牛衛(wèi)東 戴蕾 史軍

自2013年2月起，我國上海和安徽等地先后出現(xiàn)不明原因重癥肺炎病例，之后被確診為人感染H7N9禽流感。此前報(bào)道的可感染人的禽流感病毒亞型為H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3[1-3]。H7N9 亞 型 主要在野生鳥類中間傳播，在此之前無人感染病例。甲型流感病毒可以通過基因重組而改變其抗原性，人類歷史上幾次流感大流行的病毒株都是通過人類季節(jié)性流感病毒和動(dòng)物流感病毒的基因重組而來[4-5]。人感染H7N9禽流感病毒為新型重配病毒，其內(nèi)部基因來自于H9N2禽流感病毒[2]。人感染H7N9禽流感是由H7N9亞型禽流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，是一種新型呼吸道傳染病。本文對鄭州市首例人感染H7N9禽流感病例的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法和過程進(jìn)行了總結(jié)和分析，旨在進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室對該類病例的應(yīng)急檢測能力，這對相關(guān)病例的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早隔離、早治療，防止疫情擴(kuò)散，降低病死率具有十分重要意義。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 患者王某，男，38歲，漢族，農(nóng)民，從事活禽宰殺銷售工作?；颊咦允?月8日出現(xiàn)畏寒、咽痛，自行服藥治療，病情未見好轉(zhuǎn)，于4月11日上午前往鄉(xiāng)衛(wèi)生院就診，初步診斷為“左下葉肺炎”。下午患者自行到鄭州市某市級醫(yī)院急診科就診，CT診斷報(bào)告為：左肺下葉炎癥。患者以“肺炎”轉(zhuǎn)至省傳染病醫(yī)院隔離排查。當(dāng)晚，鄭州市疾控中心實(shí)驗(yàn)室采集患者的鼻咽拭子樣本進(jìn)行Real-time RT-PCR檢測，檢驗(yàn)結(jié)果顯示患者H7N9禽流感病毒核酸陰性，鑒于患者為禽類接觸的高危人群，疾控機(jī)構(gòu)持續(xù)關(guān)注患者病情變化。4月16日，省傳染病醫(yī)院報(bào)告該患者病情出現(xiàn)進(jìn)行性加重，故市疾控中心再次采集患者鼻咽拭子和下呼吸道分泌物標(biāo)本進(jìn)行檢測，4月17日初步檢測結(jié)果為H7N9禽流感病毒核酸陽性。4月18日，省疾控中心復(fù)核檢測陽性。經(jīng)省級專家組會診，判定為人感染H7N9禽流感病例。

1.2 檢測試劑與儀器 病毒核酸提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；甲乙型流感、季節(jié)性流感（包括H1N1、H3N2）、甲型H1N1流感和H5N1高致病性禽流感病毒RNA檢測試劑盒（熒光PCR法）均購自北京金豪制藥股份有限公司；人感染H7N9禽流感病毒RNA檢測使用的AM1005試劑盒（熒光PCR法）購自ABI公司；人感染H7N9禽流感特異性引物和探針由國家疾控中心下發(fā)；采用Real-time RT-PCR方法，運(yùn)用Bio-Rad CFX96和Bio-Rad IQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行流感病毒核酸檢測[6]。

1.3 引物和探針 由國家疾控中心下發(fā)的人感染H7N9禽流感特異性引物和探針序列見表1。

表1 人感染H7N9禽流感特異性引物和探針序列

1.4 檢驗(yàn)方法與步驟

1.4.1 核酸提取 吸取5.6 μL Carrier RNA至含560 μL AVL的Eppendorf離心管中，吹打混勻。加200 μL標(biāo)本到上述離心管中，吹打混勻，安全柜內(nèi)孵育10 min。加560 μL無水乙醇（96%～100%）到離心管中，吹打混勻。吸取660 μL溶液至Rnase-free吸附柱CR2中，蓋上離心管帽，7000 rpm離心1 min棄掉套管。重復(fù)一次。加500 μL緩沖液GD，蓋上離心管帽，7000 rpm離心1 min，棄掉套管。加500 μL漂洗液RW，蓋上離心管帽，11 000 rpm離心3 min，棄掉套管。將吸附柱放入一個(gè)新的1.5 mL無RNA酶離心管中，打開吸附柱蓋子，放置3 min，使吸附膜完全變干，加入70 μL Rnase－free ddH2O，蓋上蓋子，孵育5 min，7000 rpm離心1 min，收集病毒RNA模板。

1.4.2 Real-time RT-PCR 人感染H7N9禽流感檢測使用ABI公司的AM1005試劑盒進(jìn)行體系配制，反應(yīng)總體積為25 μL，組分構(gòu)成見表2。

表2 人感染H7N9禽流感擴(kuò)增體系組分構(gòu)成

將上述反應(yīng)液混勻，分裝每管20 μL，將5 μL模板加入分裝好的PCR小管，分別做好標(biāo)記。同時(shí)分別以DEPCH2O和RNA陽性模板作為陰性和陽性對照。使用Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行病毒核酸檢測，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃10 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40 個(gè)循環(huán)。

甲乙型流感、季節(jié)性流感（包括H1N1、H3N2）、甲型H1N1流感和H5N1高致病性禽流感檢測分別使用北京金豪公司的系列試劑盒進(jìn)行體系配制，反應(yīng)總體積均為25 μL，組分構(gòu)成見表3。

表3 甲乙型流感、季節(jié)性流感（包括H1N1、H3N2）、甲型H1N1流感和H5N1高致病性禽流感擴(kuò)增體系組分構(gòu)成

將上述反應(yīng)液混勻，分裝每管20 μL，加入5 μL模板，分別做好標(biāo)記。同時(shí)分別以DEPCH2O和RNA陽性模板作為陰性和陽性對照。使用Bio-Rad IQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行病毒核酸檢測，反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃ 30 min，95 ℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，50 ℃30 s，72 ℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 本疾控中心檢測結(jié)果 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，甲型流感通用引物、H7和N9特異性引物的擴(kuò)增結(jié)果均為陽性，其中H7和N9特異性引物的擴(kuò)增結(jié)果結(jié)果見圖1。

2.2 省疾控中心和國家疾控中心復(fù)核檢測結(jié)果 按照《人感染H7N9禽流感疫情防控方案》要求，鄭州市疾控中心將初步檢測呈陽性的樣本送至河南省疾控中心和國家疾控中心進(jìn)行復(fù)核檢測，結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果一致，證實(shí)該病例樣本人感染H7N9禽流感病毒核酸陽性。

3 討論

圖1 H7、N9的Real-time RT-PCR擴(kuò)增曲線

自2013年2月份以來，人感染H7N9禽流感疫情已波及我國多個(gè)省份，病例數(shù)持續(xù)增加，但截至目前病例分布仍呈現(xiàn)高度散發(fā)的特點(diǎn)，尚無人傳人的確切證據(jù)[7-9]。傳染源目前尚不明確，推測可能為攜帶H7N9禽流感病毒的禽類及其分泌物或排泄物。根據(jù)現(xiàn)已掌握的流行病學(xué)資料，患者多為從事禽類養(yǎng)殖、銷售、宰殺、加工業(yè)者，以及在發(fā)病前1周內(nèi)接觸過禽類者[10-11]。鄭州市首例人感染H7N9禽流感患者王某正是從事活禽宰殺銷售工作的，發(fā)病前與禽類有明確的接觸史。

甲型流感病毒血清型較多，發(fā)病初期的臨床癥狀又較為相似，這為病例的臨床鑒別診斷帶來了較高的難度。人感染H7N9禽流感重癥患者預(yù)后差。重癥患者病情發(fā)展一般十分迅速，表現(xiàn)為重癥肺炎，體溫39 ℃以上，常發(fā)生呼吸困難；病情進(jìn)一步惡化出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征、休克及急性腎損傷等，病死率較高[2-3]。因此，實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確、高效的診斷技術(shù)，對于疑似病例的早診斷、早治療，減輕患者的病痛，挽救患者的生命具有重要意義。目前最準(zhǔn)確的診斷方法就是從患者呼吸道分泌物標(biāo)本中分離出H7N9禽流感病毒或H7N9禽流感病毒核酸檢測陽性[12-14]。Real-time RT-PCR檢測流感病毒核酸，方法成熟、敏感度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，是目前實(shí)驗(yàn)室首選的快速檢測方法[15]。

流感樣病例標(biāo)本采集質(zhì)量的好壞是實(shí)驗(yàn)室能否得到客觀、準(zhǔn)確診斷結(jié)論的前提和基礎(chǔ)，臨床上對此應(yīng)該給予高度重視。在本次人感染H7N9禽流感病例的首次實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本采集和檢驗(yàn)中，檢測結(jié)果為陰性。在幾天之后的二次標(biāo)本采集和檢驗(yàn)中，檢測結(jié)果又為陽性。在兩次病例標(biāo)本的采集和檢驗(yàn)過程中，相同點(diǎn)是均是使用同批次的病毒采樣管和檢驗(yàn)試劑、同樣的儀器設(shè)備和檢驗(yàn)方法；不同點(diǎn)是兩次標(biāo)本采集的采樣人員不同，所采集標(biāo)本的種類亦不相同，同時(shí)患者的病情也在不斷地發(fā)展變化過程之中。筆者分析造成兩次實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果不一致的原因大概有兩種可能：一是第一次檢測的標(biāo)本采集質(zhì)量不過關(guān)。流感樣病例標(biāo)本的采集首先應(yīng)選用合格的病毒采樣管和聚丙烯纖維頭拭子進(jìn)行采樣。其次，采樣部位要準(zhǔn)確。咽拭子應(yīng)采集患者的懸雍垂后咽后壁及雙側(cè)扁桃體，應(yīng)盡量避免接觸舌頭、口腔內(nèi)壁等含菌較高的部位。鼻拭子應(yīng)深入鼻鄂部采集。最后應(yīng)注意的是，采樣要有一定的力度，盡可能的多采集一些標(biāo)本。在第一次標(biāo)本采集過程中，有可能是在采樣部位上掌握的不夠準(zhǔn)確，或是采樣力度不夠造成了標(biāo)本采集質(zhì)量不過關(guān)。二是第二次檢測的標(biāo)本更具有典型性。第二次標(biāo)本采集除了采集了患者的鼻、咽拭子外，醫(yī)院方面還使用專用設(shè)備采集了患者的下呼吸道分泌物，這更加符合人感染H7N9禽流感病例標(biāo)本的要求，提高了病毒檢測的陽性率。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)做好相關(guān)檢驗(yàn)技術(shù)和物資的貯備，建立健全應(yīng)急檢驗(yàn)工作預(yù)案，做到有條不紊地應(yīng)對流感疫情等突發(fā)公共衛(wèi)生事件。本文詳細(xì)介紹了鄭州市首例人感染H7N9禽流感病例的實(shí)驗(yàn)室檢測方法和過程，旨在進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測能力，為流感疫情的防控提供及時(shí)可靠的診斷依據(jù)。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部.流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

[2]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會.人感染H7N9禽流感診療方案（2013年第3版）[S].國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會辦公廳，2013.

[3]Gao R，Cao B，Hu Y.Human infection with a novel avian-origin influenza A （H7N9） virus[J].New England Journal of Medicine，2013，32（20）：1888-1897.

[4]余宏杰，陳裕旭，舒躍龍.中國大陸首例人感染禽流感病毒（H5N1）的調(diào)查與確認(rèn)[J].中華流行病學(xué)雜志，2006，25（4）：281-287.

[5]郭潮潭.人感染H7亞型禽流感流行狀況和H7N9亞型禽流感的生物學(xué)特性[J].國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志，2013，39（2）：75-79.

[6]張?zhí)m榮，趙鳳玲，羅宇馨.應(yīng)用3種流感病毒檢測方法檢測流感樣病例病原結(jié)果及分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，19（5）：1079-1085.

[7]Li Q，Zhou L，Zhou M.Preliminary report：epidemiology of the avian influenza A （H7N9） outbreak in China[J/OL].New England Journal of Medicine，2013，185（1）：15-19.

[8]Gao H N，Lu H Z，Cao B.Clinical findings in 111 cases of influenza A （H7N9） virus infection[J].New England Journal of Medicine，2013，185（24）：2277-2285.

[9]Zhuang Q Y，Wang S C，Wu M L.Epidemiological and risk analysis of the H7N9 subtype influenza outbreak in China at its early stage[J/OL].Chinese Science Bulletin，2013，63（16）：E1.

[10]Xu C，Havers F，Wang L.Monitoring avian influenza A（H7N9）virus through national influenza-like illness surveillance，China[J/OL].Emerging Infectious Diseases，2013，18（8）：El.

[11]Chen Y，Liang W F，Yang S.Human infections with the emerging avian influenza A H7N9 virus from wet market poultry：clinical analysis and characterization of viral genome[J].The Lancet，2013，S0140-6736（13）：60903-60904.

[12]Chang S Y，Lin P H，Tsai J C.The first case of H7N9 influenza in Taiwan[J].The Lancet，2013，S0140-6736（9878）：1621.

[13]Liu D，Shi W F，Shi Y.Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9 viruses causing human infection：phylogenetic structural，and coalescent analyses[J].The Lancet，2013，38（19881）：60 938-60 939.

[14]Kageyama T，F(xiàn)ujisaki S，Takashita E，et al.Genetic analysis of novel avian A（ H7N9） influenza viruses isolated from patients in China， February to April 2013[J].Euro Surveill，2013，1（815）：7-21.

[15]WHO.Real-time RT PCR（ rRT-PCR） Protocol for the Detection of Avian Influenza （AH7N9）Virus[EB/OL].[2013-04-08]http：//www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/cnic_realtime_rt_pcr_protocol_a_h7n9.pdf，2013.