焦 濤，崔安芳，常永生

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005)

研究論文

KLF9基因腺病毒載體的構(gòu)建及其抗ROS功能

焦 濤，崔安芳，常永生*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005)

目的構(gòu)建及鑒定KLF9基因過(guò)表達(dá)的腺病毒載體，初步研究KLF9在對(duì)抗反應(yīng)活性氧方面的功能。方法克隆KLF9過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，定向克隆入穿梭載體pAdTrack-CMV，PmeⅠ酶切線性化，轉(zhuǎn)化E.coli.BJ5183(含腺病毒載體pAdEasy-1)感受態(tài)細(xì)菌，產(chǎn)生重組腺病毒載體。重組載體經(jīng)過(guò)卡那霉素抗性篩選和限制性內(nèi)切酶分析確認(rèn)重組后，再用PacⅠ線性化重組質(zhì)粒，回收，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，7～12 d包裝產(chǎn)生病毒顆粒。利用H2O2和過(guò)表達(dá)KLF9的腺病毒處理體外培養(yǎng)的C57BL/6J小鼠原代肝臟細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)KLF9和抗ROS基因(CAT、SOD2和GPx1)的表達(dá)。結(jié)果H2O2可以刺激C57BL/6J小鼠原代肝臟細(xì)胞KLF9和抗ROS基因的表達(dá)上調(diào)(Plt;0.05)。定量PCR以及Western blot結(jié)果顯示成功包裝過(guò)表達(dá)KLF9腺病毒，感染效率達(dá)90%以上。過(guò)表達(dá)KLF9可以上調(diào)抗ROS基因的表達(dá)水平(Plt;0.05)。結(jié)論初步認(rèn)定KLF9基因可參與C57BL/6J小鼠原代肝臟細(xì)胞中抗ROS基因的調(diào)節(jié)。

KLF9；腺病毒；反應(yīng)活性氧

反應(yīng)活性氧(reactive oxygen species, ROS)包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥自由基等。正常狀態(tài)下，氧化磷酸化過(guò)程中消耗的氧0.4%～4.0%轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化物，并最終解毒成O2和H2O2。當(dāng)機(jī)體的防御機(jī)制無(wú)法抵抗活性氧的產(chǎn)生，就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)生物大分子(如DNA、蛋白質(zhì)、脂類等)發(fā)生超氧化反應(yīng)而產(chǎn)生突變或損傷，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能破壞[1]。機(jī)體內(nèi)抗氧化防御機(jī)制主要有兩種：抗氧化酶類如超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，SOD2)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)等，非酶類分子則包括谷胱甘肽(glutathione，GSH)、硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)和維生素A、C、E等[2]。

Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子(Krüppel-like factors，KLFs)是一類Cys2/His2鋅指結(jié)構(gòu)-DNA結(jié)合蛋白[3]，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡[4]和組織器官發(fā)育[5]中發(fā)揮重要作用。目前的研究表明有許多KLF家族成員都與機(jī)體的能量代謝有關(guān)。Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子9(KLF9)，又稱為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合蛋白-1(basic transcription element-binding protein-1，BTEB1)，是KLF家族中的重要成員，最初從大鼠肝臟 cDNA文庫(kù)中克隆得到[6]。但是有關(guān)KLF家族在能量代謝和ROS方面的研究鮮有文章報(bào)道。本研究初步探討KLF9在抗反應(yīng)活性氧中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

KLF9擴(kuò)增序列引物(Invitrogen公司)，擴(kuò)增序列：5′-GAATTCCCACCATGTCCGCGGCCGCCTACA-3′(正向)和5′-CTCGAGTCACAAGGGGCTGGC-3′ (反向)，兩端分別添加KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)，C端加Flag標(biāo)簽。KpnⅠ和XbaⅠ酶、T4 DNA連接酶、pyrobest Taq DNA聚合酶、dNTPs(Takara公司)。T-easy質(zhì)粒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(Promega公司)。Lipofectamine2000、細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、RPMI1640、 Trizol(Invitrogen公司)。pAdTrack-CMV、pAdTrack-U6、E.coli. BJ5183、DH5 感受態(tài)細(xì)菌以及人胚腎細(xì)胞系293A由本實(shí)驗(yàn)室保存。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI公司)。胎牛血清、青霉素、鏈霉素(Hylone公司)。明膠和膠原酶(Sigma公司)。六周齡的雄性C57BL/6J小鼠購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)為SCXK-(軍)2012-0004]。小鼠飼養(yǎng)和管理按照中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2 KLF9基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及腺病毒包裝

將測(cè)序正確連接在T-easy質(zhì)粒上的KLF9酶切下來(lái)，定向插入穿梭載體pAdTrack-CMV。提取穿梭質(zhì)粒，取5 μg質(zhì)粒，經(jīng)PmeⅠ酶切7 h充分線性化，酚/氯仿抽提，溶于20 μL去離子水中。取100～500 ng酶切質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli. BJ5183感受態(tài)細(xì)菌。以500 mL LB培養(yǎng)基重懸細(xì)菌，涂于卡那霉素抗性的LB平板，置于37 ℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)16～20 h。挑取較小的克隆搖床過(guò)夜，提質(zhì)粒，經(jīng)PacⅠ酶切可得30.0和4.5 kb兩條帶，即為陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，提取質(zhì)粒。取12 μg所得的重組質(zhì)粒，用PacⅠ 酶切7～9 h，經(jīng)酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶于去離子水。將回收質(zhì)粒以轉(zhuǎn)染密度50%～70%接種于T-25培養(yǎng)瓶的293A細(xì)胞。孵箱中培養(yǎng)10～15 d，不用換培養(yǎng)基，隔天補(bǔ)500 μL DMEM完全培養(yǎng)基。一般轉(zhuǎn)染5～7 d后可以通過(guò)熒光顯微鏡觀察到GFP斑。

1.3 KLF9腺病毒的擴(kuò)增

轉(zhuǎn)染后10～12 d，收取細(xì)胞，轉(zhuǎn)入50 mL離心管。重懸于PBS中，在液氮和37 ℃反復(fù)凍融4次，收集病毒裂解液。第2輪擴(kuò)增，加病毒裂解液到2個(gè)T-25瓶子(接種293A細(xì)胞，匯合度90%)，細(xì)胞全部呈綠色且30%～50%細(xì)胞懸浮時(shí)，收集細(xì)胞，重懸于PBS中，在液氮和37 ℃反復(fù)凍融4次，收集病毒裂解液。第3輪擴(kuò)增，加病毒于10個(gè)Φ100 mm大皿中(接種293A細(xì)胞，匯合度90%)，其余步驟同第2輪擴(kuò)增。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及小鼠肝原代細(xì)胞處理

采用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293A細(xì)胞，培養(yǎng)基中添加100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素。細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。用經(jīng)典的灌流膠原酶消化法獲取成活率為90%以上的C57BL/6J小鼠肝臟原代細(xì)胞，鋪至6孔板中，用1640(10%血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉索)培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2的飽和濕度箱中培養(yǎng)。用濃度為1 mmol/L的H2O2處理C57BL/6J小鼠原代肝臟細(xì)胞，對(duì)照組加等量的PBS，在37 ℃、5% CO2的飽和濕度溫箱中培養(yǎng)2 h，然后棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，換新鮮的完全培養(yǎng)基再培養(yǎng)2 h后去掉培養(yǎng)基，用1 mL Trizol提取RNA。向C57BL/6J小鼠原代肝臟細(xì)胞中加過(guò)表達(dá)KLF9的腺病毒及其對(duì)照Ad-GFP，6 h以后更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白完全表達(dá)，去掉培養(yǎng)基，用1 mL Trizol提取RNA。

1.5 總RNA提取和Real-time PCR

Trizol法提取小鼠原代肝臟細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量，取2 μg總RNA，加入隨機(jī)引物用Multi Scribe反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以1 μg cDNA為模板，在CFX-96儀器(BIO-RAD公司)上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。條件為：95 ℃ 10 min、95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(捕捉熒光值)，循環(huán)40次，并作熔解曲線。各基因的定量PCR引物序列見(jiàn)表1。樣本結(jié)果以目的基因與β-actin的比值做相對(duì)定量分析，數(shù)據(jù)分析采用比較CT法，重復(fù)樣本(n=3)取平均值。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR的引物序列

1.6 Western blot

蛋白樣品以SDS-PAGE(分離膠濃度為10%)分離；電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白樣品電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，電轉(zhuǎn)1.5 h，封閉液室溫封閉PVDF膜1.5 h；PVDF膜置于一抗(anti-Flag：1∶8 000)溶液中，4 ℃搖床過(guò)夜；TBST洗PVDF膜4次，每次10 min；PVDF膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(用TBST配制的2.5% BSA以1∶5 000稀釋)室溫作用1～2 h；TBST洗PVDF膜4次，每次10 min；將ECL液體以0.1 mL/cm2膜的用量滴加在PVDF膜上，室溫1 min。迅速吸去多余的ECL液體，用保鮮膜包好PVDF膜，暗室曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1H2O2刺激小鼠的原代肝臟細(xì)胞KLF9及抗ROS基因的表達(dá)上調(diào)

與對(duì)照組相比，H2O2處理的C57BL/6J小鼠原代肝臟細(xì)胞中，KLF9以及抗ROS基因的表達(dá)水平均明顯上調(diào)(Plt;0.05)(圖1)。

*Plt;0.05 compared with PBS group圖1 H2O2刺激小鼠的原代肝臟細(xì)胞抗ROS基因表達(dá)上調(diào)Fig 1 The expression of anti-ROS genes was upregualted in mouse primary hepatocytes following H2O2 treatment

2.2KLF9基因過(guò)表達(dá)腺病毒的包裝及原代肝細(xì)胞水平驗(yàn)證

PCR擴(kuò)增約1 000 bp片段，連接T-easy載體，經(jīng)過(guò)測(cè)序與NCBI上報(bào)導(dǎo)的序列一致。重組質(zhì)粒，經(jīng)PacⅠ酶切后，產(chǎn)生30.0 kb和4.5 kb左右的兩條帶。PacⅠ 線性化的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，約7～10 d 可見(jiàn)明顯的擴(kuò)增斑(圖2A)。實(shí)時(shí)定量PCR檢檢測(cè)，與空白對(duì)照組及感染Ad-GFP組相比，感染Ad-KLF9腺病毒組原代肝細(xì)胞中KLF9的表達(dá)量上調(diào)約20倍(Plt;0.01)(圖2B)。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)感染Ad-KLF9的原代肝臟細(xì)胞，在相對(duì)分子質(zhì)量38 ku處有一條非常特異的條帶，而感染Ad-GFP的對(duì)照組則沒(méi)有條帶(圖2C)。

A.the viral multiplied plaque when transfeced into 293A cells 8 th day(×20);B.the expression ofKLF9 in mouse primary hepatocytes infected with Ad-GFP and Ad-KLF9(*Plt;0.01 compared with Ad-GFP and blank);C.the expression ofKLF9 in protein level when infected with Ad-GFP and Ad-KLF9

圖2KLF9基因腺病毒載體的包裝驗(yàn)證

Fig2TheidentificationofKLF9adenoviralvector

2.3KLF9激活小鼠原代肝臟細(xì)胞抗ROS基因的表達(dá)

與感染Ad-GFP對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)KLF9可以明顯誘導(dǎo)CAT、SOD2、GPx1等抗ROS相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)(Plt;0.05)(圖3)。

3 討論

反應(yīng)活性氧(ROS)能與DNA、蛋白質(zhì)、脂類等反應(yīng)，在許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，如糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、衰老等[7- 8]。細(xì)胞內(nèi)ROS的清除途徑主要是通過(guò)ROS去毒酶，包括谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPxl)和超氧化物歧化酶(SODs)等[1]。

*Plt;0.05 compared with Ad-GFP圖3 KLF9上調(diào)小鼠原代肝細(xì)胞抗ROS基因的表達(dá)Fig 3 The expression of anti-ROS genes in mouse primary hepatocytes infected with Ad-GFP and Ad-KLF9

研究表明有許多KLF家族成員包括KLF2、KLF5和KLF15參與脂代謝。例如敲低KLF4可以影響脂肪合成[9]。KLF5敲除小鼠的白色脂肪組織發(fā)育不良，而且過(guò)表達(dá)KLF5可以促進(jìn)前脂肪細(xì)胞3T3-L1的分化。而KLF5又可以與C/EBPβ相互作用，從而促進(jìn)PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ)基因的表達(dá)[10]。這些KLF家族在脂肪細(xì)胞中的作用提示KLF9很可能在能量代謝ROS清除中起作用。

本研究首先用H2O2刺激C57BL/6J小鼠的原代肝細(xì)胞，檢測(cè)和抗ROS相關(guān)基因的表達(dá)，然后用過(guò)表達(dá)的腺病毒感染原代肝細(xì)胞。結(jié)果顯示可通過(guò)增加細(xì)胞中清除ROS基因的表達(dá)而提高細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，為其用于治療與ROS有關(guān)的疾病奠定了理論基礎(chǔ)。

腺病毒載體系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)基因在哺乳動(dòng)物和細(xì)胞中高效表達(dá)，該實(shí)驗(yàn)方法目前應(yīng)用非常廣泛。本研究包裝成功的腺病毒感染肝原代細(xì)胞效率可以達(dá)到90%以上，為在細(xì)胞水平功能的研究提供了有力手段。而且腺病毒能夠特異且高效地感染肝臟細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)KLF9基因在肝臟中過(guò)表達(dá)，為KLF9可能的基因治療提供了保證。

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KLF9 adenoviral vector construction and it’s function in anti-ROS

JIAO Tao, CUI An-fang, CHANG Yong-sheng*

(State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS，Beijing 100005，China)

ObjectiveTo construct the adenoviral overexpressing vector of Krüppel-like factor 9(KLF9) and to explore the role ofKLF9 in the regulation of anti-ROSgenes expression.MethodsTheKLF9 gene is cloned into the shuttle vector pAdTrack-CMV. The resultant plasmid is linearized by digesting with restriction endonucleasePmeⅠ, and subsequently cotransformed intoE.coli. BJ5183 competent cells with pAdEasy-1.Recombinants are selected for kanamycin resistance and recombination confirmed by restriction endonuclease analyses. Finally, the linearized recombinant plasmid is transfected into 293A cells. Recombinant adenoviruses are typically generated within 7 to 12 days. The mouse primary hepatocytes are isolated from the C57BL/6J mouse and subsequently H2O2treatment is conducted. We aslo performedKLF9 overexpression by using Ad-virus system (Ad-KLF9) in mouse primary hepatocytes isolated from the C57BL/6J mouse. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis was further performed to determine the expression of anti-ROSgenes including catalase(CAT), manganese superoxide dismutase(SOD2) and glutathione peroxidase 1(GPx1).ResultsThe expression ofKLF9 and anti-ROSgenes were upregualted in C57BL/6J mouse primary hepatocytes following H2O2treatment (Plt;0.05).The results of qRT-PCR

and Western blot proved that adenoviral vector ofKLF9was successfully produced with 90% infection efficiency. The expression of anti-ROSgenes were also upregualted in C57BL/6J mouse primary hepatocytes after infecting with Ad-KLF9(Plt;0.05).ConclusionsKLF9 represents its impact on the expression of anti-ROSgenes.

KLF9; adenovirus; ROS

2014- 03- 08

2014- 04- 11

國(guó)家自然科學(xué)基金(81170763)

*通信作者(correspondingauthor)：changy@ibms.pumc.edu.cn

1001-6325(2014)06-0762-05

R 73

A