吳 勇，葉 芬，葛軼睿，陸 燕，魏銳利

缺血再灌注損傷的概念是指機(jī)體組織缺血一段時間，當(dāng)血流再次恢復(fù)流通后，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，代謝功能發(fā)生障礙，甚至比剛?cè)毖獣r更加嚴(yán)重，進(jìn)而導(dǎo)致器官功能進(jìn)一步損害的綜合征［1］。眼部很多疾病都存在這種病理生理現(xiàn)象，如急性閉角型青光眼、視網(wǎng)膜中央動脈阻塞、糖尿病性視網(wǎng)膜病等血管的阻塞都可以引起缺血再灌注損傷性眼?。?］。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)主要是由活化的單核-巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，并且在組織和細(xì)胞炎癥損傷中起著相當(dāng)重要的作用，常常被作為組織和細(xì)胞炎癥損傷及其嚴(yán)重程度的重要觀察指標(biāo)［3］。研究表明核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)是一種具有多種功能的核轉(zhuǎn)錄因子，被激活后可促進(jìn)許多種炎癥細(xì)胞因子及免疫基因的轉(zhuǎn)錄;而SN50則是一種NF-κB的活性抑制肽，具有很強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透能力［4］，可以高效地、特異性地抑制 NF-κB 所誘導(dǎo)的下游基因表達(dá)。本研究建立缺血再灌注損傷的細(xì)胞模型，再將細(xì)胞模型在氧糖剝奪條件下進(jìn)行培養(yǎng)，通過體外實驗來觀察和了解SN50對缺血再灌注損傷中TNF-α表達(dá)的影響，為眼部缺血性疾病的臨床治療提供理論探索。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 SN50(Biomy公司 美國)，TNF-α ELISA Kit(美國Invitrogen公司)，RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，MTT(美國Invitrogen公司)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶與細(xì)胞培養(yǎng)皿(美國Corning公司)，RORMA 3131三氣培養(yǎng)箱(美國 Thermo Scientific公司)，HERAEUS PICO 17離心機(jī)(美國 Thermo Scientific公司)，F(xiàn)ORMA 700超低溫冰箱(美國Thermo Scientific公司)，ECLIPSE Ti倒置顯微鏡(日本 Nikon公司)，MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.2 動物的分組 取健康的成年SD大鼠30只，7～8周鼠齡，體重180～200g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供，實驗動物使用許可證號:SYXK(軍)2007-029。隨機(jī)分為氧糖剝奪組、正常對照組及氧糖剝奪+SN50處理組，每組10只。

1.3 巨噬細(xì)胞的分組造模 各組大鼠先予巨噬細(xì)胞行原代培養(yǎng)，即以20 mg/mL戊巴比妥鈉注射液按35 mg/kg劑量鼠腹腔注射麻醉。經(jīng)腹主動脈放血，以大鼠眼球蒼白為放血充分后，游離大鼠氣管，固定PE軟管，注射器抽吸后灌洗生理鹽水，每次灌注生理鹽水10 mL，充分灌洗大鼠的肺泡巨噬細(xì)胞。離心收獲的生理鹽水，800 r/min(離心半徑8 cm)離心5 min，去除上清液，以細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，并予肺泡巨噬細(xì)胞計數(shù)備用。用上述方法獲取SD大鼠的肺泡巨噬細(xì)胞，將含有巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液以800 r/min(離心半徑8 cm)離心5 min，去除上清液，生理鹽水洗滌2次。生理鹽水重懸巨噬細(xì)胞，將巨噬細(xì)胞放入培養(yǎng)皿內(nèi)。

氧糖剝奪組:把含有巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)皿放在37℃、5%CO2+3%O2+92%N2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)。

正常對照組:把含有巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)皿放入5%CO2，37℃，飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。

氧糖剝奪+SN50處理組:將巨噬細(xì)胞放入培養(yǎng)皿后，加入 SN50，SN50的工作濃度為30 μM，再放入37℃、5%CO2+3%O2+92%N2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)。

三組均在培養(yǎng) 0 h、0.5 h、2 h、12 h 后，800 r/min(離心半徑8 cm)離心5 min，收集細(xì)胞培養(yǎng)液及巨噬細(xì)胞進(jìn)行各項測定比較。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞的存活率 用5 mL MTT溶劑溶解25 mg MTT，配制成5 mg/mL的MTT溶液，分裝后放置于－20℃避光保存。于96孔反應(yīng)板上每孔加入100 μL約104個細(xì)胞、MTT溶液100 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h后去除上清液。在酶標(biāo)儀上選擇490 nm檢測波長，并用680 nm為參考波長，測定各孔的吸光值(OD)。按以下公式計算細(xì)胞存活率:

1.5 TNF-α的檢測 用ELISA法檢測正常對照組、氧糖剝奪組、氧糖剝奪+SN50處理組的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的表達(dá)情況，按說明書操作并計算濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 檢測數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，成組設(shè)計多個樣本均數(shù)比較采用One-way ANOVA方差分析，兩樣本間均數(shù)比較用t檢驗;定性資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗;P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。圖表制作使用OriginPro 7.0 軟件。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測的細(xì)胞存活率 在氧糖剝奪條件下培養(yǎng)，經(jīng)過SN50處理與未經(jīng)SN50處理的相比較，2 h及12 h的細(xì)胞存活率明顯上升，經(jīng)過SN50處理的細(xì)胞存活率分別為(90±7)%和(84±7)%，未經(jīng)SN50處理的細(xì)胞存活率分別為(73±4)%和(51±3)%，兩組同時點比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為 P ＜0.05，P ＜0.01)。

2.2 SN50處理后的TNF-α表達(dá) 本文觀察到在氧糖剝奪條件下培養(yǎng)，0.5 h、2 h后TNF-α表達(dá)逐漸升高;在培養(yǎng)12 h后，TNF-α表達(dá)有明顯的增高。同樣在氧糖剝奪條件下，經(jīng)過SN50處理后，TNF-α的表達(dá)上調(diào)幅度明顯變小，其中2 h與未經(jīng)SN50處理的相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖1)，到12 h這種差異更加明顯(P＜0.01)。

圖1 三組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的表達(dá)情況

3 討論

在缺血再灌注損傷過程中，各種細(xì)胞因子或炎性因子都會參與其中，有研究表明，在腦部的缺血再灌注損傷后，腦內(nèi)的TNF-α在組織缺血再灌注后的表達(dá)會明顯增加［5］;TNF-α可激活組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生各種炎性代謝物，持續(xù)炎性反應(yīng)［6］。TNF-α同時還可促進(jìn)白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)及粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子，產(chǎn)生相互協(xié)同的炎性作用 ;TNF-α對毛細(xì)血管有非常直接的作用，不僅可導(dǎo)致微小動脈痙攣，而且還能增加毛細(xì)血管的通透性，加重外周白細(xì)胞的浸潤，同時TNF-α還可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷［8］。

在正常情況下，NF-κB是以無活性的狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受細(xì)胞外信號(如細(xì)胞因子、病毒、紫外線、氧自由基等)刺激后，IκB激酶復(fù)合體(iκB kinase，IKK)活化后將 IκB 磷酸化，使 NF-κB暴露了核定位序列，此時蛋白酶迅速降解磷酸化的IκB，而游離的NF-κB會快速移位至細(xì)胞核內(nèi)，與特異性κB的序列結(jié)合，誘導(dǎo)相關(guān)的基因產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄［9］;已有許多研究報道，NF-κB與缺血再灌注損傷有相當(dāng)密切的關(guān)系，其可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子或炎性因子的表達(dá)增加［10-12］。NF-κB 還能調(diào)控其他與血管發(fā)生有關(guān)的基因，包括編碼TNF-α、血管細(xì)胞黏附分子－1(VCAM-1)以及胞間黏附分子-1(ICAM-1)的基因［12］等。也就是說這些因子由NF-κB調(diào)控，同時又可激活NF-κB而形成正反饋，使得缺血再灌注的損傷加劇，NF-κB與TNF-α兩者之間存在有相互協(xié)調(diào)或是相互促進(jìn)的作用。TNF-α由于在組織和細(xì)胞炎癥損傷中起著相當(dāng)重要的作用，所以常常被作為組織和細(xì)胞炎癥損傷及其嚴(yán)重程度的重要觀察指標(biāo)［13］。本實驗中，在氧糖剝奪條件下，經(jīng)過了SN50處理后，巨噬細(xì)胞TNF-α的表達(dá)上調(diào)幅度明顯變小，與未經(jīng)SN50處理的相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而且SN50處理后的細(xì)胞存活率與未處理的相比差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。SN50作為一種可以穿過細(xì)胞膜的NF-κB抑制性蛋白肽類，特異性好，無明顯的毒副作用，可以阻斷NF-κB所介導(dǎo)的細(xì)胞信號的傳導(dǎo)通路。根據(jù)SN50對TNF-α mRNA和蛋白水平的作用效果具有的一致性［14］，本文認(rèn)為SN50主要是通過抑制NF-κB核的移位干擾了TNF-α的基因轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致其分泌的蛋白量降低。

眼部的缺血再灌注損傷性疾病非常多見，目前針對其發(fā)病機(jī)制的實驗研究很多，形成各種各樣的學(xué)說，有氧自由基學(xué)說、一氧化氮學(xué)說、鈣通道學(xué)說、炎癥反應(yīng)學(xué)說、興奮性氨基酸學(xué)說等等，但是還沒有明確真正的發(fā)病機(jī)制。本研究從分子生物學(xué)的角度探討發(fā)病機(jī)制及治療對策，通過建立模擬缺血再灌注損傷的體外模型，雖然可在細(xì)胞水平研究取得一些比較理想的結(jié)果，然而由于實驗本身具非整體性，細(xì)胞在體外培養(yǎng)時具有形態(tài)、理化因素的差異，體外的實驗結(jié)果還需結(jié)合動物實驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行整體分析研究。

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