盧芳，錢思宇，李敏，張鐘，劉毅，刁慶春

（重慶市第一人民醫(yī)院，重慶400011）

膚光方為我院院內(nèi)制劑，臨床應(yīng)用治療皮炎濕疹20余年，療效確切。為了深入探討其作用機制同時為臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)，本實驗通過紙片擴散法、打孔法和瓊脂稀釋法觀察膚光方及其加減方共6種方劑的水煎液對金黃色葡萄球菌（金葡菌）甲氧西林敏感株和耐藥株的抑菌作用，同時測定各組方對兩型金葡菌最低抑菌濃度。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923為甲氧西林敏感株，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。金葡菌甲氧西林耐藥株從重慶市第一人民醫(yī)院皮膚科患者標(biāo)本中經(jīng)分離、鑒定而獲得。接種培養(yǎng)在普通瓊脂平板上。膚光方由野菊花、蒲公英、白鮮皮、苦參、地膚子、蛇床子等組成，清熱解毒方由野菊花、蒲公英等組成，清熱解毒燥濕方由野菊花、蒲公英、白鮮皮、苦參等組成，收斂解毒方由野菊花、蒲公英、兒茶（3%濃度）等組成，清熱燥濕方由白鮮皮、苦參等組成，祛風(fēng)止癢方由地膚子、蛇床子等組成。其中收斂解毒方為膚光方加方，其余均為其減方。Mueller-Hinton瓊脂（MH瓊脂）購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備 按處方比例稱取除冰片外的上述藥材，加水浸泡30 min后，分別加水10倍量、8倍量、8倍量煎煮3次，1 h/次，濾過，合并3次濾液，濃縮至所需濃度，相應(yīng)分量的冰片細(xì)粉經(jīng)過100目篩子篩選，加入濃縮藥劑中，即得。

1.2.2 紙片擴散法（K-B法）觀察各組方的抑菌活性 用打孔器將定性濾紙制作成直徑6 mm左右的圓形紙片，高壓滅菌后加入相應(yīng)量的藥物制備成含藥量紙片。將孵育16～24 h的數(shù)個菌落置于生理鹽水試管中，校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)（相當(dāng)于1.0×108CFU/mL）。用無菌棉簽蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液后在MH瓊脂平板表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周。平板在室溫下干燥3～5 min后用無菌鑷子將藥物紙片緊貼于瓊脂表面，置35℃孵育16～18 h。記錄抑菌圈的直徑，實驗重復(fù)10次。設(shè)置8個組：含藥量均為10 mg的膚光方組、清熱解毒方組、清熱解毒燥濕方組、清熱解毒燥濕方組、收斂解毒方組、祛風(fēng)止癢方組為實驗組；生理鹽水（NS）組為陰性對照組，10 U的青霉素（PEN）和30 μg的萬古霉素（VAN）分別作為甲氧西林敏感株和耐藥株的陽性對照組。如上述方法制作菌液，并接種在MH瓊脂平板表面待干后，用直徑6 mm無菌金屬打孔器在平皿內(nèi)打孔，除去洞內(nèi)瓊脂，用微量移液器吸取50 μL各組方水煎液加入洞內(nèi)，37℃培養(yǎng)16～18h，記錄抑菌圈的直徑，實驗重復(fù)10次[1]。抑菌圈直徑小于10 mm表示無抑菌作用。設(shè)置6個組：濃度為1×103g/L的膚光方組、清熱解毒方組、清熱解毒燥濕方組、清熱解毒燥濕方組、收斂解毒方組為實驗組；生理鹽水（NS）組為陰性對照組。

1.2.4 瓊脂稀釋法測定各組方對金葡菌的最小抑菌濃度（MIC值） 將各濃度受試藥液2 mL加入無菌平皿內(nèi)，再加入MH瓊脂培養(yǎng)基18 mL搖勻，使培養(yǎng)基內(nèi)各組方組終濃度分別為100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.562 5 g/L；待凝固后，用接種環(huán)取 2 μL菌液分別在以上平板上劃線種入實驗菌液，置35℃恒溫箱中培養(yǎng)16～20 h，觀察結(jié)果，以培養(yǎng)皿中無細(xì)菌生長者為受試中藥的最低抑菌濃度。

2 結(jié)果

2.1 紙片法觀察各組方對金葡菌甲氧西林敏感株ATCC25923和MRSA株的抑制作用 和NS組相比，膚光方、祛風(fēng)止癢方、收斂解毒方、清熱解毒燥濕方對金葡菌耐藥株和敏感株均具有一定的抑菌活性，其中膚光方的抑菌作用最強。膚光方表現(xiàn)出來顯著的抑制金葡菌耐藥株和敏感株生長的活性，尤其是對耐藥株，膚光方表現(xiàn)出高于青霉素3倍的抑制作用，稍弱于萬古霉素。對金葡菌敏感株，清熱解毒方、清熱燥濕方均無顯著的抑制作用。對金葡菌耐藥株，清熱解毒方具有一定的抑制作用，而清熱燥濕方的抑制作用不具有統(tǒng)計學(xué)意義。另外，對ATCC 25923（P=1.000）和 MRSA 菌株（P=1.000），收斂解毒方和清熱解毒燥濕方之間抑菌活性差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 紙片法各組方對金葡菌ATCC 25923和MRSA株的抑菌圈直徑 （±s）

表1 紙片法各組方對金葡菌ATCC 25923和MRSA株的抑菌圈直徑 （±s）

注：P為各組與生理鹽水組（NS）之間兩兩比較的P值。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

組別 ATCC 25 923（mm） MRSA（mm）±s P ±s P膚光方 16.99±1.05 0.000 18.92±1.10 0.000清熱解毒方 6.20±0.20 0.916 11.22±1.30 0.000收斂解毒方 9.02±0.54 0.000 13.59±1.02 0.000清熱燥濕方 6.08±0.65 1.000 6.02±0.04 1.000祛風(fēng)止癢方 10.16±0.56 0.000 16.24±0.96 0.000清熱解毒燥濕方 8.85±0.57 0.000 13.48±0.79 0.000 PEN 32.39±0.98 0.000 6.09±0.07 0.346 VAN 20.42±1.15 0.000 24.21±0.93 0.000 NS 6.06±0.48 6.02±0.05

2.2 打孔法驗證各組方的抑菌作用 運用打孔法對各組方的抑菌活性進行驗證后發(fā)現(xiàn)，各組方對ATCC 25923菌株和MRSA菌株均有一定的抑菌活性，和NS組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。抑菌圈大小見表2。同紙片法結(jié)果相似，無論對ATCC 25923菌株（P＝0.973）還是 MRSA 菌株（P＝0.682），收斂解毒方和清熱解毒燥濕方均具有較強的抑菌活性，且抑制作用大小相似，兩者相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 瓊脂稀釋法測各組方的MIC值 各組方對MRSA菌株均具有一定的抑菌活性，其中膚光方、祛風(fēng)止癢方、清熱解毒燥濕方活性最強，清熱燥濕方活性最弱。清熱燥濕方對ATCC 25923未表現(xiàn)出明顯的抑菌活性，其余各組方對ATCC 25923均有抑菌作用。見表3。

表2 打孔法各組方對金葡菌ATCC 25923和MRSA株的抑菌圈直徑 （±s）

表2 打孔法各組方對金葡菌ATCC 25923和MRSA株的抑菌圈直徑 （±s）

注：抑菌圈直徑<10 mm為耐藥，10～15 mm為中度敏感，15 mm以上為高度敏感。P為各組與生理鹽水組（NS）之間兩兩比較的P值。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

組別 ATCC 25923（mm） MRSA（mm）±s P ±s P膚光方 26.09±1.19 0.000 33.35±0.91 0.000清熱解毒方 17.17±1.10 0.000 25.80±0.90 0.000收斂解毒方 22.36±1.31 0.000 29.32±0.87 0.000清熱燥濕方 11.48±1.02 0.000 18.04±1.16 0.000祛風(fēng)止癢方 24.07±1.12 0.000 31.29±1.22 0.000清熱解毒燥濕方 21.56±1.10 0.000 28.42±1.05 0.000 NS 6.01±0.05 0.000 6.02±0.07 0.000

表3 瓊脂稀釋法測各組方對金葡菌ATCC 25923和MRSA株的MIC值 （g/L）

3 討論

濕疹是一種常見的由多種內(nèi)外因素引起的表皮及真皮淺層炎癥性皮膚病，發(fā)病原因復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，濕疹和特應(yīng)性皮炎（Atopic dermatitis，AD）皮損處微生物感染因素尤其是金葡菌是這些疾病激發(fā)和加重的重要因素之一[2-3]。90%以上的AD患者皮損處可分離到金葡菌，而健康對照組僅為5%。AD患者急性滲出性皮損處的金葡菌定植密度達(dá)到107/cm，皮損嚴(yán)重程度越高，定植數(shù)量越多[4-5]。金葡菌可以通過分泌外毒素使特應(yīng)性皮炎病情惡化。這些外毒素的作用類似于超抗原，這些超抗原可以滲透到皮膚真皮層[8]，通過激活T淋巴細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞（Antigen presenting cell，APC）、巨噬細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)揮作用[6]。一些特應(yīng)性皮炎患者還會產(chǎn)生直接作用于金葡菌超抗原的特異性IgE抗體，這種抗體的產(chǎn)生在一定程度上和皮膚的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[7]。在斑貼實驗中，大劑量超抗原可以引起皮膚炎癥[9]。低劑量超抗原雖然不能直接引起肉眼可見的炎癥，但可以增強吸入性過敏原在點刺試驗中的反應(yīng)[10]。另外，超抗原可誘發(fā)T細(xì)胞上糖皮質(zhì)激素β受體的基因表達(dá)，β受體主要由15個專有氨基酸組成，其活性與糖皮質(zhì)激素α受體的活性恰恰相反，β受體不能直接和激素結(jié)合，但可作為激素激活的轉(zhuǎn)錄因子，下調(diào)激素敏感基因的表達(dá)，降低AD對激素的敏感性[11]。目前，針對金葡菌的抗生素局部治療得到了廣泛認(rèn)可，早期運用抗菌藥物可提高療效?？股刂委煵粌H可以有效祛除AD中的細(xì)菌，減少超抗原的產(chǎn)生，還可以增加激素治療的敏感性，減輕AD炎癥反應(yīng)，有效地控制病情[12-13]。

本實驗觀察到，膚光方及其加減方對金葡菌甲氧西林敏感菌株ATCC 25923表現(xiàn)出了顯著的抑菌活性。同時，對MRSA菌株也表現(xiàn)出很強的抑制作用。提示膚光方可能部分通過抑制濕疹及AD患者皮膚表面金葡菌生長來發(fā)揮作用。膚光方主要由野菊花、蒲公英、白蘚皮、苦參、地膚子、蛇床子等組成，具有清熱燥濕解毒、祛風(fēng)止癢的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，野菊花、蒲公英、苦參、蛇床子對金葡菌均有抑制作用，其中野菊花、蒲公英作用較強。白鮮皮、地膚子主要是對真菌有抑制作用而對細(xì)菌無明顯抑制作用[14]。本實驗中發(fā)現(xiàn)，膚光方及其加減方的抑菌活性由強到弱依次為膚光方、祛風(fēng)止癢方、收斂解毒方、清熱解毒燥濕方、清熱解毒方、清熱燥濕方，其中收斂解毒方和清熱解毒燥濕方活性相似。膚光方的抑菌作用強于其他不含白蘚皮、地膚子的方劑組合。這可能與中藥為復(fù)方制劑，從單方面或單味藥的現(xiàn)代藥理研究難以全面評價其療效，各藥物之間存在一定的配伍關(guān)系有關(guān)。

綜上，本實驗不僅為膚光方的臨床應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)，也為膚光方的作用機制研究提供新的思維方向。

[1]李儀奎.中藥藥理實驗方法學(xué) [M].上海;上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1991：288-293.

[2]Breuer K,Kapp A,Werfel T.Bacterial infections and atopic dermatitis[J].Allergy,2001,56:1034-1041.

[3]Leung DY.Atopic dermatitis and the immune system:the role of superantigens and bacteria[J].J Am Acad Dermatol,2001,45：S13-S16.

[4]畢志剛,田美華,林麟,等.濕疹與特應(yīng)性皮炎皮損處細(xì)菌學(xué)研究[J].中華皮膚科雜志,2004,37（9）：595-597.

[5]弓娟琴,林麟,郝飛,等.濕疹及特應(yīng)性皮炎皮損處細(xì)菌定植情況及藥物聯(lián)合治療的分析[J].中華皮膚科雜志,2004,37（10）：515-518.

[6]Werfel T.The role of leukocytes,keratinocytes,and allergenspecific IgE in the development of atopic dermatitis[J].J Invest Dermatol,2009,129:1878-1891.

[7]Breuer K,Wittmann M,Bosche B,et al.Severe atopic dermatitis is associated with sensitization to staphylococcal enterotoxin B（SEB）[J].Allergy,2000,55:551-555.

[8]Skov L,Olsen JV,Giorno R,et al.Application of Staphylococcal enterotoxin B on normal and atopic skin induces up-regulation of T-cells by a superantigen-mediated mechanism[J].J Allergy Clin Immunol,2000,105:820-826.

[9]Strange P,Skov L,Lisby S,et al.Staphylococcal enterotoxin B applied on intact normal and intact atopic skin induces dermatitis[J].Arch Dermatol,1996,132:27-33.

[10]Langer K,Breuer K,Kapp A,et al.Staphylococcus aureus-derived enterotoxins enhance house dust mite-induced patch test reactions in atopic dermatitis[J].Exp Dermatol,2007,16:124-129.

[11]Hauk PJ,Hamid QA,Chrousos GP,et al.Induction of corticosteroid insensitivity in human PBMCs by microbial superantigens[J].J Allergy Clin Immunol,2000,105:782-787.

[12]Lever R,Hadley K,Downey D,et al.Staphylococcal colonization in atopic dermatitis and the effect of topical mupirocin therapy[J].Br J Dermatol,1988,119:189-198.

[13]Nilsson EJ,Henning CG,Magnusson J.Topical corticosteroids and Staphylococcus aureus in atopic dermatitis[J].J Am Acad Dermatol,1992,27:29-34.

[14]張廷模.臨床中藥學(xué) [M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2004:182,184,193,198,302,607.