王維山 史晨輝 何仁豪 周圓家 陳安民 郭風(fēng)勁

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，新疆 石河子 832008)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是嚴(yán)重影響中老年人生活質(zhì)量的疾病之一。目前普遍認(rèn)為肥胖、年齡、解剖結(jié)構(gòu)異常、關(guān)節(jié)創(chuàng)傷病史、關(guān)節(jié)反復(fù)磨損和關(guān)節(jié)的過(guò)度使用都是造成OA發(fā)病的因素，但其具體病因?qū)W仍然不清。關(guān)節(jié)軟骨的再生能力極差，一旦OA病理過(guò)程啟動(dòng)，將逐漸演變?yōu)橐躁P(guān)節(jié)功能障礙為代價(jià)的關(guān)節(jié)疾患。在關(guān)節(jié)軟骨組織降解中，蛋白降解酶發(fā)揮至關(guān)重要的作用，尤其是以尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)為代表的絲氨酸蛋白降解酶系和以基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)為代表的基質(zhì)金屬蛋白酶系作用最明顯〔1～3〕。近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)顯示microRNAs在OA的病變過(guò)程中具有關(guān)鍵性的調(diào)控作用〔4～6〕。miR-27a通過(guò)調(diào)控靶基因uPA、miR-140通過(guò)調(diào)控靶基因MMP-3的表達(dá)參與關(guān)節(jié)軟骨組織的退變過(guò)程。本研究通過(guò)檢測(cè)OA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中 miRNA-140、miRNA-27a、uPA和 MMP-3的表達(dá)情況，探討它們之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 所有病例均選取2011年11月至2012年4月就診于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的住院患者，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)2007年頒布的骨關(guān)節(jié)炎診治指南中OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕，并經(jīng)關(guān)節(jié)鏡術(shù)中證實(shí)軟骨退變。OA組33例，男15例，女18例，年齡43～78歲，平均65.2歲，病程8個(gè)月～22年，平均10.7年。排除標(biāo)準(zhǔn):2個(gè)月內(nèi)服用皮質(zhì)激素類藥物者;患有肝腎功能異常、惡性腫瘤、感染性疾病者;抗“O”、類風(fēng)濕因子陽(yáng)性、血沉、C反應(yīng)蛋白異常者以及妊娠和哺乳期婦女。對(duì)照組均來(lái)自因外傷行截肢的膝關(guān)節(jié)和單純膝外傷行關(guān)節(jié)鏡探查者，入選28例，男13例，女15例，年齡28～66歲，平均51.3歲。術(shù)中獲取標(biāo)本后立即植入液氮中-80℃保存。本實(shí)驗(yàn)得到石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的支持，所有患者均自愿簽定知情同意書(shū)。

1.2 試劑 miRNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol試劑、Real-time PCR試劑盒引物、膠回收純化試劑盒均購(gòu)自美國(guó)ABI公司;引物 miRNA-140、miRNA-27a、uPA、MMP-3及內(nèi)參 U6由美國(guó)ABI公司合成。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 將標(biāo)本約100 mg放于研缽中，加入液氮后迅速研碎，在無(wú)酶EP管中按mirVanaTMmiRNA Isolation Kit中的提取步驟提取總RNA，使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit的操作說(shuō)明將總RNA濃度稀釋為1～10 ng，配備試劑盒中的混合液7 μl/份，與5 μl RNA 樣本、3 μl引物及內(nèi)參U6形成15 μl的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為:16℃ 30 min，42℃30 min，85℃ 5 min。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 按照反應(yīng)體系配置說(shuō)明配備總反應(yīng)液20 μl，其中 TaqMan?2 ×Universal PCR Master Mix，No AmpErase UNG?10 μl;Nuclease-free water 7.76 μl;Product from RT reaction 1.33 μl;Custom TaqMan?Small RNA Assay(20 × )1 μl，每個(gè)樣本設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件為:95℃ 10 min，95℃15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用ABI Prism 7700 system 提供的分析軟件Rotor-Gene real-time PCR analysis software進(jìn)行分析?！鰿t=CtmiRNA-CtU6，以2-△△CT表示每個(gè)miRNA的相對(duì)表達(dá)量，經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)換算后作為統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，各指標(biāo)間相關(guān)性采用Pearson分析。

2 結(jié)果

2.1 滑膜組織中miRNA表達(dá)水平 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)33例OA患者和28例非OA患者滑膜組織中miRNA-27a、miRNA-140、uPA mRNA和MMP-3 mRNA的表達(dá)擴(kuò)增曲線良好，擴(kuò)增效率高。其中miRNA-27a和miRNA-140在OA組中表達(dá)水平(1.63 ±0.93、0.94 ± 0.60)顯著低于對(duì)照組(3.34±1.68、2.55 ±1.12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.121、t=-5.934，P ＜0.001);其中 uPA mRNA 和 MMP-3 mRNA 在 OA組中表達(dá)水平(3.52 ±1.79、4.91 ± 1.86)顯著高于對(duì)照組(1.16 ±0.65、0.84 ± 0.57)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.284、t=8.881，P ＜0.001)。

2.2 滑膜組織中miRNA表達(dá)的相關(guān)關(guān)系 OA組內(nèi)miR-27a和uPA呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=-0.699(P ＜0.01)，miR-140和MMP-3呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=-0.598(P＜0.01);uPA和MMP-3之間也有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為r=0.444(P＜0.05)。對(duì)照組uPA和MMP-3之間也呈相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為r=0.652(P＜0.01)，其他各指標(biāo)相互之間均無(wú)相關(guān)關(guān)系。見(jiàn)圖1。

表1 兩組滑膜組織中miRNA-140、miRNA-27a、uPA、MMP-3之間的相關(guān)關(guān)系

圖1 MMP-3/miRNA-140、uPA/miRNA-27a、uPA/MMP-3之間的相關(guān)關(guān)系

3 討論

OA最基本的病理變化特征是軟骨下骨代謝異常及軟骨組織細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而出現(xiàn)軟骨組織的退變，繼發(fā)出現(xiàn)關(guān)節(jié)周?chē)Y(jié)構(gòu)的病理改變，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙。目前對(duì)OA病因?qū)W及治療研究的側(cè)重點(diǎn)在軟骨下骨的代謝改變及關(guān)節(jié)軟骨的病理性損傷，其中蛋白降解酶的作用已成為眾多學(xué)者公認(rèn)的最基本也最為關(guān)鍵的OA病理機(jī)制，在眾多降解酶系中，uPA和MMP-3的作用最為突出。已有的多方面文獻(xiàn)〔8，9〕證實(shí)，uPA在軟骨退變中發(fā)揮著始動(dòng)因子的作用，是整個(gè)MMPs激活途徑的關(guān)鍵分子。敲除uPA基因的小鼠行蛋白誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型〔10〕，結(jié)果顯示關(guān)節(jié)炎病變程度明顯滯后，且軟骨程度顯著低于野生型小鼠。應(yīng)用uPA抑制劑后發(fā)現(xiàn)〔11〕，通過(guò)外源性u(píng)PA誘導(dǎo)軟骨退變模型只有不到一半的成功率，而未使用抑制劑的動(dòng)物均發(fā)生了軟骨退變。我們前期通過(guò)向兔關(guān)節(jié)注射外源性u(píng)PA發(fā)現(xiàn)，其可快速誘導(dǎo)軟骨降解過(guò)程，周期明顯短于其他蛋白酶的作用過(guò)程〔12〕。由于uPA主要作用底物為Pro-MMP-3，因此其在OA病變過(guò)程中可能與MMP-3的關(guān)系更加密切。我們前期的研究〔13，14〕顯示:在OA滑膜襯里層、滑膜下層細(xì)胞中uPA/uPA mRNA大量表達(dá)，其表達(dá)水平與關(guān)節(jié)退變呈正相關(guān)。在OA關(guān)節(jié)液中，MMP-3表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，也間接說(shuō)明uPA和MMP-3在OA病變中的重要作用。

近年來(lái)隨著非編碼RNA的深入廣泛研究，越來(lái)越多的證據(jù)表明microRNAs在OA軟骨下骨及軟骨組織的生理病理代謝過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用，多位學(xué)者通過(guò)RT-PCR等技術(shù)檢測(cè)了OA患者及健康者軟骨組織、滑膜組織及關(guān)節(jié)液中microRNAs表達(dá)的差異，結(jié)果顯示具有差異表達(dá)的microRNAs較多，通過(guò)驗(yàn)證 microRNAs功能顯示，miR-146a、miR-140、miR-455、miR-9和 miR-27a等均參與了 OA軟骨退變過(guò)程的調(diào)控〔15～18〕。Akhtar等〔19〕研究顯示，miR-27b 通過(guò)上調(diào) MMP13 表達(dá)促進(jìn)軟骨組織的快速退變;另外，miRNA-140可以引起關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β的大量表達(dá)，進(jìn)而參與軟骨的降解過(guò)程〔20〕。

以上研究提示microRNAs、MMPs和uPA在OA軟骨、滑膜病變過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，但他們之間的相互作用關(guān)系尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果表明miR-27a、miR-140、uPA和MMP-3在OA病理變化中起著重要的作用，并且相互之間存在某種調(diào)控關(guān)系。軟骨細(xì)胞在刺激因素的作用下產(chǎn)生miR-140，調(diào)控Pro-MMP-3表達(dá);產(chǎn)生 miR-27a調(diào)控 uPA表達(dá);Pro-MMP-3在uPA磷酸化后變?yōu)橛谢钚缘腗MP-3，Pro-MMP-13在MT-MMP的作用下變?yōu)榛钚訫MP-13，MMP-3和MMP-13又可激活由軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞分泌的Pro-MMP-9轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘腗MP-9，活性MMPs共同作用導(dǎo)致軟骨組織降解。

1 Bian Q，Wang YJ，Liu SF，et al.Osteoarthritis:genetic factors，animal models，mechanisms，and therapies〔J〕.Front Biosci(Elite Ed)，2012;4:74-100.

2 Knapinska A，F(xiàn)ields GB.Chemical biology for understanding matrix metalloproteinase function〔J〕.Chembiochem，2012;13(14):2002-20.

3 Wang X，Li KF，Adams E，et al.Matrix metalloproteinase inhibitors:a review on bioanalytical methods，pharmacokinetics and metabolism〔J〕.Curr Drug Metab，2011;12(4):395-410.

4 Zhang L，Yang M，Marks P，et al.Serum non-coding RNAs as biomarkers for osteoarthritis progression after ACL injury〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2012;20(12):1631-7.

5 Díaz-Prado S，Cicione C，Muióos-López E，et al.Characterization of microRNA expression profiles in normal and osteoarthritic human chondrocytes〔J〕.BMC Musculoskelet Disord，2012;12(13):144-7.

6 Le LT，Swingler TE，Clark IM.The role of MicroRNAs in osteoarthritis and chondrogenesis〔J〕.Arthritis Rheum，2013;65(8):1963-74.

7 中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì).骨關(guān)節(jié)炎診治指南(2007年版)〔J〕.中華骨科雜志，2007;10(10):793-6.

8 van Wart HE，Birkedal HH.The cysteine switch:a principle of regulation of metalloproteinase activity with potential applicability to the entire matrix metalloproteinase gene family〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1990;87(14):5578-82.

9 Busso N，Peclat V，So A，et al.Plasminogen activation in synovial tissues:differences between normal，osteoarthritis，and rheumatoid arthritis joints〔J〕.Ann Rheum Dis，1997;56(9):550-7.

10 Li J，Ny A，Leonardsson G，et al.The plasminogen activator/plasmin system is essential for development of the joint inflammatory phase of collagen type Ⅱ induced arthritis〔J〕.Am J Pathol，2005;166(3):783-92.

11 Jin T，Tarkowski A，Carmeliet P，et al.Urokinase，a constitutive component of the inffamed synovial fluid，induces arthritis〔J〕.Arthritis Res T-her，2003;5(1):9-17.

12 王維山，史晨輝，周卓浩，等.一側(cè)兔膝關(guān)節(jié)注射外源性尿激酶型纖溶酶原激活物引起雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨降解的實(shí)驗(yàn)〔J〕.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007;11(19):3738-41.

13 王 鑫，史晨輝，趙 瑾.骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中uPA、uPAR、PAI-1 mRNA及蛋白的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.臨床骨科雜志，2009;12(2):217-8.

14 管興發(fā)，董金波，王維山，等.骨關(guān)節(jié)炎患者血清及關(guān)節(jié)液中TNF-α與MMP-3含量及臨床意義〔J〕.青島醫(yī)藥衛(wèi)生，2008;40(1):9-12.

15 Hong E，Reddi AH.MicroRNAs in chondrogenesis，articular cartilage，and osteoarthritis:implications for tissue engineering〔J〕.Tissue Eng Part B Rev，2012;18(6):445-53.

16 Jones SW，Watkins G，Le GN，et al.The identification of differentially expressed microRNA in osteoarthritic tissue that modulate the production of TNF-alpha and MMP13〔J〕.Osteoarthritis Cartilage，2009;17(4):464-72.

17 Martinez-Sanchez A，Dudek KA，Murphy CL.Regulation of human chondrocyte function through direct inhibition of cartilage master regulator SOX9 by microRNA-145(miRNA-145)〔J〕.J Biol Chem，2012;287(2):916-24.

18 黃澤宇，沈 彬，裴福興.Micro-RNA在骨關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)矯形外科雜志，2012;20(17):1600-3.

19 Akhtar N，Rasheed Z，Ramamurthy S，et al.MicroRNA-27b regulates the expression of matrix metalloproteinase 13 in human osteoarthritis chondrocytes〔J〕.Arthritis Rheum，2010;62(5):1361-71.

20 Araldi E，Schipani E.MicroRNA-140 and the silencing of osteoarthritis〔J〕.Genes Dev，2010;24(11):1075-80.