CAO Zhen， TAN Gui Yu， NAN Tie Gui， WANG Bao Min.Chinese J. Anal. Chem.，2013， 41（10）： 1555-1560

王 敏， 張 亮， 張 威， 曹 振， 譚桂玉， 南鐵貴， 王保民. 分析化學， 2013， 41（10）： 1555-1560

10 FU Qiang，CHENG Jing，HAN Zhong Bo，LI Xiao Lan.Chin. J. Cancer，2006， 25（10）： 1191-1197

付 強， 成 靜， 韓中博， 李小蘭. 癌癥， 2006， 25（10）： 1191-1197

11 Benson L J， Gu Y， Yakovleva T， Warner C， Okayasu R， Bedford J S.J. Biol. Chem.， 2006， 281（14）： 9287-9296

12 Gavrilov B， Vezhenkova I， Firsanov D， Solovjeva L， Svetlova M， Mikhailov V， Tomilin N.Biochem. Biophys. Res. Commun.， 2006， 347（4）： 1048-1052

13 Kato T， Nagasawa H， Warner C， Okayasu R， Bedford J S.Int. J. Radiat. Biol.， 2007， 83（9）： 583-591

14 Cunningham F， Fiebelkorn S， Johnson M， Meredith C A.Food. Chem. Toxicol.， 2011， 49（11）： 2921-2933

15 Liu X， Conner H， Kobayashi T， Kim H， Wen F， Abe S， Fang Q， Wang X， Hashimoto M， Bitterman P.Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.， 2005， 33（2）： 121-129

16 Pryor WA. Environ.Health Perspect.， 1997， 105（Suppl. 4）： 875

17 Garcia Canton C， Anadón A， Meredith C.Toxicol. In Vitro， 2012， 26（7）： 1075-1086

7 Albino A， Huang X， Jorgensen E， Yang J， Gietl D， Traganos F， Darzynkiewicz Z.Cell Cycle， 2004， 3（8）： 1060-1066

8 Toyooka T， Ibuki Y.Mutat. Res gen. Tox. En.， 2009， 676（1）： 34-40

9 WANG Min， ZHANG Liang， ZHANG Wei， CAO Zhen， TAN Gui Yu， NAN Tie Gui， WANG Bao Min.Chinese J. Anal. Chem.，2013， 41（10）： 1555-1560

王 敏， 張 亮， 張 威， 曹 振， 譚桂玉， 南鐵貴， 王保民. 分析化學， 2013， 41（10）： 1555-1560

10 FU Qiang，CHENG Jing，HAN Zhong Bo，LI Xiao Lan.Chin. J. Cancer，2006， 25（10）： 1191-1197

付 強， 成 靜， 韓中博， 李小蘭. 癌癥， 2006， 25（10）： 1191-1197

11 Benson L J， Gu Y， Yakovleva T， Warner C， Okayasu R， Bedford J S.J. Biol. Chem.， 2006， 281（14）： 9287-9296

12 Gavrilov B， Vezhenkova I， Firsanov D， Solovjeva L， Svetlova M， Mikhailov V， Tomilin N.Biochem. Biophys. Res. Commun.， 2006， 347（4）： 1048-1052

13 Kato T， Nagasawa H， Warner C， Okayasu R， Bedford J S.Int. J. Radiat. Biol.， 2007， 83（9）： 583-591

14 Cunningham F， Fiebelkorn S， Johnson M， Meredith C A.Food. Chem. Toxicol.， 2011， 49（11）： 2921-2933

15 Liu X， Conner H， Kobayashi T， Kim H， Wen F， Abe S， Fang Q， Wang X， Hashimoto M， Bitterman P.Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.， 2005， 33（2）： 121-129

16 Pryor WA. Environ.Health Perspect.， 1997， 105（Suppl. 4）： 875

17 Garcia Canton C， Anadón A， Meredith C.Toxicol. In Vitro， 2012， 26（7）： 1075-1086