徐 瑤，鄭 直

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 北京 100005)

研究論文

基于金屬增強(qiáng)熒光的高通量堿基突變的篩查

徐 瑤，鄭 直*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 北京 100005)

目的開發(fā)簡單特異的金屬增強(qiáng)熒光方法以區(qū)分含突變位點(diǎn)和完全互補(bǔ)配對的核酸序列。方法靶標(biāo)能通過toehold調(diào)節(jié)的鏈置換反應(yīng)將固定在96孔板表面的發(fā)卡結(jié)構(gòu)核酸打開，再加入5′端修飾了羧基熒光素的信號探針，該探針能與另一段打開的捕捉探針雜交，通過檢測熒光信號實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)的分析。結(jié)果相對于一般方法，金屬增強(qiáng)熒光(MEF)能明顯區(qū)分互補(bǔ)配對靶標(biāo)和含突變靶標(biāo)，并具有顯著的信號放大作用(對于100 nmol/L的靶標(biāo)，信號放大～13倍)，能檢測出0.1 nmol/L級別的靶標(biāo)(普通方法5 nmol/L)。結(jié)論為核酸突變檢測提供了一種簡便高通量的初篩手段。

鏈置換反應(yīng)；金屬增強(qiáng)熒光；堿基突變篩查

在高通量藥物診斷、顯微鏡和其他生物技術(shù)中，熒光是一種非常常見的檢測工具。但是由于熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命的限制，導(dǎo)致熒光檢測的靈敏度不高，因而限制了熒光檢測的使用范圍。金屬增強(qiáng)熒光能增強(qiáng)熒光量子產(chǎn)率，同時減低熒光壽命，從而大大增加熒光檢測的靈敏度[1- 2]。到目前為止，銀表面作為基底已被用于很多實(shí)際檢測中，例如蛋白質(zhì)、DNA以及其他小分子[3]。

Toehold調(diào)節(jié)的鏈置換反應(yīng)在DNA馬達(dá)和其他基于DNA的納米裝置中均得到廣泛運(yùn)用[4- 5]， 其中DNA單鏈b與a不完全互補(bǔ)(a與b雜交后伸出一段黏性末端稱為toehold)，a*能通過與toehold結(jié)合從而發(fā)生鏈置換反應(yīng)將b完全置換下來。由于toehold調(diào)節(jié)的鏈置換反應(yīng)嚴(yán)格受核酸序列控制，因此，鏈置換反應(yīng)也為核酸中的堿基突變檢測提供了另一種可能，具有很高的特異性[6- 7]。

本實(shí)驗擬將金屬增強(qiáng)熒光運(yùn)用于toehold調(diào)節(jié)的核酸序列檢測中,以建立在室溫進(jìn)行的具有簡單快捷、高靈敏度和高通量等優(yōu)點(diǎn)，并能對大規(guī)模樣品進(jìn)行初篩的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

核酸探針(Invitrogen公司)。探針序列如表1所示。硝酸銀、Poly-(Phe, Lys)、BS3、96孔板、 Poly-D-Lysine 修飾的96孔板和二硫蘇糖醇(DTT)(Sigma-Aldrich公司)。氫氧化銨(北京華騰化工有限公司)。葡萄糖、丁二酸酐、N-甲基吡咯烷酮、Hepes和Tris(上海生物工程有限公司)。Nanodrop 2000 Spectrophotometer (Thermo公司)。Synegy H4(BioTek公司)。

1.2 方法

1.2.1 96孔板表面鍍銀：在100 mL燒杯中加入硝酸銀溶液(0.34 g溶于40 mL水中)，不停攪拌，逐滴加入約6滴新制NaOH溶液(5% w/v)，再緩慢加入氫氧化銨溶液直至深棕色沉淀完全溶解。上述溶液放置在4 ℃冰箱中冷卻，隨后加入新制的葡萄糖溶液(0.48 g溶于10 mL水中)，混合均勻。用排槍將上述溶液加入96孔板中，每孔0.25 mL，直至溶液由無色變?yōu)辄S棕色，可以觀察到96孔板底部鍍上了一層黃色的銀[8]。棄去液體，并且用水洗3遍。

1.2.2 封閉鍍銀板表面的氨基反應(yīng)位點(diǎn)：將0.8 g丁二酸酐溶解于25 mL硼酸緩沖液(0.1 mol/L硼酸，300 mmol/L NaCl，pH=8.0)中，再與等體積的N-甲基吡咯烷酮混合，迅速加入96孔板中，每孔0.25 mL，室溫反應(yīng)15 min后棄去，用水洗3遍。

1.2.3 在96孔板中固定巰基修飾的捕獲探針：活化探針：把DTT加入探針中，將thiol-S-S還原為SH，再往上述溶液中加入100%冰乙醇至2 mL，在冰箱中冷凍10 min后取出，1 400×g離心10 min，使用70%乙醇洗3次，最后在真空干燥箱中干燥?；罨蟮牟东@探針用Hepes緩沖液(10 mmol/L Hepes，200 mmol/L KCl，0.5 mmol/L EDTA，pH=7.5)稀釋至1 μmol/L備用，1 μmol/L的上述溶液加入鍍銀96孔板中，每孔100 μL，封口，4 ℃過夜反應(yīng)。用去離子水洗3遍，在干燥箱中干燥(2～3 h)，封膜，4 ℃保存。

另外通過交聯(lián)劑BS3將氨基修飾的核酸固定在表面修飾Poly-(Phe, Lys)的96孔板中作為對照組使用，干燥箱中晾干，封膜，4 ℃保存。

1.2.4 靶標(biāo)檢測：在修飾了核酸的96孔板中分別加入完全互補(bǔ)配對的靶標(biāo)(target18)和有錯配的靶標(biāo)，室溫反應(yīng)2 h，洗液洗3遍后，再加入修飾FAM的信號探針，室溫反應(yīng)2 h，洗液洗3遍，使用多功能酶標(biāo)儀測量熒光信號(圖1)。

表1 實(shí)驗中所使用的探針序列Table 1 Sequences of oligonucleotides used in this study*

*In the capture probes, the toeholds are underlined and the loops are italicized; in the target and mutant sequences, the bases at the mutational position are highlighted in red; the mutant type is the change of the relative base.

圖1 基于toehold調(diào)節(jié)的鏈置換反應(yīng)和金屬增強(qiáng)熒光的SNP檢測示意圖

2 結(jié)果

2.1 溫度對熒光信號的影響

在不同溫度下進(jìn)行反應(yīng)，加入的靶標(biāo)濃度和信號探針濃度分別為100 nmol/L和1 μmol/L，緩沖液選用Tris-HCL緩沖液(10 mmol/L Tris, 500 mmol/L Na+, 5 mmol/L Mg2+, 10 mmol/L EDTA)。溫度升高至30 ℃后，熒光信號發(fā)生顯著下降(圖2)。在保證靈敏度的基礎(chǔ)上為了進(jìn)一步達(dá)到簡化實(shí)驗過程的目的，本實(shí)驗選擇在室溫反應(yīng)(23 ℃)。

*Plt;0.05 compared with 30 ℃圖2 溫度對熒光信號的影響Fig 2 Effect of temperature on fluorescence intensity

2.2熒光團(tuán)與銀表面之間的距離對熒光信號的影響

為了確定最佳的熒光團(tuán)距銀表面的距離，分別選用了3T、5T、7T 作為間隔序列(spacer)，并與不加間隔序列的捕獲探針進(jìn)行對比，其中加入3T得到的熒光信號最高(圖3)。

in the Y-axis label, F/F(blank) represents the ratio of signal to blank; control was the capture probe with no spacer, 3N, 5N and 7N was added with 3T, 5T and 7T spacer;*Plt;0.05 compared with control and 5N圖3 間隔序列長度對熒光信號的影響Fig 3 Effects of length of spacer on the fluorescence intensity

2.3 聚乙二醇2000(PEG 2000)對實(shí)驗的影響

分析了不同濃度的PEG 2000對實(shí)驗結(jié)果的影響，其中3% PEG 2000效果最佳(圖4)。

*Plt;0.05 compared with 0% PEG圖4 溶液中PEG 2000對鏈置換反應(yīng)的影響Fig 4 Effects of PEG 2000 on the fluorescence intensity

2.4 金屬增強(qiáng)熒光的放大效果

相對于普通的修飾捕獲探針的96孔板，鍍銀板的信號有顯著的放大效果(圖5)。

2.5 靈敏度

在對照組中，方法的檢出限為5 nmol/L，線性范圍為10～100 nmol/L(圖6A)。而在實(shí)驗組中，檢測限為0.2 nmol/L，線性范圍為2～150 nmol/L(圖6B)，其檢測曲線的斜率顯著大于對照組，也即靈敏度顯著高于對照組，并且靶標(biāo)的檢測線性范圍相對于對照組也有一定延伸。

*Plt;0.05 compared with control group圖5 不同濃度的靶標(biāo)分別在普通96孔板和鍍銀96孔板中的信號響應(yīng)Fig 5 Concentration response of the target strand in both normal 96-well plate and silver- coated 96-well plate

2.6 特異性

將錯配位點(diǎn)設(shè)計在toehold區(qū)域，分別為M1、M2、M3、M4、M5和M6(順序為3′- 5′)，分別在對照組和實(shí)驗組進(jìn)行實(shí)驗，兩組結(jié)果都顯示出了明顯的區(qū)分錯配靶標(biāo)的能力。但在對照組中，不同錯配位點(diǎn)的熒光強(qiáng)度區(qū)別不大，而實(shí)驗組不但能區(qū)分錯配靶標(biāo)，而且顯示出區(qū)分不同錯配位點(diǎn)的能力(圖7)。

3 討論

當(dāng)有入射光入射時，熒光團(tuán)被激發(fā)，產(chǎn)生振蕩偶極子，誘導(dǎo)金屬中的自由電子發(fā)生振動，由此產(chǎn)生的電磁場能進(jìn)一步與激發(fā)態(tài)的熒光團(tuán)作用，從而增強(qiáng)熒光團(tuán)的發(fā)射。在鍍銀板中，線性范圍的擴(kuò)展原因可能是由于鍍銀96孔板中固定的靶標(biāo)濃度高于普通96孔板。在96孔板的修飾過程中，鍍銀板是通過Ag與SH的直接反應(yīng)所實(shí)現(xiàn)，而對照組使用了BS3作為交聯(lián)劑，通過多部反應(yīng)實(shí)現(xiàn)修飾目的。

當(dāng)熒光團(tuán)與金屬表面的距離大約為10 nm時，將呈現(xiàn)出最大的放大效果[9]。且由于將靶標(biāo)固定在基底表面時，會增加反應(yīng)的空間位阻，因而表面固定的單鏈DNA相對于溶液中游離的單鏈DNA雜交效率低[10]。而加入spacer能提高固定靶標(biāo)的靈活度從而有效的降低表面的空間位阻，提高反應(yīng)效率，從而使toehold調(diào)節(jié)的鏈置換反應(yīng)更容易進(jìn)行。

另外，該方法能區(qū)分完全配對和含突變位點(diǎn)的靶標(biāo)，可能由于：1) 從動力學(xué)角度考慮，toehold調(diào)節(jié)的鏈置換反應(yīng)是逐步進(jìn)行，因而出現(xiàn)錯配位點(diǎn)時，將阻止鏈置換反應(yīng)進(jìn)一步往下發(fā)生，從而阻斷反應(yīng)或者降低反應(yīng)效率；2) 發(fā)卡結(jié)構(gòu)的捕獲探針含有12bp的互補(bǔ)雙鏈，穩(wěn)定性較高，只有完全配對的靶標(biāo)能將雙鏈打開，形成更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

A.normal 96-well plate; B.silver-coated plate圖6 線性范圍內(nèi)不同濃度靶標(biāo)的熒光信號Fig 6 Concentration of response of target strand in the dynamic range of the calibration curve

In the X-axis label, Comp represents the complementary target strand, M1～M6 represent strands with single-base mismatch position starting from 3′-end in the toehold region, C represents the control group;*Plt;0.05 compared with M1～M6 and Comp-C；#Plt;0.05 compared with M5 and M6；ΔPlt;0.05 compared with M1-C～M6-C

圖7在toehold不同位點(diǎn)發(fā)生錯配的靶標(biāo)對應(yīng)的熒光信號
Fig7Theoutputsignalcomparisonoftargetwithdifferentmismatchonthetoeholddomain

綜上，本研究建立了一種金屬增強(qiáng)熒光的突變篩查方法，相對于對照組信號有10倍左右的增強(qiáng)；并且能通過toehold調(diào)節(jié)的鏈置換反應(yīng)區(qū)分完全互補(bǔ)配對和含錯配的靶標(biāo)，當(dāng)錯配發(fā)生在toehold區(qū)域時，信號相對于完全互補(bǔ)靶標(biāo)有顯著的下降，并且當(dāng)錯配發(fā)生在toehold里端(M1)時，信號降低最顯著，因此可以通過這個結(jié)果設(shè)計序列中要檢測的錯配位點(diǎn)。該方法顯示出較好的靈敏度和特異性并且能直接在室溫進(jìn)行，非常方便快捷。鑒于上述優(yōu)點(diǎn)，該方法能為大批量核酸序列的快速篩查提供可能的檢測方法。

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High throughput mutation screening based on metal-enhanced fluorescence

XU Yao, ZHENG Zhi*

(Institute of Basic Medical Sciences, CAMS amp; PUMC, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo develop a highly sensitive and selective method for mutation detection utilizing metal enhanced fluorescence (MEF).MethodsStrand-displacement was initiated by introducing the target ssDNA and resulting in the unfolding of the capture probe. A signal probe coupled with carboxy fluorescein(FAM) was further hybridizing with the unfolding capture probe and generating fluorescent signal.ResultsComparing to normal method, the MEF design could discriminate complementary target from targets with mismatch, and holds noticeable specificity and highly sensitivity (～13 fold signal amplification with 100 nmol/L target) with the detection limit of 0.1 nmol/L in silver-coated 96-well plate (control group is 5 nmol/L).ConclusionsThe MEF assay provides an alternative screening method for mutation detection.

strand-displacement reaction; metal-enhanced fluorescence; mismatch screening

2014- 03- 10

2014- 04- 16

國家自然科學(xué)基金(81271926)

*通信作者(correspondingauthor)：zhizheng10@yahoo.com

1001-6325(2014)06-0797-05

R 446.1

A