張瑞麗 王千秋

·論著·

梅毒螺旋體膜蛋白Tpp47對血管內皮細胞黏附功能影響的實驗研究

張瑞麗 王千秋

目的探討梅毒螺旋體膜蛋白Tpp47對血管內皮細胞的作用。方法利用基因工程技術重組合成的梅毒螺旋體膜蛋白Tpp47及脂多糖分別刺激人臍靜脈內皮細胞(HUVEC),ELISA檢測上清中細胞間黏附分子1(ICAM-1)及E選擇素的水平;熒光定量PCR檢測HUVEC中ICAM-1及E選擇素mRNA的轉錄水平;MTT法檢測HUVEC增殖水平;將重組蛋白Tpp47及脂多糖預處理的HUVEC與鈣黃綠素AM標記的THP-1細胞共培養(yǎng),熒光倒置顯微鏡下觀察HUVEC與THP-1細胞的黏附情況。結果梅毒螺旋體膜重組蛋白Tpp47刺激HUVEC后,其分泌的黏附分子ICAM-1(1.28±0.03)及E選擇素(0.51±0.01)水平顯著提高,與空白對照組(0.90±0.01與0.13±0.03)比較,差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為18.28和18.19,均P＜0.05);將重組蛋白Tpp47刺激24 h后的HUVEC與THP-1細胞共培養(yǎng),HUVEC與THP-1細胞的黏附率為56.1%±1.9%,較空白對照組(16.3%±2.1%)明顯提高,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.65,P＜0.05)。MTT試驗結果顯示,重組蛋白Tpp47刺激HUVEC后,其增殖率(19.5%±1.7%)高于空白對照組(10.0%±3.1%),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.92,P＜0.05);較脂多糖低(41.2% ±3.7%),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.42,P＜0.05)。結論梅毒螺旋體膜重組蛋白Tpp47可體外上調HUVEC與THP-1的黏附能力及促進HUVEC增殖,可能在梅毒的發(fā)病中起一定作用。

密螺旋體,蒼白;細胞黏附分子;E選擇素;Tpp47;人臍靜脈內皮細胞;THP-1細胞

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)所致的性傳播疾病。目前梅毒在世界范圍內傳播,已成為危害人類健康的公共衛(wèi)生問題。而Tp與HIV的協(xié)同作用使艾滋病的發(fā)病機制研究及治療措施更加復雜[1-2],亦致梅毒發(fā)病機制的研究再次成為研究熱點。Tp至今未能在體外培養(yǎng)成功,阻礙了梅毒發(fā)病機制的深入研究。Tp膜蛋白是螺旋體早期與機體黏附及誘導機體免疫的主要靶點,也是研究梅毒致病機制及機體免疫反應的重要對象[3]。多項研究顯示,Tp侵襲血管內皮細胞,可以促進內皮細胞活化,釋放炎癥介質和炎癥細胞的趨化,導致內皮細胞腫脹及局部炎癥反應的發(fā)生[4-6]。Tp膜蛋白Tpp47是螺旋體的主要抗原成分,在激活單核/巨噬細胞中起著關鍵作用[7]。本課題以人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)為實驗細胞,觀察重組合成的膜蛋白Tpp47對HUVEC黏附功能的影響,研究膜蛋白Tpp47在血管內皮細胞活化中的作用。

材料與方法

一、試劑和儀器

1.主要試劑：原代培養(yǎng)的HUVEC由第三軍醫(yī)大學全軍胸外中心贈送,THP-1細胞株(單核巨噬細胞)為本實驗室保存,重組蛋白Tpp47由深圳市菲鵬生物股份有限公司贈送,已去除內毒素,純度＞90%,DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、EDTA-胰酶消化液及Hyclone胎牛血清(FBS)為美國Gibco公司產(chǎn)品,熒光染料鈣黃綠素AM(Calcein AM)、脂多糖、MTT為美國Sigma公司產(chǎn)品,細胞間黏附分子1(ICAM-1)及E選擇素的ELISA檢測試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒為美國BBI公司產(chǎn)品,Trizol試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品,SybrGreen PCR Master Mix Kit為美國ABI公司產(chǎn)品。

2.主要儀器：熒光顯微鏡及EX70倒置顯微鏡產(chǎn)自日本Olympus公司,分光光度儀產(chǎn)自美國Beckman Coulter公司,高速離心機及多功能酶標儀產(chǎn)自美國Thermo Scientific公司,ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀產(chǎn)自美國ABI公司。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：HUVEC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含0.05%青霉素-鏈霉素雙抗),THP-1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(含0.05%青霉素-鏈霉素雙抗),均置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),選取狀態(tài)良好的細胞進行實驗。

2.重組蛋白Tpp47刺激HUVEC：將5×104個HUVEC接種于96孔細胞培養(yǎng)板,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,換新鮮培養(yǎng)基(不含青霉素-鏈霉素雙抗),分組分別加入重組蛋白Tpp47或脂多糖,使終濃度分別為 50、100、200、400、800 μg/L, 以不加重組蛋白Tpp47或脂多糖的孔做為空白對照,每次設3個復孔,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)3、6、12、24、48 h。取培養(yǎng)上清液,-20℃凍存。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞3次,胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞,加入細胞凍存液,-80℃凍存。

3.細胞因子分泌水平檢測：ELISA檢測試劑盒檢測重組蛋白Tpp47或脂多糖刺激HUVEC后培養(yǎng)上清液中的黏附分子ICAM-1及E選擇素的水平。具體步驟按ELISA檢測試劑盒說明書操作。

4.實時熒光定量PCR法檢測細胞因子轉錄水平：提取各組HUVEC總RNA,電泳檢測提取的RNA,將RNA置-20℃保存?zhèn)溆?按cDNA合成試劑盒合成第一鏈,將標本置-20℃保存。引物序列采用Primer Premier 5.0軟件設計,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下：GAPDH正向：5′-TGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′,反向：5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′, 擴增后目標片段長度為126 bp。ICAM-1正向：5′-GGTAGCAG CCGCAGTCATAAT-3′,反向：5′-GGCTTGTGTGTTC GGTTTCAT-3′, 擴增后目標片段長度為130 bp。E選擇素正向：5′-TCTGGGGAACTAGAGGGATACA-3′,反向：5′-TCTATTGAAGTGGTGATGGGTGT-3′,擴增后目標片段長度為131 bp。熒光定量PCR：GAPDH作為內參照,PCR反應體系：ddH2O 7 μl,2×Sybr Mix 10 μl,上下游引物各 1 μl,標本 cDNA 模板 1 μl。反應條件為：95℃2 min;95℃10 s,60℃15 s,72℃30 s,40個循環(huán);72 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s。取 10 μl擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。

5.HUVEC與THP-1細胞的黏附實驗：將5×104個HUVEC接種于96孔細胞培養(yǎng)板上,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,換新鮮培養(yǎng)基,分別加入重組蛋白Tpp47或脂多糖,使終濃度分別為400 μg/L和200 μg/L,以不加重組蛋白Tpp47或脂多糖的孔做為空白對照,每孔設3個復孔,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,加入Calcein AM(5 μmol/L)標記的THP-1細胞1×105個,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h,PBS洗去未黏附的THP-1細胞,熒光顯微鏡下計數(shù)未黏附的THP-1細胞,按公式THP-1細胞的黏附率=(加入總THP-1細胞數(shù)-未黏附THP-1細胞數(shù))/加入總THP-1細胞數(shù)×100%,計算THP-1細胞的黏附率。

6.HUVEC增殖實驗：將5×104個HUVEC接種于96孔細胞培養(yǎng)板,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,換新鮮培養(yǎng)基,加入重組蛋白Tpp47或脂多糖,使終濃度分別為400 μg/L和200 μg/L,以不加重組蛋白Tpp47或脂多糖的孔為空白對照,每次設3個復孔,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。棄上清,PBS洗2次,加入20 μl MTT(終濃度為5 g/L),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,棄上清,加入150 μl二甲基亞砜,振蕩混勻,以未接種細胞,只加培養(yǎng)基、MTT和二甲基亞砜的孔作為調零孔,酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔490 nm波長處A值。

7.統(tǒng)計分析：實驗結果采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量數(shù)據(jù)采用±s,組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗,計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、重組蛋白Tpp47刺激HUVEC后ICAM-1及E選擇素的分泌水平

ELISA檢測結果顯示,重組蛋白Tpp47在400μg/L濃度,兩種黏附分子的分泌水平均達頂峰(圖1),ICAM-1及E選擇素的分泌達峰值時間分別為24 h和12 h(圖2)。脂多糖分別在200 μg/L和800 μg/L濃度ICAM-1及E選擇素的分泌達峰值(圖3),所需時間分別為6 h和12 h(圖4)。經(jīng)兩樣本t檢驗,重組蛋白Tpp47(ICAM-1為400 μg/L 24 h,E選擇素為 400 μg/L 12 h)或脂多糖(ICAM-1 為 200 μg/L 6 h,E選擇素為800 μg/L 12 h)刺激HUVEC分泌兩種黏附分子的最大值,與空白對照組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(表1)。

二、重組蛋白Tpp47刺激HUVEC后ICAM-1及E選擇素mRNA的轉錄水平

重組蛋白Tpp47在400 μg/L濃度,兩種黏附分子mRNA轉錄水平均達頂峰(圖5),ICAM-1及E選擇素的mRNA轉錄達峰值所需時間分別為24 h和12 h(圖6);脂多糖分別在200 μg/L和800 μg/L濃度(圖7),所需時間分別為6 h和12 h(圖8),ICAM-1及E選擇素的mRNA轉錄達峰值。經(jīng)兩樣本t檢驗,重組蛋白Tpp47(ICAM-1為400 μg/L 24 h,E選擇素為400 μg/L 12 h)或脂多糖(ICAM-1為200 μg/L 6 h,E 選擇素為 800 μg/L 12 h) 刺激HUVEC后兩種黏附分子mRNA的轉錄水平的2-ΔΔCt值,與空白對照組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(表1)。

圖1 不同濃度重組蛋白Tpp47刺激對人臍靜脈內皮細胞24 h時的ICAM-1及E選擇素分泌水平

圖2 400 μg/L重組蛋白Tpp47刺激對人臍靜脈內皮細胞后不同時間點ICAM-1及E選擇素分泌水平

圖3 不同濃度脂多糖刺激對人臍靜脈內皮細胞6 h時的ICAM-1及E選擇素分泌水平

圖4 200 μg/L脂多糖刺激對人臍靜脈內皮細胞后不同時間點ICAM-1及E選擇素分泌水平

表1 重組蛋白Tpp47對人臍靜脈內皮細胞分泌細胞間黏附分子1、E選擇素及其mRNA轉錄水平的影響(自由度=4)

圖5 不同濃度重組蛋白Tpp47刺激人臍靜脈內皮細胞24 h時的ICAM-1及E選擇素mRNA的轉錄水平

圖6 400 μg/L重組蛋白Tpp47刺激人臍靜脈內皮細胞后不同時間點ICAM-1及E選擇素mRNA的轉錄水平

圖7 不同濃度脂多糖刺激人臍靜脈內皮細胞6 h時的ICAM-1及E選擇素mRNA的轉錄水平

圖8 200 μg/L脂多糖刺激人臍靜脈內皮細胞后不同時間點ICAM-1及E選擇素mRNA的轉錄水平

三、重組蛋白Tpp47對HUVEC與THP-1細胞黏附的影響

重組蛋白Tpp47刺激HUVEC后,HUVEC與THP-1細胞的黏附率顯著增加,為56.1% ± 1.9%,明顯高于空白對照組(16.3% ±2.1%),經(jīng)χ2檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(χ12=12.65,P1＜0.05),但與脂多糖組(51.4%±2.7%)比較,差異無統(tǒng)計學意義(χ22=0.54,P2＞ 0.05)。

四、重組蛋白Tpp47對HUVEC增殖的影響

重組蛋白Tpp47或脂多糖刺激后,HUVEC增殖率(分別為19.5%±1.7%和41.2%±3.7%)增加,分別與空白對照組(10.0%±3.1%)比較,差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為3.92和25.29,均P＜0.05),但重組蛋白Tpp47組HUVEC增殖率較脂多糖組低,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.42,P＜0.05)。

討 論

梅毒的主要組織病理特征為血管內皮細胞腫脹,增生,漿細胞、淋巴細胞等炎癥細胞浸潤,進而導致血管栓塞,這些特征在胎傳梅毒、心血管梅毒及神經(jīng)梅毒中更為明顯,闡明此血管病理機制對于闡明梅毒的免疫學機制具有重要的意義。

Tp外膜不含有與革蘭陰性細菌引起前炎癥反應相同的脂多糖,但含有豐富的脂蛋白。Tp脂蛋白由Tp基因編碼,隨著基因工程技術的發(fā)展及Tp全基因序列的揭示,人工合成了一系列膜蛋白,且發(fā)現(xiàn)人工合成或重組表達的膜蛋白與自然來源的Tp膜蛋白生物學特性基本相同[8]。對多種膜蛋白的研究結果顯示,Tp膜蛋白可激活炎癥細胞,釋放炎性介質、細胞因子,造成組織損傷或誘導宿主細胞凋亡,為主要的炎癥激動劑,且能誘發(fā)T細胞增殖,是介導宿主黏附和免疫的主要靶點[9]。其中Tpp47脂蛋白是免疫原性及免疫反應性均較強的膜蛋白,其基因長度為1 302 bp,編碼的蛋白相對分子質量為47 645。Tpp47脂蛋白目前作為單一或與其他抗原聯(lián)合應用于梅毒的血清學診斷,其特異性可達95%和敏感性可達82%[10]。Tpp47是一種青霉素結合蛋白,青霉素競爭性抑制Tpp47的氨基酸序列中的PBP位點,從而殺滅Tp[11]。

本研究選用HUVEC作為實驗細胞,觀察重組蛋白Tpp47對內皮細胞黏附功能的影響。實驗結果顯示,重組合成的膜蛋白Tpp47可以顯著提高HUVEC分泌ICAM-1及E選擇素的水平;熒光定量RT-PCR結果顯示ICAM-1及E選擇素的轉錄水平也得到提高。為了證明隨著黏附分子分泌水平的增加,是否也同時提高了內皮細胞與單核細胞之間的黏附,我們選用人單核細胞THP-1細胞與HUVEC相互作用。實驗結果顯示,經(jīng)400 μg/L濃度的重組蛋白Tpp47刺激24 h后,THP-1細胞與HUVEC的黏附率顯著提高。脂多糖對內皮細胞的作用已在多項研究中證實,可促進HUVEC的增殖、活化、黏附分子及炎癥因子的分泌[12]。本實驗選用脂多糖作為陽性對照,結果顯示,重組蛋白Tpp47在促進HUVEC ICAM-1及E選擇素分泌及與THP-1細胞的黏附方面,與脂多糖的作用相似,但促進HUVEC增殖的能力較脂多糖弱(P＜0.05)。推測重組蛋白Tpp47對HUVEC的作用主要為促進其活化,通過分泌黏附分子,增加與單核細胞的黏附。Lee等[13]曾將重組蛋白Tpp47作用于人皮膚微血管內皮細胞(HDMEC),結果顯示,重組蛋白Tpp47可促進HDMEC分泌黏附分子ICAM-1、血管細胞黏附分子1及E選擇素,且可促進HDMEC與外周血T淋巴細胞的黏附。本研究與之不同在于,一是采用HUVEC,為目前國內外研究與血管炎癥相關疾病的常用細胞,對解釋Tp對機體心血管等內臟器官的損傷更為明確;二是觀察了Tpp47對該細胞的促增殖能力,可部分解釋梅毒皮損中內皮細胞增生這一病理特征,這也是以往未見報告的。但本研究中的Tpp47系采用基因重組工程技術獲得,與Tp細胞上的Tpp47脂蛋白可能不完全相同,其生物學活性亦可能不盡相同。此外本研究所測為HUVEC的分泌型黏附分子,后者的免疫學功能與細胞表面的膜型黏附分子有所不同,因此解釋結果時可能存在一定局限性。

本研究結果顯示,Tp膜蛋白Tpp47可促進內皮細胞的增殖、分泌黏附分子及促進內皮細胞與淋巴細胞之間的黏附,這在梅毒致病機制中可能起重要作用。鑒于Tp膜蛋白在梅毒發(fā)病機制中的作用及梅毒發(fā)病機制研究現(xiàn)狀,進一步研究膜蛋白Tpp47對內皮細胞其他功能的影響,如對炎癥細胞的趨化作用,內皮細胞骨架結構的改變等,以及其他Tp膜蛋白對內皮細胞功能的影響,對深入研究梅毒的發(fā)病機制有一定的意義。

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2013-07-05)

(本文編輯：顏艷)

Treponema pallidummembrane protein Tpp47 promotes the adhesion ability of vascular endothelial cellsin vitro:an experimental study

Zhang Ruili，Wang Qianqiu.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

Wang Qianqiu，Email:wangqq@ncstdlc.org

ObjectiveTo evaluate the effect ofTreponema pallidummembrane protein Tpp47 on vascular endothelial cells.MethodsHuman umbilical vein endothelial cells(HUVECs)were classified into multiple groups to be cultured with various concentrations(50，100，200，400 and 800 μg/L)of the recombinant protein Tpp47 or lipopolysaccharide(LPS)for different durations(3，6，12，24 and 48 hours).Then，enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to determine the levels of intercellular cell adhesion molecule-1(ICAM-1)and E-selectin in the culture supernatant of，fluorescence-based real-time quantitative PCR to quantify the mRNA expressions of ICAM-1 and E-selectin in，HUVECs.The 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5 diphenyl tetrazolium bromide(MTT)assay was used to evaluate the proliferation activity of HUVECs treated with Tpp47(400 μg/L)and LPS(200 μg/L)respectively for 24 hours.To estimate the effect on adhesion ability，some HUVECs were pretreated with Tpp47(400 μg/L)and LPS(200 μg/L)respectively for 24 hours followed by coculture with THP-1 human monocytic leukaemia cells for 6 hours，then，the adhesion of HUVECs to THP-1 cells was visualized by fluorescence microscopy.The cells receiving no treatment served as the blank control.Results A significant increase was observed in the supernatant level(expressed as the absorbance value at 450 nm)of ICAM-1 for HUVECs treated with Tpp47 of 400 μg/L for 24 hours(1.28 ± 0.03 vs.0.90 ± 0.01，t=18.28，P＜ 0.05)and that of E-selectin for HUVECs treated with Tpp47 of 400 μg/L for 12 hours(0.51 ± 0.01 vs.0.13 ± 0.03，t=18.19，P＜0.05)compared with untreated HUVECs.The adhesion rate to THP-1 cells was significantly higher in HUVECs pretreated with Tpp47 for 24 hours than in untreated HUVECs(56.1% ±1.9%vs.16.3% ±2.1%，χ2=12.65，P＜0.05).The cell proliferation rate was 19.5% ± 1.7%in HUVECs treated with Tpp47，significantly higher than that in untreated HUVECs(10.0% ±3.1%，χ2=3.92，P＜0.05)，but lower than that in those treated with LPS(41.2% ±3.7%，χ2=10.42，P＜ 0.05).ConclusionsThe recombinant membrane protein Tpp47 could enhance HUVECs to proliferate and adhere to monocytic THP-1 cells，suggesting a certain role of Tpp47 in the pathogenesis of syphilis.

Treponema pallidum;Cell adhesion molecules;E-selectin;Tpp47;Human umbilical vein endothelial cells;Monocytic THP-1 cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.05.007

江蘇省自然科學基金面上項目(BK2010136)

210042南京,中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所

王千秋,Email：wangqq@ncstdlc.org