胡愉，趙慧，王準(zhǔn)，何維*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 免疫學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005；2.中國食品藥品檢定研究院 病毒三室，北京100050)

#對(duì)本文有相同貢獻(xiàn)

研究論文

CDR3δ2基因修飾γδT細(xì)胞的構(gòu)建及其功能鑒定

胡 愉1#，趙 慧1，2#，王 準(zhǔn)1，何 維1*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 免疫學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005；2.中國食品藥品檢定研究院 病毒三室，北京100050)

目的將全長γ9鏈mRNA和腫瘤反應(yīng)性CDR3移植的δ2鏈mRNA共轉(zhuǎn)染到抗CD3抗體刺激的PBMC，制備CDR3δ2基因修飾型γδ T淋巴細(xì)胞，研究其抗腫瘤作用。方法通過PCR擴(kuò)增含有腫瘤反應(yīng)性特異CDR3δ2序列(OT3和OT10)的TCR δ2鏈及γ9鏈，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM4Z/δ2(OT3)/A64、pGEM4Z/ δ2(OT10)/ A64和pGEM4Z/γ9/A64；以線性化的重組質(zhì)粒作為模板，體外合成δ2(OT3)、δ2(OT10)和γ9 mRNA；將δ2(OT3) mRNA和δ2(OT10) mRNA分別與γ9 mRNA共電轉(zhuǎn)染入抗CD3抗體刺激的正常人PBMC；經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測和分選γ9δ2(OT3) T細(xì)胞和γ9δ2(T10)T細(xì)胞。ELISA及MTT法分別檢測上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抗腫瘤作用。結(jié)果CDR3δ2基因修飾的TCRγδ細(xì)胞γ9δ2(OT3)T細(xì)胞和γ9δ2(T10) T細(xì)胞能夠分泌較高的IFN-γ及TNF-α(Plt;0.05)，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒作用(Plt;0.05)。結(jié)論基因修飾型γ9δ2 T細(xì)胞能夠明顯增強(qiáng)對(duì)腫瘤的殺傷活性，為腫瘤過繼免疫細(xì)胞的制備提供了新的策略。

T細(xì)胞；CDR3δ2；γδTCR；過繼免疫治療；OT3；OT10

腫瘤的免疫治療被人們寄予厚望，尤其是腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的過繼性免疫治療被認(rèn)為是有巨大發(fā)展?jié)摿Φ闹委煵呗?。然而，目前?shí)驗(yàn)性或臨床試驗(yàn)并沒有出現(xiàn)令人滿意的療效[1- 3]。作為T細(xì)胞群體的一類，γδ T細(xì)胞獨(dú)特的抗原識(shí)別模式及其廣譜的腫瘤殺傷活性，使γδ T細(xì)胞作為候選免疫過繼細(xì)胞已受到人們的關(guān)注。但由于γδ T細(xì)胞僅占外周血CD3+T細(xì)胞的較少比例(lt;10%)，尤其是中晚期腫瘤患者或化療后患者體內(nèi)免疫抑制，導(dǎo)致種子細(xì)胞數(shù)量減少和免疫活性下降，致使體外擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量受限，難以達(dá)到治療所需量的細(xì)胞制劑。因此，獲取充足數(shù)量、安全且有良好生物學(xué)功能的γδ T細(xì)胞是開展γδ T細(xì)胞過繼免疫治療的瓶頸問題。

前期在γδ T細(xì)胞抗原識(shí)別機(jī)制的研究過程中，篩選到了一些特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的TCRγδ CDR3δ優(yōu)勢序列如OT3和OT10等，并通過合成的OT3或OT10肽及OT3-或OT10-移植抗體[4- 5]證明其對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷作用。本研究擬利用已建立的轉(zhuǎn)染mRNA的技術(shù)平臺(tái)，將全長 9鏈及腫瘤反應(yīng)性CDR3移植的和 2鏈mRNA共轉(zhuǎn)染到抗CD3抗體刺激的PBMC中，建立基于γδ TCR抗原識(shí)別機(jī)制的新型基因工程γδ TCR表達(dá)細(xì)胞，進(jìn)而檢測其抗腫瘤作用。為γδT細(xì)胞過繼免疫治療腫瘤提供新的方法和策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及菌株

SKOV3，人類卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞系(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)，以含10%胎牛血清(FCS)的McCoy 5A培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；HO8910，人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞系(本研究室自存)，以含10% FCS 的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)；HeLa，人宮頸癌腫瘤細(xì)胞系(本研究室自存)，以含10% FCS的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。大腸桿菌DH5α為本室保存，基因型為supE44lacU169(80lacZM15)hsdR17recA1end1gyr96thi-1relA1, 用于質(zhì)粒的擴(kuò)增與轉(zhuǎn)化。

1.2 其他材料與試劑

pcDNA3.1-δ2(OT3)和pcDNA3.1-δ2(OT10)分別插入CDR3區(qū)為OT3和OT10序列替代全長δ2鏈的重組質(zhì)粒；pcDNA3.1-γ9為含全長γ9鏈基因的重組質(zhì)粒(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所郗雪燕博士構(gòu)建，現(xiàn)本研究室保存)；pGEM4Z/EGFP/A64用于體外轉(zhuǎn)錄RNA(布魯塞爾自由大學(xué)Joeri L.Aerts教授惠贈(zèng))；DNA片段純化試劑盒(Axygen公司)；The mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit(Ambion公司)；MinElute Reaction Cleanup 回收試劑盒和RNasey Mini Kit試劑盒(Qiagen公司)；人TNF-α和IFN-γ ELISA檢測試劑盒(BD公司)；擴(kuò)增用TCRγδ抗體、CD3抗體和FITC標(biāo)記的抗γδ抗體(Immunotech公司)；APC標(biāo)記的抗CD3 抗體及同型對(duì)照抗體(Biolegend公司)；封閉用抗TCRγδ的抗體(B1.1)(eBioscience公司)；HRP酶標(biāo)羊抗鼠二抗(中山公司)；Pfu DNA聚合酶和T4DNA連接酶(Fermentas公司)； Oligo(dT)15Primer、RNA酶抑制劑和dNTP(Promega公司)；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000(大連寶生物工程有限公司)；KpnⅠ和XhoⅠ等限制性內(nèi)切酶(NEB公司)；MTT和DMSO(盈信陽光生物科技有限公司)；瓊脂糖(Promega公司)；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉和氨芐青霉素等(國產(chǎn)優(yōu)級(jí)純或分析純?cè)噭?；IPTG、X-gal、G418和Hygromycin(Merck公司)；細(xì)胞裂解液、淋巴細(xì)胞分離液(TBD公司)；RPMI-1640、OPTI-MEM 和DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)。

1.3 引物

用于擴(kuò)增γδTCR 的全長γ鏈和δ鏈基因的引物由北京擎科公司合成(表1)。

表1 用于擴(kuò)增γδTCR的全長γ鏈和δ鏈基因的引物

1.4TCR的γ9鏈和移植CDR3-δ2鏈全長基因的擴(kuò)增和純化

分別以pcDNA3.1-γ9、pcDNA3.1-δ2(OT3)、pcDNA3.1-δ2(OT10)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增TCRγ鏈、TCRδ2(OT3)鏈和TCRδ2(OT10)鏈全長基因。

反應(yīng)體系如下：質(zhì)粒模板1 μL，引物(γ-up和γ-down或CDR3δ2-up和CDR3δ2-down)各1 μL，10×緩沖液5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，pfu酶(1×106U/L)1 μL，去離子水補(bǔ)足至50 μL；PCR參數(shù)：95 ℃變性5 min后，再以94 ℃ 30 s，61 ℃ 45 s，72 ℃ 70 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

PCR產(chǎn)物按照Axygen公司DNA純化試劑盒的說明進(jìn)行層析柱離心純化。簡言之，將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠放置在1.5 mL離心管中，加3倍體積的緩沖液DE-A, 渦旋混勻，75 ℃水浴加熱直至凝膠完全溶解，加1.5倍體積的DE-B緩沖液；混合后加入柱子上，12 000×g離心1 min，棄離出液；分別用500 μL緩沖液W1和700 μL緩沖液W2洗柱子1次和2次，每次12 000×g離心1 min，棄離出液；最后將柱子轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5 mL離心管上，加入25 μL去離子水靜置1 min，12 000×g離心1 min，收集離出液，于-20 ℃保存。

1.5重組質(zhì)粒pGEM4Z/γ9/A64、pGEM4Z/δ2(OT3)/A64和pGEM4Z/δ2(OT10)/A64的構(gòu)建及鑒定

KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切PCR擴(kuò)增TCRγ9鏈、TCR/δ2(OT3)鏈和TCR/δ2(OT10)鏈全長基因及pGEM4Z/EGFP/A64。取3 μL 10×酶切反應(yīng)緩沖液，20 μL PCR產(chǎn)物或1 μg質(zhì)粒，0.8 μLKpnⅠ酶，0.4 μLXhoⅠ酶，0.3 μL 100×BSA補(bǔ)ddH2O至總體積為30 μL。37 ℃酶切2 h或3 h，用回收PCR產(chǎn)物的方法回收酶切片段。1 μL 10×連接反應(yīng)緩沖液，7 μL酶切后PCR產(chǎn)物，1 μL酶切后的載體，1 μL T4DNA連接酶，總反應(yīng)體積為10 μL。充分混勻并離心使其沉于管底，4 ℃連接過夜，分別構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEM4Z/γ9/A64、pGEM4Z/δ2(OT3)/A64和pGEM4Z/ δ2(OT10) /A64。

將上述重組質(zhì)粒按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，于含有氨卞青霉素的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過夜，此時(shí)菌落直徑約為1～2 mm。陽性重組質(zhì)粒DNA經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切及1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定含有重組DNA插入片段者，由諾塞生物技術(shù)公司行序列測定。用DNAMAN軟件分析測序結(jié)果。

1.6 γ9δ2(OT3)T和γ9δ2(OT10)T細(xì)胞的構(gòu)建

1.6.1 全長TCRγ9、TCRδ2(OT3)及TCRδ2(OT10)mRNA的體外合成及其純化：嚴(yán)格按照Ambion公司mRNA的體外合成及純化試劑盒(mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit)操作說明進(jìn)行。每個(gè)反應(yīng)取線性化重組質(zhì)粒1 μg，在20 μL體系中進(jìn)行RNA合成。用RNeasy Mini柱子進(jìn)行純化。根據(jù)260 nm的吸光度值(A260)，按照公式A260×稀釋倍數(shù)×40(μg/mL)計(jì)算RNA的量。分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 TCRγ9分別和TCRδ2(OT1)、TCRδ2(OT3)及TCRδ2(OT10)mRNA的共轉(zhuǎn)染：從正常人(已取得知情同意)外周血中密度梯度離心分離PBMC，收集經(jīng)抗CD3抗體刺激培養(yǎng)4 d的正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用OPTI-MEM洗細(xì)胞1次。用OPTI-MEM重懸細(xì)胞至終濃度2.5×107/mL。冰上放置5 min。將TCRγ9 RNA 5 μg分別與TCRδ2(OT3)或TCRδ2(OT10) 5 μg混合，然后同200 μL細(xì)胞一起移入電轉(zhuǎn)杯，并置入電轉(zhuǎn)儀中，進(jìn)行電轉(zhuǎn)。根據(jù)前期優(yōu)化的電轉(zhuǎn)條件，電轉(zhuǎn)參數(shù)為500 V，500 μs。電轉(zhuǎn)完畢后，立即移入含RPMI-1640完全培養(yǎng)基的6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與功能鑒定

1.7.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞γδTCR的表達(dá)：收集待測共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，配制成1×106/mL的細(xì)胞懸液。PBS洗滌3次，吸盡上清后，加入FITC標(biāo)記的抗TCRγδ單克隆抗體5 μL，4 ℃孵育30 min。離心并用PBS(含1%牛血清白蛋白)洗滌3次，吸盡上清后加入500 μL的1%多聚甲醛固定液，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。同型對(duì)照采用FITC標(biāo)記的同型對(duì)照抗體。陽性轉(zhuǎn)染T細(xì)胞分別稱為γ9δ2(OT3)T或γ9δ2(OT10)T細(xì)胞。

1.7.2 ELISA檢測細(xì)胞因子：用80 μg/每孔自制SKOV3細(xì)胞總蛋白包被24孔板中，37 ℃孵育2 h，然后加入1×106個(gè)γ9δ2(OT3)T或γ9δ2(OT10)T細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染EGFPmRNA的細(xì)胞為對(duì)照；37 ℃孵育24 h后，收集上清，按照說明書，用人TNF-α和IFN-γ ELISA檢測試劑盒，檢測各組細(xì)胞TNF-α及IFN-γ的表達(dá)。

1.7.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)：分別以SKOV3、HeLa和HO8910等腫瘤細(xì)胞系作為靶細(xì)胞，用相應(yīng)的培養(yǎng)液洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，以100 μL/孔加入96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后即可用于殺傷實(shí)驗(yàn)。

以轉(zhuǎn)染并表達(dá)γ9δ2(OT1)TCR、γ9δ2(OT3)TCR和γ9δ2(OT10)TCR的細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，使效靶比分別為1∶1、5∶1和10∶1, 將各組效應(yīng)細(xì)胞分別加入各靶細(xì)胞孔內(nèi)，每組3個(gè)平行孔。此外，設(shè)立只加靶細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞或只加入培養(yǎng)液的對(duì)照孔。

MTT法檢測殺傷活性。將混合后的反應(yīng)體系置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12 h后，每孔吸去100 μL上清，加入10 μL MTT，繼續(xù)孵育。8 h后，每孔加入100 μL DMSO，孵育4 h，于測定波長570 nm，參考波長630 nm處測定吸光度(A)，并按下列公式計(jì)算殺傷活性：

其中，TA指的是單加靶細(xì)胞的A值；EA為單加效應(yīng)細(xì)胞的A值；(E+T)A代表效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞混合孔的A值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1卵巢癌反應(yīng)性γδTCRpGEM4Z/γ9/A64質(zhì)粒及pGEM4Z/δ2(OT3)/A64重組質(zhì)粒的構(gòu)建與酶切鑒定

以pcDNA3.1-9和pcDNA3.1-δ2(OT3)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出含KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)的TCRγ9和TCRδ2 (OT3)全長基因，電泳鑒定如圖1A，擴(kuò)增產(chǎn)物長度與預(yù)測長度一致；重組pGEM4Z/γ9/A64質(zhì)粒和pGEM4Z/δ2(OT3)/A64酶切后電泳鑒定結(jié)果如圖1B，陽性克隆測序結(jié)果與預(yù)期序列一致。

A:M.marker, 1.the PCR production of TCRγ9, 2.TCRδ2(OT3); B:M.marker; 1.pGEM4Z/γ9/A64 plasmid, 2.pGEM4Z/γ9/A64 plasmid digested by XbaⅠand KpnⅠ, 3.pGEM4Z/δ2(OT3)/A64 plasmid, 4.pGEM4Z/δ2(OT3)/A64 plasmid digested by Xba Ⅰ and KpnⅠ圖1 重組質(zhì)粒pGEM4Z/γ9/A64和pGEM4Z/δ2(OT3)/A64的酶切鑒定Fig 1 The identification of the recombinant plasmid of pGEM4Z/γ9/A64 and pGEM4Z/δ2(OT3)/A64 digested by Xba Ⅰ and Kpn Ⅰ

2.2卵巢癌反應(yīng)性pGEM4Z/δ2(OT10)/A64重組質(zhì)粒的酶切鑒定

以pcDNA3.1-δ2(OT10)質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出含KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)的含有OT10序列的TCRδ2全長基因,電泳鑒定結(jié)果如圖2A;連接同樣酶切的pGEM4Z/A64載體，構(gòu)成重組質(zhì)粒pGEM4Z/δ2 (OT10)/A64，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定(圖2B)，陽性克隆測序結(jié)果與預(yù)期序列一致。

A：M.DNA marker; 1.the PCR production of OT10-grafted TCRδ2 chain；B:M.DNA marker; 1.pGEM4Z/δ2(OT10)/A64 digested by XbaⅠand KpnⅠ圖2 移植OT10結(jié)構(gòu)域序列的TCRδ2鏈的克隆鑒定Fig 2 The idenfication of TCRδ2 chain containing OT10 sequence in CDR3 region

2.3體外合成全長TCRγ9、TCRδ2(OT3)及TCRδ2(OT10)mRNA

每個(gè)體外合成mRNA反應(yīng)的產(chǎn)量不盡相同，在12 μg/反應(yīng)～15 μg/反應(yīng)之間。上述3個(gè)基因各進(jìn)行3次合成反應(yīng)，分別得到40 μg TCRγ9 mRNA、38 μg TCRδ2(OT3)及36 μg TCRδ2(OT10)的mRNA。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞TCRγδ的表達(dá)

通過流式細(xì)胞術(shù)分別檢測TCRδ2(OT3)及TCRδ2(OT10)mRNA電轉(zhuǎn)細(xì)胞[分別命名為γ9δ2(OT3) T細(xì)胞和γ9δ2(OT10)T細(xì)胞]表面γδTCR的表達(dá)均在20%左右。其中20.6%～22.8%的γ9δ2(OT3)T細(xì)胞表面表達(dá)γδTCR，19.7%～21.6%的γ9δ2(OT10)T細(xì)胞表面表達(dá)γδTCR。圖3顯示一份PBMC所得結(jié)果。

2.5SKOV3總蛋白與γ9δ2(OT3)T或γ9δ2(OT10)T細(xì)胞共孵育后TNF-α的表達(dá)

ELISA檢測SKOV3總蛋白刺激后，γ9δ2(OT3)T或γ9δ2(OT10)T細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞分泌TNF-α情況見圖4，γ9δ2(OT3)T(A)或γ9δ2(OT10)T(B)細(xì)胞上清中的TNF-α分泌水平雖高于對(duì)照細(xì)胞與SKOV3蛋白孵育后的細(xì)胞上清，但是只有來自第3個(gè)志愿者的PBMC與轉(zhuǎn)染所得γ9δ2(OT3)T和γ9δ2(OT10)T細(xì)胞明顯高于對(duì)照細(xì)胞(Plt;0.05)。

A.TCR expression of γ9δ2(OT3)T cells; B.TCR expression of γ9δ2(OT10)T cells圖3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞TCRγδ的表達(dá)Fig 3 TCRγδ expression on transfectant T cells

2.6SKOV3總蛋白與γ9δ2(OT3)T或γ9δ2(OT10)T細(xì)胞共孵育后IFN-γ的表達(dá)

ELISA檢測SKOV3總蛋白刺激后，γ9δ2(OT3)T或γ9δ2(OT10)T細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞分泌IFN-γ。如圖5，3個(gè)志愿者的PBMC轉(zhuǎn)染所得γ9δ2(OT3)T(A)或γ9δ2(OT10)T(B)細(xì)胞上清中的IFN-γ分泌水平均明顯高于對(duì)照細(xì)胞與SKOV3蛋白孵育后的細(xì)胞上清(Plt;0.05)。

2.7γ9δ2(OT3)T或γ9δ2(OT10)T細(xì)胞對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷活性

相對(duì)于轉(zhuǎn)染了EGFPmRNA的細(xì)胞，γ9δ2(OT3)T(圖6A)或γ9δ2(OT10)T(圖6B)細(xì)胞對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的殺傷活性明顯增高(Plt;0.05)。而且，隨著效靶比的增高，γ9δ2(OT3)T或γ9δ2(OT10)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力也增強(qiáng)，呈一定的量效關(guān)系。

*Plt;0.05 compared with control group圖4 ELISA分析γ9δ2(OT3)T細(xì)胞(A)或γ9δ2(OT10)T細(xì)胞(B)在SKOV3細(xì)胞總蛋白刺激后TNF-α的表達(dá)

*Plt;0.05 compared with control group圖5 ELISA分析γ9δ2(OT3)T細(xì)胞(A)或γ9δ2(OT10)T細(xì)胞(B)在SKOV3細(xì)胞總蛋白刺激后IFN-γ的表達(dá)

A.γ9δ2(OT3)T cells; B.γ9δ2(OT10)T cells; *Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with control圖6 γ9δ2(OT3)T和γ9δ2(OT10)T細(xì)胞對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)Fig 6 The cytotoxicity of the γ9δ2(OT3)T cells or γ9δ2(OT10)T cells to various tumor cell lines

3 討論

γδT細(xì)胞獨(dú)特的抗原識(shí)別模式及其廣譜的腫瘤殺傷活性，使γδT細(xì)胞作為候選免疫過繼細(xì)胞已受到人們的關(guān)注和重視。由于γδT細(xì)胞僅占外周血CD3+T細(xì)胞的較少比例(lt;10%)，尤其是中晚期腫瘤患者或化療后患者體內(nèi)免疫抑制，導(dǎo)致種子細(xì)胞數(shù)量減少和免疫活性下降，致使體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞數(shù)量受限已成為開展γδT細(xì)胞過繼免疫治療的瓶頸問題。建立一種新的細(xì)胞制備技術(shù)勢在必行。

應(yīng)用基因修飾方法構(gòu)建表達(dá)針對(duì)腫瘤抗原的基因修飾的T淋巴細(xì)用于治療腫瘤的研究早已見報(bào)道[6- 7]。在γδT細(xì)胞抗原識(shí)別機(jī)制的研究過程中，通過基因掃描和序列測定，篩選到了一些特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的TCRγδ CDR3δ優(yōu)勢序列如OT3和OT10等，并通過合成的OT3或OT10肽及OT3-或OT10-移植抗體[8]證明其對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷作用。本研究利用前期已經(jīng)建立的體外轉(zhuǎn)錄及電轉(zhuǎn)mRNA的基因工程技術(shù)，成功地將腫瘤反應(yīng)性CDR3(OT3或OT10)移植γδTCR 的mRNA轉(zhuǎn)染至抗CD3抗體刺激的PBMC，重塑細(xì)胞，制備了表達(dá)外源TCRγ9δ2(OT3)或TCRγ9δ2(T10)T細(xì)胞。陽性率均在20%左右。分選后所獲的基因修飾TCRγ9δ2 T細(xì)胞，分泌殺傷腫瘤的效應(yīng)性細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ的能力提高，在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的殺傷作用顯著增強(qiáng)。提示電轉(zhuǎn)mRNA基因重塑細(xì)胞有可能為腫瘤細(xì)胞過繼治療制劑的制備提供新的技術(shù)方法。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電轉(zhuǎn)染所獲γ9δ2(OT3)T和γ9δ2(OT10)T細(xì)胞的百分率還不是很高(20%左右)，這可能與γ9與δ2(OT3)或γ9與δ2(OT10)是兩條mRNA共轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染率及其轉(zhuǎn)染后的表達(dá)率不盡相同，導(dǎo)致細(xì)胞表面表達(dá)TCRγδ受限有關(guān), 對(duì)于多基因的電轉(zhuǎn)技術(shù)還有待進(jìn)一步優(yōu)化。

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The establishment of genetically CDR3δ2-modified γδ T lymphocytes and its functional characterization

HU Yu1#, ZHAO Hui1,2#, WANG Zhun1，HE Wei1*

(1.Dept. of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS amp; School of Basic Medicine, PUMC；State Key Laboratory ofMedical Molecular Biology, Beijing 100005; 2.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050，China)

ObjectiveTo explore the anti-tumor effect of genetically CDR3δ2-modified γδ T lymphocytes which were generated by co-transfection of the full-length γ9 mRNA and δ2 mRNA with tumor-reactive CDR3δ into anti-CD3 antibody stimulated human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).MethodsBy PCR, specific δ2 sequences containing tumor-reactive CDR3δ2 (OT3 and OT10) and γ9 chain were amplified to make recombinant plasmids pGEM4Z/δ2 (OT3)/A64, pGEM4Z/δ2 (OT10)/A64 and pGEM4Z/γ9/A64. Linearized plasmids were used as templates for the synthesis of δ2(OT3), δ2(OT10) and γ9 mRNAsinvitro. Synthesized δ2(OT3) mRNA and δ2(OT10) mRNA were co-transfected with γ9mRNA respectively into anti-CD3 antibody stimulated human PBMC. Flow cytometry and sorting were performed to isolate γ9δ2(OT3) T cells and γ9δ2 (T10) T cells. MTT assay and ELISA were applied to detect the anti-tumor effect of these CDR3δ2 genetically modified γδ T lymphocytes.ResultsCDR3δ2 genetically modified γ9δ (OT3) T cells and γ9δ2(T10) T cells secreted high levels of IFN-γ and TNF-α and displayed significant cytotoxicity to a variety of tumor cells(Plt;0.05).ConclusionsThe generation of genetically modified tumor-reactive γ9δ2 T cells is an efficient approach to enhance the anti-tumor activity of lymphocytes, which provides a novel strategy for adoptive immunity against tumors.

T cell；CDR3δ2; γδTCR; adoptive immune therapy; OT3; OT10

2014- 03- 08

2014- 04- 12

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA020901)

*通信作者(correspondingauthor)：mianyi333@163.com

1001-6325(2014)06-0746-07

R392.12

A