胡文治 祃麗娟 趙廣

42℃熱處理在UVB誘導(dǎo)黑素細(xì)胞氧化損傷中的作用

胡文治 祃麗娟 趙廣

目的探討熱處理在UVB誘導(dǎo)的人黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用。方法體外培養(yǎng)原代人表皮黑素細(xì)胞,將純化的MC分為4個(gè)處理組：對(duì)照組(37℃正常培養(yǎng))、熱處理組(42℃孵育1 h)、UVB處理組(100 mJ/cm2UVB照射)、聯(lián)合處理組(42℃孵育1 h后給予100 mJ/cm2UVB照射),各組連續(xù)處理3 d。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活率,生物化學(xué)法檢測(cè)超氧化物歧化酶活力和丙二醛濃度,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧和細(xì)胞凋亡率。結(jié)果對(duì)照組細(xì)胞活率、細(xì)胞凋亡率、超氧化物歧化酶活力、丙二醛濃度、活性氧熒光強(qiáng)度分別為：(100 ± 6.14)%、(4.66 ± 0.58)%、(53.39 ± 8.23)U/gprot、(1.09 ± 0.32)mmol/gprot、1070.85 ± 42.07。 UVB 照射可以明顯提高M(jìn)C凋亡率[(24.14±2.90)%]、丙二醛[(1.65±0.33)mmol/gprot]和細(xì)胞內(nèi)活性氧(1416.45±79.12)水平,降低細(xì)胞活率[(50.23±5.36)%]和超氧化物歧化酶活力[(31.98±11.89)U/gprot],而熱處理可以顯著降低UVB誘導(dǎo)的凋亡[(14.9±1.49)%],降低丙二醛[(1.10±0.26)mmol/gprot]、活性氧(1033.30±68.41)的含量,同時(shí)恢復(fù)細(xì)胞的活率[(74.12±6.17)%)]和超氧化物歧化酶活力[(51.63±6.55)U/gprot]。結(jié)論熱處理對(duì)UVB誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。

黑素細(xì)胞;熱;中波紫外線;氧化性應(yīng)激

白癜風(fēng)是一種進(jìn)行性色素脫失性疾病,其主要的病理特征為表皮功能性黑素細(xì)胞(melanocytes,MC)的破壞和缺失。治療手段包括：紫外線、308 nm準(zhǔn)分子激光、局部外用免疫調(diào)節(jié)劑或維生素D衍生物等。其中,窄譜中波紫外線(NB-UVB)局部照射是有效的治療方法之一。但是,有研究表明,紫外線照射,特別是UVB(290～320 nm),可以誘導(dǎo)組織產(chǎn)生自由基和相關(guān)的活性氧,直接損傷DNA,最終導(dǎo)致皮膚老化和皮膚癌[1]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),白癜風(fēng)患者M(jìn)C存在抗氧化功能的缺陷[2],提示我們用UVB治療白癜風(fēng),必須要考慮到過量UVB對(duì)MC的損傷。另一方面,有研究證實(shí),熱照射也可以應(yīng)用于白癜風(fēng)治療。Nakazawa等[3]首次比較了人表皮MC對(duì)UVB和熱的反應(yīng),發(fā)現(xiàn)熱照射可以促使MC樹突增多延長(zhǎng)、胞體增大,細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑素合成增加。研究還提示,適量的熱處理可以減少外部環(huán)境對(duì)細(xì)胞的損傷。我們通過檢測(cè)人表皮MC在體外環(huán)境下的活率、凋亡率、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)濃度、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS),分析熱處理、UVB照射、聯(lián)合處理對(duì)細(xì)胞的影響。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑與儀器：黑素細(xì)胞培養(yǎng)基(M-254)、黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加物(HMGS-1)產(chǎn)自美國(guó)Gibco公司;真表皮分散酶產(chǎn)自美國(guó)Roche公司;噻唑藍(lán)(MTT)、2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)產(chǎn)自美國(guó)Sigma公司;FITC Annexin V Apoptosis試劑盒產(chǎn)自美國(guó)BD公司;胎牛血清產(chǎn)自杭州天杭生物公司;胰蛋白酶消化液產(chǎn)自南京凱基生物公司;SOD、MDA、蛋白定量試劑盒產(chǎn)自南京建成生物工程研究所。紫外線光療儀產(chǎn)自上海希格瑪高科技有限公司(光源波長(zhǎng)310～313 nm,峰值311 nm);UVB輻照儀由北京師范大學(xué)光電儀器廠生產(chǎn);BX60熒光顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn)。

二、方法

1.人黑素細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代：取成人包皮環(huán)切后標(biāo)本,碘伏浸泡消毒10 min,清除皮下組織,剪切為0.5 cm×0.5 cm皮片。置于0.5%真表皮分散酶中,4℃靜置12 h,37℃消化1 h。分離真表皮,將表皮置于胰蛋白酶內(nèi)室溫消化20 min,胎牛血清終止消化,吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液,200目細(xì)胞篩過濾。離心后加入M-254培養(yǎng)液,接種于培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱培養(yǎng),待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后進(jìn)行傳代。經(jīng)傳代獲得純化的黑素細(xì)胞培養(yǎng)系,傳至3～5代收獲細(xì)胞備用。

2.實(shí)驗(yàn)分組：3～5代MC長(zhǎng)至80%融合時(shí),胰蛋白酶消化收集。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需要,以不同密度接種于培養(yǎng)皿。細(xì)胞活率實(shí)驗(yàn)：96孔板,2 000/孔;細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：35 mm培養(yǎng)皿,1×105/孔;MDA濃度、SOD活力檢測(cè)：100 mm培養(yǎng)皿,密度8×105/孔;細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)：60 mm培養(yǎng)皿,密度3×105/孔。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%融合,更換培養(yǎng)液,隨機(jī)分為對(duì)照組、熱處理組、UVB處理組、聯(lián)合處理組,每組6個(gè)樣本,重復(fù)3次。

3.細(xì)胞干預(yù)方法：UVB處理組：超凈臺(tái)內(nèi),紫外線治療儀以0.64 mW/cm2照射強(qiáng)度UVB照射156 s(照射劑量100 mJ/cm2)。為避免培養(yǎng)基顏色的影響,照射時(shí)根據(jù)培養(yǎng)皿面積,以25 μl/cm2PBS替換培養(yǎng)基,照射后重新添加培養(yǎng)基(非UVB處理組,以等量PBS處理相同時(shí)間)。熱處理：42℃、5%CO2、飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)1 h。聯(lián)合處理組：熱處理后給予UVB處理。對(duì)照組：37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng),不做任何處理。各組連續(xù)干預(yù)3 d,每天干預(yù)1次,末次處理12 h后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

4.不同處理對(duì)MC活率的影響：將處理后的96孔板,置于超凈臺(tái)內(nèi)。每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl,37℃孵育4 h,棄去培養(yǎng)液,每孔加入 150 μl DMSO充分溶解結(jié)晶物,將不同處理組DMSO移入同一96孔板,酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色,以空白孔調(diào)零,細(xì)胞活率 =A處理組/A對(duì)照組×100%。

5.不同處理對(duì)細(xì)胞凋亡的影響：胰蛋白酶消化收集各處理組細(xì)胞。按照FITC Annexin V Apoptosis試劑盒說明書操作,將消化細(xì)胞用預(yù)冷PBS漂洗2遍后,用適量結(jié)合緩沖液[0.01 mol/L Hepes/NaOH(pH 7.4),0.14 mol/L NaCl,2.5 mmol/L CaCl2]重懸細(xì)胞,將細(xì)胞密度調(diào)整至1×106/ml。取100 μl細(xì)胞懸液移至上樣管,每管加Annexin V和PI各5 μl。室溫避光孵育15 min后,每管加300 μl結(jié)合緩存液,立即上機(jī)檢測(cè)。

6.檢測(cè)不同處理組SOD活力和MDA濃度：胰蛋白酶消化并收集各處理組細(xì)胞,加入預(yù)冷PBS漂洗1遍,加入0.5 ml PBS將細(xì)胞吹打?yàn)榧?xì)胞懸液,在冰浴器上用超聲裂解細(xì)胞(60 W,0.5 s間隔,15 min)。4℃下,10 000×g離心15 min,將上清液移入新試管中。測(cè)量樣本蛋白濃度：取樣品上清適當(dāng)稀釋后,參考試劑盒說明書,用BCA法測(cè)定總蛋白量。測(cè)量MDA：取樣品上清,參考試劑盒說明書,應(yīng)用硫代巴比妥(TBA)法,測(cè)定MDA含量。測(cè)量SOD活力：取樣品上清,適當(dāng)稀釋后,參考試劑盒說明,應(yīng)用WST-1法測(cè)定樣品SOD活力。

7.細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定：各處理組棄去培養(yǎng)基,加入不含添加因子的M-254培養(yǎng)基,加入DCFH-DH使終濃度達(dá)到2.5 μmol/l,37℃孵育細(xì)胞30 min。取部分樣本,經(jīng)熒光顯微鏡488 nm波長(zhǎng)藍(lán)光激發(fā)綠色熒光,軟件采集圖像。剩余樣本經(jīng)胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,加入200 μl的PBS吹打?yàn)榧?xì)胞懸液。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度,應(yīng)用CELL QuestTM軟件分析。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)以±s表示。對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和LSD-t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.黑素細(xì)胞活率：MTT實(shí)驗(yàn)顯示,對(duì)照組、熱處理組、UVB處理組、聯(lián)合處理組的活率分別為(%)：100 ± 6.14、105.85 ± 5.32、50.23 ± 5.36、74.12 ± 6.17。統(tǒng)計(jì)分析顯示,熱處理可以促進(jìn)MC的增殖(P＜0.01),UVB處理組和聯(lián)合處理組MC活率均顯著降低(P＜0.01),但聯(lián)合處理組活率明顯高于UVB組(P＜0.01)。

2.黑素細(xì)胞凋亡率：對(duì)照組、熱處理組、UVB處理組、聯(lián)合處理組MC的凋亡率(%)分別為：4.66±0.58、8.87 ± 1.67、24.14 ± 2.90、14.9 ± 1.49,3 個(gè)處理組凋亡率均高于對(duì)照組(P＜0.001),但較熱處理組和聯(lián)合干預(yù)組,UVB處理組凋亡率明顯增高(P＜0.001),見圖 1。

3.黑素細(xì)胞SOD活力和MDA濃度：UVB處理組,較其他3組SOD活力明顯降低(均P＜0.01),MDA濃度明顯增高(均P＜0.01);對(duì)照組、熱處理組、聯(lián)合處理組間SOD活力與MDA濃度,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。

表1 不同處理組黑素細(xì)胞SOD活力和MDA濃度(±s,n=6)

表1 不同處理組黑素細(xì)胞SOD活力和MDA濃度(±s,n=6)

注：a：與其他3個(gè)組相比,均P＜0.01

SOD(U/gprot) MDA(mmol/gprot)對(duì)照組 53.39±8.23 1.09±0.32熱處理組 44.45±6.66 0.85±0.08 UVB處理組 31.98±11.89a 1.65±0.33a聯(lián)合處理組 51.63±6.55 1.10±0.26

4.細(xì)胞內(nèi)ROS：熒光顯微鏡下,UVB處理組綠色熒光明顯增強(qiáng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示：對(duì)照組、熱處理組、UVB處理組、聯(lián)合處理組熒光強(qiáng)度分別為：1 070.85 ± 42.07、1 101.90 ± 44.99、1 416.45 ± 79.12、1 033.30±68.41。UVB處理組平均熒光強(qiáng)度明顯高于其他3個(gè)組(均P＜0.01),對(duì)照組、熱處理組、聯(lián)合處理組之間,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖2。

討 論

在MC的體外實(shí)驗(yàn)中,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)熱處理(42℃,60 min,連續(xù)3 d)可以促進(jìn)MC增殖,增強(qiáng)酪氨酸酶活性和黑素合成[4]。祃麗娟等[5]通過角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes,KC)與MC的共培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn),熱處理后MC與KC α-MSH分泌增加,MSH前體POMC基因表達(dá)水平上升。這些研究都提示,熱處理可以提高M(jìn)C活性及功能。不僅如此,其他研究發(fā)現(xiàn),熱處理聯(lián)合UVB照射,可以增加UVB的治療效果,促進(jìn)MC內(nèi)酪氨酸酶活性,增加黑素合成[6],邵麗芳等[7]發(fā)現(xiàn),熱處理聯(lián)合UVB照射,可以引起細(xì)胞HSP72水平增高,提示熱處理可能對(duì)UVB誘導(dǎo)的損傷具有保護(hù)作用。鑒于以上研究,我們針對(duì)不同處理方法對(duì)MC的影響進(jìn)行了觀察。

圖1 不同處理對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V、PI雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù),圖中左下象限為正常細(xì)胞,左上象限為壞死細(xì)胞,右下象限為早凋細(xì)胞,右上象限為晚凋細(xì)胞。其中熱處理組、UVB組、聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組,但熱處理組和聯(lián)合處理組凋亡率均低于UVB組

圖2 不同處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 不同處理組DCFH-DH(2.5 μmol/l)孵育30 min后,胞質(zhì)內(nèi)呈黃綠色熒光(熒光顯微鏡,×200)。圖中細(xì)胞熒光強(qiáng)度反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平,結(jié)果顯示UVB處理組熒光強(qiáng)度明顯高于其他3個(gè)組

實(shí)驗(yàn)中我們觀察到,MC活率隨UVB照射劑量的增加而減低,當(dāng)UVB照射劑量大于50 mJ/cm2連續(xù)3 d時(shí),MC的活率受到明顯抑制(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。當(dāng)UVB照射達(dá)到100 mJ/cm2連續(xù)3 d時(shí),為MC的半效抑制劑量,此時(shí)MC的凋亡率明顯增加,細(xì)胞內(nèi)SOD活力明顯減低,細(xì)胞內(nèi)ROS累積,并引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物(MDA)濃度的顯著增加。研究顯示,UVB可以通過多種途徑對(duì)細(xì)胞造成損傷,特別是產(chǎn)生過量的ROS誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷。ROS具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、損傷應(yīng)答等多種功能,但過量ROS會(huì)導(dǎo)致明顯的毒副作用,諸如蛋白失活、誘導(dǎo)凋亡、損傷細(xì)胞核和線粒體DNA、促進(jìn)炎性介質(zhì)釋放。UV照射不僅可以活化核黃素、色氨酸、卟啉等小分子產(chǎn)生ROS[8],還可以損傷線粒體,加速氧化失衡。線粒體在氧化損傷中發(fā)揮重要作用,線粒體是內(nèi)源性ROS的重要來源,同樣也是ROS損傷的主要靶點(diǎn),線粒體失能會(huì)誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS的惡性循環(huán),最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷[9]。而線粒體DNA由于缺乏組蛋白和完善的修復(fù)系統(tǒng),容遭受紫外線照射的損傷[10]。因此,過量的UVB照射容易造成MC的氧化應(yīng)激損傷。臨床中白癜風(fēng)患者通常以50%～70%的最小紅斑量(MED)作為起始照射劑量(通常為200 mJ/cm2),以后逐漸增加。但是由于患者膚色、聯(lián)合用藥、治療部位等的不同,治療劑量差異較大,照射劑量常根據(jù)經(jīng)驗(yàn)調(diào)整,有可能導(dǎo)致UVB照射劑量過大,造成MC細(xì)胞損傷,促進(jìn)皮損發(fā)展。因此,尋求一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的治療措施,預(yù)防UVB過量造成的MC損傷十分必要。

本實(shí)驗(yàn)顯示,單純熱處理(42℃,60 min,連續(xù)3 d)雖然可以輕度增加細(xì)胞的凋亡率,但總體上以促進(jìn)細(xì)胞增殖為主,其效果與低劑量UVB照射(20 mJ/cm2)類似。Nakazawa等[3]認(rèn)為這種作用可能與p53和p21蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn),熱聯(lián)合大劑量UVB(100 mJ/cm2)處理細(xì)胞,可以降低單純UVB照射導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。這與Bivik等[11]的結(jié)果一致,他們認(rèn)為熱應(yīng)激誘導(dǎo)的HSP70,可以通過抑制組織蛋白酶和細(xì)胞色素c的釋放,減少UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在氧化應(yīng)激方面,熱處理組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中熱處理組SOD活力和MDA含量均有輕度下降(均P＞0.05),可能與熱處理后細(xì)胞代謝水平升高,總蛋白含量增加有關(guān)。與UVB照射組相比,聯(lián)合處理可以明顯降低UVB誘導(dǎo)的ROS和MDA水平,促進(jìn)SOD活力恢復(fù),對(duì)UVB誘導(dǎo)的氧化損傷具有拮抗作用。綜上所述,我們推測(cè)熱處理雖然對(duì)MC有輕度的損傷作用,但是這種輕度的損傷,可能激活了細(xì)胞的防御機(jī)制,引發(fā)防御反應(yīng),進(jìn)而對(duì)UVB照射引起的氧化應(yīng)激起到了保護(hù)作用。雖然本實(shí)驗(yàn)仍缺乏熱處理拮抗氧化損傷機(jī)制的深入研究,但是以上數(shù)據(jù)可以初步提示：適度熱處理(42℃,60 min)對(duì)大劑量UVB(100 mJ/cm2)損傷具有保護(hù)作用,也提示熱療聯(lián)合UVB不僅可以增強(qiáng)細(xì)胞活性和功能,促進(jìn)皮損恢復(fù),還可減少UVB治療的不良反應(yīng),具有良好的應(yīng)用前景,也為臨床治療色素脫失性疾病提供了新的思路。

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2013-07-19)

(本文編輯：吳曉初)

Effect of heat treatment at 42℃on ultraviolet B-induced oxidative injury to human melanocytes

Hu Wenzhi*，Ma Lijuan，Zhao Guang.*Department of Dermatology，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi′an 710032，China

Zhao Guang，Email:guangfen@yahoo.com

ObjectiveTo evaluate the effect of heat treatment on ultraviolet B(UVB)-induced oxidative injury to human melanocytes.MethodsMelanocytes were isolated from adult foreskins，and subjected to a primary culture.After 3-4 passages of subculture，the melanocytes were classified into 4 groups:control group incubated at 37 ℃，heat treatment group incubated at 42 ℃ for 1 hour，UVB group exposed to UVB irradiation at 100 mJ/cm2，combination group receiving heat treatment at 42℃for 1 hour followed by UVB irradiation at 100 mJ/cm2.After three successive days of treatment，MTT assay was performed to evaluate cell viability，a biochemical method to determine the activity of superoxide dismutase(SOD)and concentration of malonaldehyde(MDA)，and flow cytometry to detect intracellular reactive oxygen species(ROS)and apoptosis in melanocytes.ResultsThe cell survival rate，apoptosis rate，SOD activity，MDA concentration and ROS level were(100 ± 6.14)%，(4.66 ± 0.58)%，(53.39 ± 8.23)U/gprot，(1.09 ± 0.32)mmol/gprot，and 1070.85 ± 42.07 in the control group respectively.UVB exposure induced a significant increase in apoptosis rate(24.14% ±2.90%，P＜0.001)，MDA concentration(1.65±0.33 mmol/gprot，P＜0.01)and ROS level(1416.45±79.12，P＜0.01)，but a significant decrease in cell survival rate(50.23% ±5.36%，P＜0.01)and SOD activity(31.98 ± 11.89 U/gprot，P＜ 0.01)in the UVB group compared with the control group，while the heat pretreatment markedly downregulated the UVB-induced increase in apoptosis rate(14.9% ±1.49%，P＜0.001)，MDA concentration(1.10±0.26 mmol/gprot)and ROS level(1033.30±68.41，P＜0.01)，as well as the decrease in cell survival rate(74.12%±6.17%，P＜0.01)and SOD activity(51.63±6.55 U/gprot，P＜0.01)in the combination group.ConclusionHeat treatment could protect melanocytes from UVB-induced oxidative injury.

Melanocytes;Heat;UVB;Oxidative stress

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.05.010

國(guó)家自然科學(xué)基金(81271745)

710032西安,第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院(胡文治);解放軍空軍總醫(yī)院皮膚病醫(yī)院(趙廣、祃麗娟)

趙廣,Email：guangfen@yahoo.com