范玉 ，杜錫賢 ，張春紅 ，張曉杰 ，王國穎 ，周愛妍

（1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，濟南250011；2.山東大學第二醫(yī)院，濟南250033；3.濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院，濰坊261000；4.山東大學齊魯兒童醫(yī)院，濟南250022）

銀屑病是一種具有遺傳傾向的以角質(zhì)形成細胞異常分化、增殖為特征的慢性炎癥性疾病，在銀屑病皮損區(qū)表皮基底細胞增生加速，有絲分裂周期縮短，表皮通過時間由28 d縮短為3～4 d[1]。本研究采用腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導活化HaCaT細胞，體外模擬銀屑病皮損角質(zhì)細胞異常增殖的病理特征，進一步探討中藥清熱利濕飲對HaCaT細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人永生化表皮細胞HaCaT細胞株購于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM高糖培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青生物公司）；胰蛋白酶（美國Sigma公司）；甲基噻唑基四唑(MTT)（美國Sigma公司）用時以PH值為7.2、濃度為0.01 mol/L的PBS配制成5 g/L，0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，-20℃凍存?zhèn)溆?。碘化丙啶（PI）染料（美國Sigma公司）；Annixin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（B&D公司）；甲氨喋呤(MTX)（廣東嶺南制藥有限公司）；rhTNF-α（PEPROTECH公司），10 μg/支比活≥2×107U/mg，蒸餾水溶解 10 mg/L（2×108U/L），-20℃凍存?zhèn)溆?；流式細胞分析儀及軟件（美國B&D公司FAC scalibur）；Biorad 550酶標儀（美國Biorad公司）。

1.2 方法

1.2.1 清熱利濕飲組成及藥液的制備 清熱利濕飲由金銀花30 g、土茯苓30 g、龍膽草9 g、黃芩9 g、梔子 9 g、紫草 15 g、連翹 15 g、生地黃 15 g、牡丹皮15 g、赤芍 15 g、板藍根 30g、車前子 15 g、澤瀉 9 g、當歸9 g、柴胡9 g、甘草9 g組成。

精確稱定上述中藥藥材1 680 g，加10倍量水16 800 mL浸泡30 min，煮沸后繼續(xù)煎煮45 min，過濾藥液待用。將藥渣加8倍量水13 440 mL同法煎煮30 min過濾，合并兩次的濾液，用65%乙醇醇沉24 h，回收乙醇至無醇味，濃縮至每毫升相當于原藥材2 g的清熱利濕飲提取液，0.22 μm超濾膜過濾除菌，4℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆茫毎囵B(yǎng)時用無血清DMEM培養(yǎng)液配制成不同濃度，并將其PH值調(diào)到7.0。

1.2.2 MTT比色法測定TNF-α對HaCaT細胞增殖的影響 HaCaT細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液（CM）傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HaCaT細胞用胰酶消化，吹打成單個細胞懸液，吸入50 mL塑料離心管中，1 000 r/min×10 min，離心，棄上清，CM重懸細胞，調(diào)細胞濃度為2×107/L，將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔，將96孔板置37℃、體積分數(shù)為5%CO2孵箱孵育過夜，使其貼壁，分別將已稀釋的TNF-α加入各相應孔中，100 μL/孔，TNF-α 濃度分別為 1×106μ/L、5×105μ/L、2.5×105μ/L、1.25×105u/L、0.62×105μ/L 和0.31×105μ/L，并設無TNF-α空白CM對照孔，每個藥物濃度均為6復孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后加5 g/L的MTT 10 uL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清100 μL/孔，加入體積分數(shù)為10%的SDS 100 μL/孔過夜，使MTT的還原產(chǎn)物甲臜充分溶解，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔570 nm處的OD值，按下列公式計算細胞的增殖率：增殖率=處理組OD值均數(shù)/空白對照組OD值均數(shù)×100%

1.2.3 流式細胞儀檢測清熱利濕飲提取液對HaCaT細胞周期的影響（PI單染色法） 取對數(shù)生長期的HaCaT細胞常規(guī)消化后接種于100 mL細胞培養(yǎng)瓶中，細胞濃度為1×107/L，37℃、體積分數(shù)為5%CO2孵箱孵育過夜，使其貼壁，次日加入TNF-α終濃度為2.5×105u/L，誘導培養(yǎng)48 h后分別加入MTX和清熱利濕飲提取液，MTX終濃度為5 mg/L,清熱利濕飲提取液濃度分別為 15，12.5，10，7.5，5g/L，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，棄上清，PBS洗一次，用體積分數(shù)為0.25%的胰酶消化5 min，加入PBS輕輕吹打，獲取單個細胞懸液，吸入50 mL離心管中，1 000 r/min，離心10 min，棄上清，加入PBS，將細胞吸入2 mL的EP管中，0.01 mol/L洗2次，棄上清，加入-20℃預冷的70%的乙醇1 mL，次日用PBS再洗2次，棄上清，PBS 調(diào)細胞濃度為 2×1010/L，取細胞懸液 50 μL，加入含RNA酶A的PI染色液500 μL/管，4℃避光染色20 min，上機檢測。

2 結果

2.1 不同濃度不同時相TNF-α對HaCaT細胞增殖的影響 采用MTT比色法觀察24，48，72 h TNF-α對HaCaT細胞增殖效應的影響。不同濃度的TNF-α分別對HaCaT細胞誘導24，48，72 h，與無TNF-α細胞對照組相比，具有一定的增殖活化效應，且這種效應隨著作用時間的延長亦有增強的趨勢，本研究選擇48 h以上作為TNF-α對HaCaT細胞的誘導時間。不同濃度的TNF-α對HaCaT細胞增殖的影響：TNF-α 活性單位為 1×106u/L和 5×105u/L時與HaCaT細胞的增殖呈負相關，即濃度越高其細胞活化效應越弱，推測可能是本研究應用的TNF-α劑量過大對細胞產(chǎn)生了細胞毒作用，導致細胞的增殖活性降低。在TNF-α為2.5×105u/L時HaCaT細胞增殖接近14.11%，達峰值。經(jīng)TNF-α誘導后細胞輪廓清晰，狀態(tài)良好，與未處理組相比增殖速率較快，具有較高的細胞密度和活力。結果表明，在一定的濃度范圍內(nèi)，TNF-α的濃度與HaCaT細胞的增殖呈明顯的劑量依賴關系，故本研究選擇2.5×105u/L作為對HaCaT細胞的誘導劑量。見表1和圖1。

2.2 清熱利濕飲提取液對HaCaT細胞周期的影響

本研究顯示：MTX陽性對照組對HaCaT細胞作用48 h，G1期細胞為65.94%，正常對照和TNF-α對照組分別為49.01%和50.73%，前者高于后者，而S期前者為30.38%，后者為48.22%和46.35%，表明MTX將細胞阻滯于G1期，使其不能進入S期，見圖2～4和表2。中藥清熱利濕飲提取液在低濃度時，G1期和S期細胞與TNF-α組相比無明顯變化，而在12.5 g/L和15 g/L時，G1期細胞與TNF-α組相比細胞明顯減少（38.06%和 25.04%），S期細胞為56.98%和67.90%，比TNF-α對照組增加10.63%和21.55%，表明12.5 g/L和15 g/L清熱利濕飲可使活化的HaCaT細胞周期發(fā)生明顯改變，見圖5～9。

3 討論

HaCaT細胞是正常突變的永生化人角質(zhì)形成細胞株，增生活躍，有絲分裂增多，具有永生性和與角質(zhì)形成細胞相似的增殖、分化特性。遺傳特性穩(wěn)定，不具有成瘤性[2]。張云璧等[3]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α（100 U/孔）能夠刺激角質(zhì)形成細胞生長并對其分泌細胞因子IL-8具有促進作用。

表1 不同時相不同濃度TNF-α對細胞增殖的影響增殖率 （n=6,±s）%

表1 不同時相不同濃度TNF-α對細胞增殖的影響增殖率 （n=6,±s）%

組別 24 h 48 h 72 h 10×105 μ/L 101.67±3.05 103.60±2.69 106.12±2.65 5×105 μ/L 105.00±4.20 108.27±1.84 111.33±3.79 2.5×105 μ/L 109.17±5.28 113.43±4.25 114.11±2.97 1.25×105 μ/L 102.50±3.79 107.66±4.09 108.99±3.05 0.62×105 μ/L 100.83±1.01 104.12±4.37 104.45±1.67 0.31×105 μ/L 96.67±3.96 98.15±3.53 99.56±1.19空白對照組 100.00±4.01 100.00±2.78 100.00±3.02

圖1 TNF-α誘導前后細胞形態(tài)

表2 清熱利濕飲提取液對HaCaT細胞周期的影響(±s)

表2 清熱利濕飲提取液對HaCaT細胞周期的影響(±s)

注:與 TNF-α 組比較，*P<0.05；與 MTX 組比較，△P<0.05。

組別正常細胞組TNF-α組MTX組中藥5 g/L中藥7.5 g/L中藥10 g/L中藥12.5 g/L中藥15 g/L n 3 3 3 3 3 3 3 3細胞百分率（%）G0/G1 S G2/M 49.01±4.01 48.22±2.03 2.77±1.10 50.73±5.32 46.35±5.76 2.92±0.51 65.94±4.84 30.38±1.25 3.68±0.87 57.85±2.08 39.85±4.04△ 2.30±0.30 49.22±2.07 47.35±4.34△ 3.43±1.87 46.59±4.30 49.57±3.93△ 3.84±0.19 38.06±3.52* 56.98±6.91*△ 4.96±0.13 25.04±0.98* 67.90±3.12*△ 7.06±1.67

圖2 正常細胞組

圖3 TNF-α組

圖4 MTX組

圖5 中藥5 g/L組

圖6 中藥7.5 g/L組

圖7 中藥10 g/L組

圖8 中藥12.5 g/L組

圖9 中藥15 g/L組

本次實驗就TNF-α對HaCaT細胞作用的不同濃度和時相進行了觀察，研究發(fā)現(xiàn)，在TNF-α為2.5×105u/L時HaCaT細胞增殖達峰值，而在1.25×105u/L至0.31×105u/L時，隨著TNF-α活性單位的降低，其增殖效應逐漸減弱。得出結論：在一定的范圍內(nèi)，TNF-α的濃度與HaCaT細胞的增殖呈明顯的劑量依賴關系。為了進一步模擬銀屑病的病理過程，造成角質(zhì)形成細胞過度增殖模型，作者選擇TNF-α對HaCaT細胞進行誘導，并把誘導劑量定為2.5×105u/L。在 TNF-α 為 2.5×105/L時，HaCaT細胞的增殖率與無TNF-α的對照組相比增加了14.11%，提示經(jīng)TNF-α誘導后HaCaT細胞與銀屑病表皮細胞的生物學特性更接近。

何彥德[4]應用中藥涼血活血復方（大青葉15 g、生地 30 g、黃芩 12 g、紫草 9 g、丹參 12 g、赤芍 6 g、丹皮9 g、當歸12 g、土茯苓30 g、白蘚皮9 g、荊芥 6 g、雙花20 g）進行了體外細胞實驗。結果顯示不同濃度的涼血活血復方作用于HaCaT細胞48 h，G2/M期細胞百分比與對照組相比明顯增加，G1期百分比減少，細胞阻滯于G2/M期，且隨著藥物濃度增加G2/M期比例不斷上升，G1期比例不斷減少。

本文對細胞周期的實驗結果顯示：MTX陽性對照組對HaCaT細胞作用48 h，G1期細胞為65.94%，S期為30.38%，表明MTX將細胞阻滯于G1期，干擾了DNA的合成，使其不能進入S期；MTX作為細胞內(nèi)二氫葉酸還原酶的競爭抑制劑，造成DNA合成障礙，殺傷處于S期的細胞[5]。清熱利濕飲濃度為12.5 g/L和15 g/L時，G1期細胞與TNF-α組相比細胞明顯減少，S期細胞比TNF-α組增加了10.63%和21.55%。本研究提示雖然較高濃度的清熱利濕飲與MTX兩種藥物對HaCaT細胞周期的敏感時相不同，MTX將HaCaT細胞阻滯于G1期，S期細胞比率下降，清熱利濕飲提取液則將大量細胞阻滯于S期，影響了細胞向G2/M期的過渡，嚴重干擾了細胞進入下一增殖周期，但兩種藥物都是通過干擾細胞周期某一時相的生物合成而抑制細胞的異常分裂和過度增殖[6-8]。

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[3]張云璧,瞿幸,牛福玲,等.常用治療銀屑病的中藥對TNF-α刺激后角質(zhì)形成細胞生長及分泌白介素8的影響[J].中國中西醫(yī)結合皮膚性病學雜志,2006,5（1）:18-20.

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