盧福芝 覃巧艷 黃燕紅 黃蘭清

（河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西宜州 546300）

淀粉酶屬于水解酶類，是催化淀粉、糖元和糊精中糖苷鍵的一類酶的統(tǒng)稱。淀粉酶是最早用于工業(yè)化生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類繁多，特點(diǎn)各異，可應(yīng)用于造紙[1]、印染[2-3]、釀造[4-7]、果汁和食品加工[8-12]、醫(yī)藥、洗滌劑[13]、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑[14-17]等多種領(lǐng)域。在釀造發(fā)酵工業(yè)、如酒精生產(chǎn)、啤酒制造、發(fā)酵原料液化及糖化工藝過程中均有重要價(jià)值，如添加α-高溫淀粉酶可提高啤酒質(zhì)量，中溫蒸煮條件下添加適當(dāng)耐高溫α-淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精質(zhì)量，同時(shí)可提高設(shè)備利用率等[4-6]。

生淀粉酶是能夠直接水解不經(jīng)過蒸煮糊化的生淀粉顆粒的一類酶[18]。包括α-淀粉酶（α-amylase,EC3.2.1.1）、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等酶類中能與生淀粉相互作用的成分，其中尤以α-淀粉酶最為常用[19-21]。α-淀粉酶廣泛分布于動(dòng)物（唾液、胰臟等）、植物（麥芽、山萮菜）及微生物中[22-23]。

近年來，石油的價(jià)格不斷增長(zhǎng)，尋求一種高效的、可再生的能源來取代石油這一高耗費(fèi)的能源，成為各國(guó)政府和實(shí)驗(yàn)室研究的熱點(diǎn)。而現(xiàn)在大力發(fā)展發(fā)酵燃料乙醇也是各個(gè)國(guó)家的技術(shù)重點(diǎn)，例如利用木薯及馬鈴薯淀粉等來生產(chǎn)燃料乙醇。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國(guó)的石油缺口越來越大。推廣使用燃料乙醇不僅能夠緩解石油緊缺的情況，而且能夠有效地解決木薯、稻谷等農(nóng)作物的生物轉(zhuǎn)換，推進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的良性循環(huán)[24]。廣西盛產(chǎn)木薯，木薯中淀粉含量高且利用效率高[25]，鑒于生淀粉的水解速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于糊化淀粉[24]，若能研究并充分利用生淀粉酶的性質(zhì)，將為社會(huì)帶來巨大的科研和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料來源

廣西宜州市矮山大米廠附近采集的土壤樣品。

1.2 主要試劑

木薯粉、大米粉、玉米粉為市售物品，其余試劑為生化分析純。

1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

富集及分離培養(yǎng)基（g/l）蛋白胨10、牛肉膏3、NaCl 5、生淀粉10。LB培養(yǎng)基（g/l）：蛋白胨10、酵母浸提物5、NaCl 10、pH值7.0，配置固體培養(yǎng)基時(shí)，需要加入2%瓊脂。種子培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖8、蔗糖8、蛋白胨15、酵母膏3、K2HPO42、MgSO4·7H2O 0.6，pH值自然。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/l）：蛋白胨 15、酵母膏 3、K2HPO42、MgSO4·7H2O 0.6，木薯生粉1%。其中木薯生粉過80目篩，160℃干熱滅菌2 h，其余成分用濕熱滅菌115 MPa，121 ℃、20 min。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株的分離篩選

2.1.1 初篩

稱取1 g土壤樣品于三角瓶中，加入10 ml的無菌水中攪拌均勻靜置，取1 ml上清液至100 ml富集培養(yǎng)基中，35℃、200 r/min進(jìn)行富集培養(yǎng)2～3 d。取富集培養(yǎng)后的菌液在無菌的條件下，用無菌水進(jìn)行濃度梯度稀釋，取稀釋度10-5、10-6、10-7菌液各150 μl涂布于分離培養(yǎng)基平板上，35℃下恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。

2.1.2 復(fù)篩

將初篩中透明圈與菌落直徑比值較大的菌株接種于5 ml種子培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的菌液進(jìn)行濃度梯度稀釋后涂平板，35℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，待長(zhǎng)出有透明圈的單菌落后，選取透明圈與菌落直徑比值最大的菌株進(jìn)行劃線分離，至獲得純培養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)菌株，并進(jìn)行菌種保藏。

2.2 酶活力測(cè)定

2.2.1 生淀粉酶活力的測(cè)定[24]

DNS溶液的配置：稱取3，5-二硝基水楊酸6.5 g，加入少量蒸餾水溶解后，加入2 mol/l NaOH溶液260 ml，再加入到含有185 g酒石酸鉀鈉的溶液中，最后加入2.5 g無水亞硝酸鈉和2.5 g結(jié)晶酚，充分溶解后，定容至1 000 ml，裝于棕色瓶中，室溫放置一星期后使用。

用0.2 M Na2HPO4、0.1 M檸檬酸緩沖液（pH值7.0）配制1%的木薯生淀粉懸液為底物。先加入4 ml底物，50℃預(yù)熱10 min后，再加入l ml酶液，在恒溫振蕩器中50℃、180 r/min反應(yīng)30 min后，加入0.5 ml 4%的NaOH溶液終止反應(yīng)。取適當(dāng)體積的反應(yīng)液于12 000 r/min離心10 min，上清液用DNS法測(cè)定還原糖的量。

酶活力單位的定義：上述分析的測(cè)定條件下，l min水解木薯生淀粉產(chǎn)生1 μg還原糖（以葡萄糖計(jì)）所需的酶量。

2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

將分析純的葡萄糖在干燥箱中105℃下干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取100 mg于燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入l00 ml容量瓶中用蒸餾水定容至l00 ml，即配制成濃度為1 mg/ml的葡萄糖糖標(biāo)準(zhǔn)液。

2.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

取11支試管，按照表1加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制出不同濃度的葡萄糖溶液，然后向各試管中加入4 000 μl DNS溶液，充分搖勻，沸水5 min，立即用冷水冷卻至室溫，以1號(hào)管作為空白對(duì)照，在540 nm測(cè)定光密度[24]。以光密度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

2.4 發(fā)酵產(chǎn)酶條件的研究[26]

2.4.1 不同底物對(duì)產(chǎn)酶的影響

取活化后目的菌株，分別以1%大米粉、1%木薯粉、1%玉米粉作為唯一碳源，35℃、200 r/min進(jìn)行發(fā)酵，4 d后將培養(yǎng)液離心，測(cè)定上清液酶活，以確定最佳碳源。

2.4.2 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

將活化后的目的菌株，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在25、30、35、40 ℃，200 r/min進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)4 d后離心取上清液，測(cè)定其酶活，以確定最佳發(fā)酵溫度。

2.4.3 接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

將目的菌株進(jìn)行活化后，分別以3%、5%、8%的接種量進(jìn)行35℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)，分別測(cè)定2、3、4、5、6 d發(fā)酵上清液的酶活力。

2.5 酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.5.1 溫度對(duì)酶活力的影響

以0.2 M Na2HPO4、0.1 M檸檬酸緩沖液（pH值7.0）配置的1%木薯生淀粉溶液為底物，在30、40、45、50、60℃下反應(yīng)30 min后分別測(cè)定生淀粉酶活力，確定該酶的最適反應(yīng)溫度。以最高酶活為100%，其余酶活與之相比計(jì)算相對(duì)酶活。

為確定該酶的熱穩(wěn)定性，將酶液在不同的溫度下放置30 min后冰浴冷卻，測(cè)定酶活力，以未保溫的酶活力為100%。

2.5.2 pH值對(duì)酶活力的影響

將pH值分別為4、5、6、7、8的0.2 M Na2HPO4、0.1 M檸檬酸緩沖液配置的1%木薯生淀粉溶液為底物，與酶液反應(yīng)30 min后測(cè)定酶活力。以最高酶活力為100%，其余酶活力與之相比計(jì)算相對(duì)酶活力。

為確定該酶的pH值穩(wěn)定性，室溫下把酶液分別放置在pH值為4、5、6、7、8的緩沖液30 min后測(cè)定酶活力，以未保溫的酶活力為100%。

2.5.3 離子與酶活力

分別在試管中加入終濃度為5 mM Zn2+、Cu2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+、Ni2+、Mn2+、Co2+離子，與酶液混合室溫放置1 h后測(cè)生淀粉酶活力。以未加離子條件下測(cè)定的酶活力為100%，其余酶活力與之相比計(jì)算相對(duì)酶活力，測(cè)定離子對(duì)酶活力的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株篩選

通過對(duì)采集樣品進(jìn)行多次富集培養(yǎng)，初篩及復(fù)篩后分離出一株產(chǎn)生淀粉酶活力較高的菌株，其在篩選平板上的生長(zhǎng)情況如圖2所示。

3.2 產(chǎn)酶條件的研究

3.2.1 不同底物對(duì)產(chǎn)酶的影響

分別以1%大米粉、1%木薯粉、1%玉米粉作為唯一碳源35℃、200 r/min進(jìn)行發(fā)酵測(cè)定上清液酶活力，結(jié)果如表2。由表2可知，以1%木薯粉作為底物效果較好，產(chǎn)酶活力最高。

3.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

將目的菌株分別在不同溫度200 r/min條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)4 d后離心取上清液，測(cè)定結(jié)果如圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在35℃下培養(yǎng)效果最好。超過35℃后，酶活力迅速下降。

3.2.3 接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

將目的菌株進(jìn)行活化，分別取3%、5%、8%的接種量進(jìn)行35 ℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)，分別測(cè)定2、3、4、5、6 d的發(fā)酵上清液的酶活。結(jié)果如圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以接種量為8%并發(fā)酵4 d的效果較好，酶活力最高。

表2 底物對(duì)產(chǎn)酶的影響

3.3 酶學(xué)性質(zhì)的研究

3.3.1 最適溫度與穩(wěn)定性

分別在30、40、50、60℃下測(cè)定生淀粉酶的酶活力，結(jié)果如圖5所示，該酶的最適溫度為50℃。

生淀粉酶酶液在30、40、50、60 ℃保溫30 min后測(cè)定剩余酶活力，結(jié)果如圖6所示，在溫度30℃至50℃時(shí)，剩余酶活力保持在80%以上，即在此范圍時(shí)酶是穩(wěn)定的，而當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，酶活力迅速下降。

3.3.2 最適pH值與穩(wěn)定性

分別用pH值4.0至8.0的緩沖液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的木薯生淀粉底物，測(cè)定菌株生淀粉酶酶活力，結(jié)果如圖7所示。由圖可知該酶的最適pH值7.0。當(dāng)pH值大于7時(shí)，酶活力迅速下降。

室溫下將酶液在不同pH值緩沖液中放置30 min后測(cè)定剩余酶活力。結(jié)果如圖8所示。由圖可知在pH值6至8時(shí)，該酶有80%以上的剩余酶活力，表明其在該范圍內(nèi)較穩(wěn)定。

3.3.3 離子對(duì)酶活力的影響

將終濃度為5 mmol/l的金屬離子與酶液作用l h后，測(cè)定相對(duì)酶活力，以未加離子條件下測(cè)定的酶活力為100%，結(jié)果如圖9。由圖9可知，Ca2+、Mg2+對(duì)該酶具有一定的激活作用，其中Ca2+的激活效果較強(qiáng)；金屬離子Zn2+、Ni2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Co2+對(duì)該酶具有抑制作用，其中Cu2+、Fe2+、Mn2+抑制作用較強(qiáng)。

4 結(jié) 論

從宜州市大米廠附近采集的樣品中，篩選出一株水解生淀粉能力較強(qiáng)的芽孢桿菌，測(cè)定其發(fā)酵后粗酶液的酶活達(dá)92 U/ml，該酶最適pH值為7.0，最適溫度為50℃。金屬離子Ca2+、Mg2+對(duì)酶有激活作用，金屬離子Zn2+、Ni2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Co2+對(duì)酶有不同程度的抑制作用。生淀粉酶可以將傳統(tǒng)工藝中淀粉糊化、液化、糖化合并為一步進(jìn)行，有效縮減了生產(chǎn)成本[27]。目前生產(chǎn)中應(yīng)用的生淀粉酶主要來自于真菌，且由于各種條的件限制，尚未得以廣泛應(yīng)用[18]。本文篩選的芽孢桿菌產(chǎn)生的生淀粉酶具較好的熱穩(wěn)定性和較寬pH范圍，因而有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。后期研究中將利用基因工程等手段對(duì)該菌株進(jìn)行改造，進(jìn)一步提高產(chǎn)酶能力及優(yōu)化其酶學(xué)特性。