趙光華 馬紅芳 董小海 胡京枝

（河南省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，河南鄭州 450002）

志賀氏菌是一類具有高度傳染性的腸道致病菌，人類和靈長(zhǎng)類是其適宜宿主。但近年來(lái)，越來(lái)越多的動(dòng)物病理研究表明，志賀氏菌除感染人類引起痢疾之外，還能感染猴、犢牛、仔豬、雞、鴨等動(dòng)物，成為動(dòng)物的新發(fā)病原菌[1-2]。志賀氏菌極易產(chǎn)生耐藥性，并且能在養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)發(fā)生水平、垂直傳染，給養(yǎng)殖企業(yè)管理帶來(lái)很大困難，有時(shí)甚至?xí)斐芍卮蠼?jīng)濟(jì)損失。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、飼料工業(yè)的發(fā)展，動(dòng)物源性成分在飼料中的使用比例逐漸增高，由此帶來(lái)飼料受致病菌污染的風(fēng)險(xiǎn)逐漸增大。因此，飼料受志賀氏菌污染的風(fēng)險(xiǎn)也在迅速提高[3]。

生物技術(shù)的發(fā)展，帶動(dòng)了志賀氏菌的檢驗(yàn)技術(shù)也在不斷完善，目前已形成常規(guī)生化鑒定方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等三大類方法[4]。各類方法均有明顯的優(yōu)缺點(diǎn)，但生化鑒定方法是唯一的仲裁國(guó)標(biāo)方法，具有相當(dāng)高的鑒定準(zhǔn)確性，大多數(shù)的法定檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)都在使用該方法，但也存在一定的漏檢率，特別是菌相復(fù)雜、干擾菌比較多的情況下，漏檢率更高[5]，對(duì)養(yǎng)殖企業(yè)、飼料生產(chǎn)企業(yè)等帶來(lái)很多非常不利的影響，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究結(jié)合檢測(cè)工作實(shí)際，對(duì)國(guó)標(biāo)生化鑒定方法檢測(cè)飼料中志賀氏菌過(guò)程中存在的問(wèn)題進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，提出了很好的優(yōu)化方案，經(jīng)歷了實(shí)際工作的檢驗(yàn)，進(jìn)一步提高了飼料中志賀氏菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性，取得了良好的檢測(cè)效果。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

大腸埃希氏菌（Escherichia coli,CMCC44102）、志賀氏菌（Shigella,CMCC51571）、沙門氏菌（Salmonella,CMCC50071），中國(guó)藥品生物制品檢定所；腸道增菌肉湯、GN增菌液、志賀氏菌增菌液、XLD培養(yǎng)基、HE培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、沙門氏菌生化鑒定管、志賀氏菌生化鑒定管、大腸埃希氏菌生化鑒定管，青島海博生物工程公司。

全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（BIOLOG MicroStationTM）、GENⅢ細(xì)菌鑒定板（GEN III MicroPlateTM），美國(guó)BIOLOG公司。

電熱恒溫培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 增菌培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)

分別取沙門氏菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌斜面菌株各一接種環(huán)，接種于100 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，然后分別轉(zhuǎn)種于腸道增菌肉湯、GN增菌液、志賀氏菌增菌液中，接種量為一接種環(huán)，37℃培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)物在EMB平板上劃線分離，37℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。各隨機(jī)挑選10個(gè)菌落，用全自動(dòng)微生物鑒定儀并加血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，分析不同增菌培養(yǎng)基對(duì)志賀氏菌的增菌效果。

1.2.2 增菌時(shí)間及增菌條件的優(yōu)化試驗(yàn)

將沙門氏菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌營(yíng)養(yǎng)肉湯混合培養(yǎng)物分別接種于兩組1.2.1中對(duì)志賀氏菌增菌效果最好的增菌液中，接種量各一環(huán)，一組于37℃好氧條件下分別培養(yǎng)0.5、6、20，另一組于37℃厭氧條件下分別培養(yǎng)0.5、6、20。將兩種培養(yǎng)條件不同培養(yǎng)時(shí)間的增菌液分別于EMB平板上劃線分離，37℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。并隨機(jī)挑選10個(gè)菌落，用全自動(dòng)微生物鑒定儀并加血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，分析不同增菌培養(yǎng)基對(duì)志賀氏菌的增菌效果。

1.2.3 選擇性分離培養(yǎng)基的選擇

取1.2.1中的對(duì)志賀氏菌增菌效果最好的混合增菌液，分別于XLD、HE、SS、EMB培養(yǎng)基平板上劃線分離，37℃培養(yǎng)18 h,觀察菌落生長(zhǎng)情況，記錄志賀氏菌疑似菌落和雜菌菌落。挑選10個(gè)疑似菌落，用全自動(dòng)微生物鑒定儀并加血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定，分析不同分離培養(yǎng)基對(duì)志賀氏菌的選擇性分離效果。

1.2.4 生化試驗(yàn)

對(duì)1.2.3中XLD分離培養(yǎng)基上挑選的10株疑似志賀氏菌分別進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面純培養(yǎng)，分別用志賀氏菌生化鑒定管和GENⅢ細(xì)菌鑒定板進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)，結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果，分析兩種生化鑒定方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 由表1可知，選擇三種增菌液分別增菌6 h后，在EMB平板上分離驗(yàn)證，志賀氏菌增菌液在有沙門氏菌、大腸埃希氏菌干擾的情況下對(duì)志賀氏菌的選擇性增菌效果最好。隨機(jī)挑選的10株菌中，經(jīng)鑒定志賀氏菌有6株，占60%的比例，這是因?yàn)樵鼍褐刑砑恿诵律顾靥岣吡藢?duì)沙門氏菌的抑制作用，減少了沙門氏菌的干擾。腸道增菌液和GN增菌液在有沙門氏菌、大腸埃希氏菌干擾的情況下，對(duì)志賀氏菌的選擇性增菌效果不顯著，腸道增菌液中大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌均得到增殖，未體現(xiàn)出對(duì)志賀氏菌的選擇性，GN增菌液中沙門氏菌增殖效果較好，可能是沙門氏菌的優(yōu)勢(shì)增殖抑制了志賀氏菌的生長(zhǎng)。

表1 3種腸道增菌液對(duì)志賀氏菌增菌效果比較

2.2 由表2可知，志賀氏菌增菌液在不同增菌時(shí)間、不同增菌條件下對(duì)志賀氏菌的選擇性增菌效果差異明顯。試驗(yàn)結(jié)果顯示，37℃厭氧增菌條件下，不同增菌時(shí)間對(duì)志賀氏菌的增菌選擇性均比37℃好氧條件下的選擇性好，特別是存在沙門氏菌、大腸埃希氏菌干擾的情況下，這很符合飼料樣品中的菌相特征。因?yàn)橹举R氏菌、大腸埃希氏菌均為兼性厭氧，所以厭氧條件下抑制了沙門氏菌的快速增殖。在增菌時(shí)間上，增菌6 h時(shí)對(duì)志賀氏菌的選擇性最好，隨著增菌時(shí)間的延長(zhǎng)，選擇性又有降低的趨勢(shì)。

表2 志賀氏菌增菌液中不同增菌時(shí)間、不同增菌條件對(duì)志賀氏菌增菌效果比較（%）

2.3 XLD、HE、SS、EMB四種培養(yǎng)基中，均含有乳糖成分，抑菌劑、酸堿指示劑等略有不同，典型的志賀氏菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌均可形成典型菌落，具有較好的選擇性，但在檢測(cè)宋內(nèi)氏志賀氏菌時(shí)，因其乳糖發(fā)酵陽(yáng)性，與大腸埃希氏菌、乳糖遲緩陽(yáng)性的沙門氏菌在XLD、HE、SS、EMB四種培養(yǎng)基上具有相似的培養(yǎng)特性，選擇性較差。但在檢測(cè)實(shí)踐中，經(jīng)多次試驗(yàn)，仍然發(fā)現(xiàn)上述四種分離培養(yǎng)基對(duì)志賀氏菌的選擇性分離有明顯差異，結(jié)果見(jiàn)表3。從上述四種培養(yǎng)基中挑選出的各10株疑似志賀氏菌，經(jīng)后續(xù)鑒定，XLD培養(yǎng)基上鑒定志賀氏菌的準(zhǔn)確率最高，EMB培養(yǎng)基的準(zhǔn)確率最低，故可優(yōu)先選用XLD培養(yǎng)基。

2.4 志賀氏菌的生化反應(yīng)復(fù)雜，常規(guī)生化試驗(yàn)因人員影響、試劑影響等造成試驗(yàn)誤差較大，本試驗(yàn)選用美國(guó)BIOLOG全自動(dòng)微生物鑒定儀結(jié)合GENⅢ細(xì)菌鑒定板進(jìn)行自動(dòng)化生化鑒定試驗(yàn)，鑒定準(zhǔn)確率高，結(jié)果重現(xiàn)性好，克服了人員和試劑誤差，鑒定結(jié)果見(jiàn)表4。

從表4可以看出，不論是福氏志賀氏菌還是生化反應(yīng)明顯不同的宋內(nèi)氏志賀氏菌，BIOLOG全自動(dòng)微生物鑒定儀結(jié)合GENⅢ細(xì)菌鑒定板均能準(zhǔn)確鑒定出結(jié)果，鑒定結(jié)果的可信性高達(dá)100%，并且在18～48 h的培養(yǎng) 時(shí)間內(nèi)，鑒定結(jié)果非常穩(wěn)定。

表3 不同選擇性培養(yǎng)基對(duì)志賀氏菌的分離效果比較

表4 BIOLOG全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)志賀氏菌的鑒定結(jié)果

3 討論

3.1 本試驗(yàn)是利用陽(yáng)性菌株添加的方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，樣品菌相明確。在實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中，樣品菌相復(fù)雜，但沙門氏菌、大腸埃希氏菌是最主要的干擾菌，與本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的干擾因素是一致的。在對(duì)疑似菌落進(jìn)行確證試驗(yàn)時(shí)，陽(yáng)性率比本試驗(yàn)結(jié)果偏低，因此在分離平板上挑選可疑菌落時(shí)，應(yīng)增大挑選可疑菌落的數(shù)量，特別是存在沙門氏菌、大腸埃希氏菌干擾的情況下，以免發(fā)生漏檢。

3.2 通過(guò)本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，增菌過(guò)程對(duì)志賀氏菌的檢測(cè)準(zhǔn)確性影響很大，因?yàn)樯抽T氏菌、大腸埃希氏菌的優(yōu)勢(shì)增長(zhǎng)，可能對(duì)志賀氏菌的增長(zhǎng)產(chǎn)生很強(qiáng)的抑制作用，造成后期選擇性分離或TSI試驗(yàn)時(shí)，挑選不出可疑菌落，造成漏檢。因此，志賀氏菌的增菌條件、增菌培養(yǎng)基選擇、增菌時(shí)間等應(yīng)嚴(yán)格控制。

3.3 在檢測(cè)宋內(nèi)志賀氏菌（D群）時(shí)，因宋內(nèi)志賀氏菌與大腸埃希氏菌、類志賀鄰單胞菌等極為相似，生化反應(yīng)與A、B、C群也有很大區(qū)別，極易造成漏檢。可用沙門氏菌顯色平板和EMB平板進(jìn)行分離，沙門氏菌顯色平板上藍(lán)色菌落而EMB平板上無(wú)色菌落則可視為宋內(nèi)志賀氏菌可疑菌落，再進(jìn)行生化及血清學(xué)鑒定，此方法不易漏檢。

3.4 沙門氏菌屬和部分志賀氏菌屬均能代謝利用甘露醇，因而在GN增菌液中均能快速增殖，要特別注意志賀氏菌屬與不產(chǎn)硫化氫的沙門氏菌和變形桿菌的區(qū)別。由于都不發(fā)酵乳糖或遲緩發(fā)酵乳糖，它們?cè)赬LD、HE、SS、EMB培養(yǎng)基平板上都有相似的菌落特征，大都為無(wú)色半透明菌落，容易漏檢或錯(cuò)判?？梢赃x用沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基結(jié)合TSI生化試驗(yàn)來(lái)加以鑒別。

3.5 志賀氏菌屬?zèng)]有動(dòng)力，沒(méi)有鞭毛抗原，主要是菌體（O）抗原，個(gè)別志賀氏菌有K抗原，并且極個(gè)別志賀氏菌會(huì)發(fā)生自凝集反應(yīng)。某些不活潑的大腸埃希氏菌、A-D菌也能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集反應(yīng)。志賀氏菌屬又分A、B、C、D四個(gè)群抗原，因此志賀氏菌屬的血清學(xué)反應(yīng)復(fù)雜，又有一定的不確定性，可對(duì)志賀氏菌血清學(xué)鑒定優(yōu)化如下∶分別選用1.5%瓊脂培養(yǎng)物和100℃煮沸20 min濃菌液作玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)用生理鹽水作對(duì)照自凝試驗(yàn)，若均不凝，則可直接判斷為陰性。若凝聚，則可按B、D、A、C群的順序進(jìn)行群多價(jià)血清凝集試驗(yàn)，陽(yáng)性菌株至少與其中一群多價(jià)血清發(fā)生凝集。

4 小結(jié)

綜上所述，選用志賀氏菌增菌液在37℃厭氧條件下培養(yǎng)6 h增菌，再用XLD、EMB培養(yǎng)基等分離培養(yǎng)，以B、D、A、C群的順序進(jìn)行群多價(jià)血清凝集試驗(yàn)，最后結(jié)合全自動(dòng)微生物鑒定，能顯著提高飼料中志賀氏菌檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，有效減少雜菌干擾，降低漏檢率。

（參考文獻(xiàn)若干篇，刊略，需者可函索）