陳薇，趙曉娟，王楠楠，劉項(xiàng)楠

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 110001；2.遼寧省人民醫(yī)院血液科，沈陽 110016）

長久以來，胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能缺陷被認(rèn)為是2型糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵因素。近年研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)與脂肪內(nèi)分泌相互作用，從而引起胰島素抵抗和β細(xì)胞功能障礙。因此，對(duì)上述機(jī)制進(jìn)行研究成為實(shí)驗(yàn)研究及臨床治療的一個(gè)熱點(diǎn)。目前由于脂肪組織內(nèi)分泌功能活躍，脂肪內(nèi)分泌學(xué)科已經(jīng)成為內(nèi)分泌學(xué)的一個(gè)嶄新領(lǐng)域。很多的研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞通過活躍的分泌功能在調(diào)節(jié)能量代謝和胰島素抵抗方面發(fā)揮重要作用［1］。Apelin是近年新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，它是Tatemoto等利用反向藥理學(xué)的方法從牛胃的分泌物中提取并純化了的血管緊張素Ⅱ1型受體相關(guān)蛋白（angioten?sinⅡtype 1 receptor?associated protein，APJ）的內(nèi)源性配體［2］。Apelin既受胰島素調(diào)控，又可抑制高血糖刺激下的胰島素分泌［3］。更多直接的證據(jù)表明它能增加胰島素敏感性及周圍組織對(duì)葡萄糖的攝取。但目前對(duì)于Apelin/APJ系統(tǒng)在脂代謝紊亂、胰島素抵抗（insulin risistence，IR）、糖尿病、高血壓、炎癥等病理生理過程中的作用機(jī)制尚不十分清楚。目前，對(duì)于Apelin的研究多圍繞于已發(fā)生2型糖尿病的患者或動(dòng)物模型，本研究定位于最早期出現(xiàn)并伴隨著整個(gè)2型糖尿病發(fā)展過程的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，通過建立胰島素抵抗大鼠模型，測(cè)定其血清胰島素、Apelin?36、游離脂肪酸水平，探討在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)時(shí)是否有Apelin的代償性分泌增加。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量（230±20）g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)中，室溫（23±2）℃，濕度60%左右，明暗交替周期12 h，自由取食水。以基礎(chǔ)飼料（熱量比：蛋白質(zhì)28.58%，脂肪9.59%，碳水化合物61.83%）適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 主要試劑和儀器：胰島素放射免疫分析藥盒購于原子高科技股份有限公司。大鼠Apelin?36 ELISA試劑盒、大鼠游離脂肪酸ELISA試劑盒購自RD公司。胰島素放射免疫分析藥盒購自原子高科技股份有限公司。儀器包括微量輸液泵、全波長酶標(biāo)儀、紫外分光光度儀。

1.2 方法

1.2.1 建立胰島素抵抗大鼠模型：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)據(jù)表分為正常對(duì)照組（NC組，n=15）和胰島素抵抗組（HF組，n=15）。NC組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，HF組給予高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)胰島素抵抗模型。高脂飼料由基礎(chǔ)飼料+豬油+奶粉配制，熱量比為蛋白質(zhì)14%、脂肪59%、碳水化合物27%。配制好的高脂飼料經(jīng)鈷源照射，密封保存。每周檢測(cè)體質(zhì)量，共10周。

1.2.2 高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)：喂養(yǎng)10周后，NC組、HF組各隨機(jī)抽取5只，采用高胰島素—正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)，了解大鼠葡萄糖輸注率的變化，評(píng)估胰島素抵抗模型，具體方法參照文獻(xiàn)［4］。實(shí)驗(yàn)前禁食14 h后，10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔內(nèi)麻醉。麻醉成功后固定，頸部和左腹股溝區(qū)備皮。剪開右側(cè)頸部皮膚及左側(cè)腹股溝皮膚，分離暴露右頸總動(dòng)脈和左股靜脈，然后進(jìn)行右頸總動(dòng)脈和左股靜脈插管，插管成功后固定套管針，左頸總動(dòng)脈接肝素生理鹽水注射器，右股靜脈接三通管后分別接裝有人胰島素注射液（40 mU/mL）和10%葡萄糖注射液的50 mL注射器，再接微量輸液泵，靜置30 min后，頸總動(dòng)脈取血（1 mL）測(cè)基礎(chǔ)血糖和基礎(chǔ)胰島素。首先輸注胰島素，輸注率1.67 mU/（kg·min），每5 min頸總動(dòng)脈取血（1滴）測(cè)血糖。當(dāng)血糖＆lt;（基礎(chǔ)值±0.5）mmol/L時(shí)開始輸注葡萄糖。葡萄糖輸注率（glucose infusion rate，GIR）從4～6 mg/（kg·min）開始，每5 min測(cè)血糖1次，調(diào)整GIR，使血糖保持在（基礎(chǔ)值±0.5）mmol/L。連續(xù)3次血糖都在上述范圍內(nèi)，鉗夾形成。實(shí)驗(yàn)共計(jì)約2 h，計(jì)算60～120 min的平均GIR，以評(píng)價(jià)胰島素的敏感性。

1.2.3 標(biāo)本采集與檢測(cè)：2組各剩余的10只大鼠禁食14 h，測(cè)定空腹尾尖血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）；10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，內(nèi)眥靜脈采血，分離血清，應(yīng)用胰島素放免藥盒檢測(cè)血清胰島素水平，ELISA法測(cè)定血清Apelin?36、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）水平。鉗夾實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剖殺動(dòng)物，完整剝離大鼠附睪脂肪，電子天平稱重，計(jì)算附睪脂肪質(zhì)量占體質(zhì)量的比例（g/g），即附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)。取出腎周組織，剔除血管和其他結(jié)締組織，將脂肪組織清洗后蘸干，用液氮迅速冷凍后，-70℃冰箱保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)節(jié)

喂養(yǎng)10周后行鉗夾實(shí)驗(yàn)，HF組大鼠平均GIR顯著低于 NC 組［（1.17±0.36） mg· kg-1· min-1和（3.72±0.37）mg· kg-1· min-1，P＆lt;0.01］，胰島素抵抗大鼠模型建立成功。

2.2 2組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)比較

大鼠喂養(yǎng)10周后，HF組較NC組體質(zhì)量明顯升高［（582.28±30.77）g和（513.42±41.00）g，P＆lt;0.01］、附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)明顯升高［（1.11±0.96）%和（0.75±0.11）%，P＆lt;0.01］。2組大鼠基礎(chǔ)血糖比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＆gt;0.05）。HF組血清基礎(chǔ)胰島素、Apelin?36及游離脂肪酸較NC組均明顯升高（P＆lt;0.01），見表1。

2.3 2組大鼠檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性分析

血清Apelin?36與基礎(chǔ)胰島素、游離脂肪酸、附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)呈正相關(guān)（r1=0.452，P＆lt;0.05；r2=0.637，P＆lt;0.01；r3=0.756，P＆lt;0.01）。

3 討論

胰島素抵抗是2型糖尿病早期表現(xiàn)，并貫穿于糖尿病始終。胰島素抵抗是指胰島素作用的靶器官對(duì)胰島素作用的敏感性下降。攝食過多（尤其脂肪過多）、體力活動(dòng)不足易導(dǎo)致肥胖及胰島素敏感性降低。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠10周后成功建立胰島素抵抗模型，HF組較NC組體質(zhì)量明顯升高（P＆lt;0.01），高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HF組大鼠平均葡萄糖輸注率顯著低于NC組（P＆lt;0.01），提示高脂攝入能夠成功制成胰島素抵抗和肥胖模型。附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)常用于評(píng)估內(nèi)臟脂肪含量，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高脂飲食明顯高于正常飲食組，提示長期高脂飲食導(dǎo)致的肥胖為內(nèi)臟脂肪性肥胖。此外，研究［5］顯示高胰島素血癥和高游離脂肪酸是肥胖者胰島素抵抗的重要特征，本研究測(cè)得HF組大鼠血清基礎(chǔ)胰島素、游離脂肪酸水平均明顯高于NC組（P＆lt;0.01），與此特征相符。

表1 2組大鼠實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較（±s）Tab.1 Laboratory index contrast of rats between group NC and HF（±s）

表1 2組大鼠實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較（±s）Tab.1 Laboratory index contrast of rats between group NC and HF（±s）

1）P＆lt;0.01 vs NC group.FBG，fasting blood glucose；INS，insulin；FFA，free fatty acid.

Group n Body mass Epididymal FBG INS Apelin?36 FFA（g） fat mass index（%） （mmol/L） （mIU/L） （ng/mL） （μmol/L）NC 10 513.42±41.00 0.75±0.11 5.06±0.47 9.35±2.28 0.53±0.07 264.11±12.59 HF 10 585.28±30.771） 1.11±0.961） 5.28±0.58 14.69±4.431） 0.63±0.051） 301.11±15.601）

利用建立的胰島素抵抗模型，本研究探討了一種新的脂肪因子——Apelin，借此探討其在胰島素抵抗中的變化。Apelin是Tatemoto等［2］發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，Apelin由APLN基因編碼，人類的APLN基因位于染色體Xq25?26［5］，它的基因產(chǎn)物是一種含有77個(gè)氨基酸的多肽原隨后裂解翻譯形成多種激活型包含長度為36、17、13和12的殘基［2］。不同長度的Apelin片段與受體的結(jié)合能力不同，因此發(fā)揮的生理作用也不盡相同。有研究認(rèn)為，Apelin通過細(xì)胞膜上的兩種G蛋白（Gi?、Gq?）［6］、單磷酸腺苷活化蛋白激酶介導(dǎo)的信號(hào)通路［7］及磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸?蘇氨酸蛋白激酶［8］途徑來增加周圍組織的葡萄糖攝取并增加胰島素敏感性。目前對(duì)于糖尿病患者血漿Apelin水平的改變結(jié)論不一，有研究者［9，10］認(rèn)為經(jīng)治2型糖尿病患者血漿 Apelin水平升高；Erdem等［11］認(rèn)為新診斷2型糖尿病患者血漿Apelin水平下降。本研究結(jié)果顯示HF組大鼠血清Apelin水平均明顯高于NC組（P＆lt;0.01）。相關(guān)性分析顯示血清Apelin與基礎(chǔ)胰島素、FFA、附睪脂肪質(zhì)量指數(shù)均呈正相關(guān)。提示在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下已有Apelin的代償性分泌增加，表明Apelin可能與胰島素抵抗相關(guān)，通過復(fù)雜機(jī)制增加葡萄糖攝取及胰島素敏感性。

綜上所述，Apelin作為一種脂肪因子，可能通過復(fù)雜機(jī)制參與調(diào)節(jié)肥胖及胰島素抵抗等病理生理過程，肥胖的胰島素抵抗大鼠血清Apelin水平明顯升高。目前對(duì)于Apelin與胰島素抵抗、肥胖及2型糖尿病的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議，需要進(jìn)行更多的探討和研究。

［1］Trayhum P，Beattie JH.Physiological role of adipose tissues：white adipose tissues as an endocrine and secretory organ［J］.Proc Nutr Soc，2001，60（3）：329-339.

［2］Tatemoto K，Hosoya M，Habata Y，et al.Isolation and characteriza?tion of a novel endogenous peptide ligand for the human APJ recep?tor［J］.Biochem Biophysi Res Commun，1998，251（2）：471-476.

［3］Yue P，Jin H，Aillaud M，et al.Apelin is necessary for the mainte?nance of insulin sensitivity［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，298（1）：E59-67.

［4］白淑亭，趙曉娟，王帆.Curcumin對(duì)胰島素抵抗大鼠抵抗素表達(dá)的影響［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2013，29：618-620.

［5］廖二元.內(nèi)分泌代謝病學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：1213-1281.

［6］Lee DK，Cheng R，Nguyen T，et al.Characterization of apelin，the li?gand for the APJ receptor［J］.J Neurochem，2000，74（1）：34-41.

［7］Yue P，Jin H，Xu S，et al.Apelin decreases lipolysis via G（q），G（i），and AMPK?dependent mechanisms［J］.Endocrinology，2011，152（1）：59-68.

［8］Attané C，F(xiàn)oussal C，Le Gonidec S，et al.Apelin treatment increases complete fatty acid oxidation，mitochondrial oxidative capacity，and biogenesis in muscle of insulin?resistant mice［J］.Diabetes，2012，61（2）：310-320.

［9］Zhu S，Sun F，Li W，et al.Apelin stimulates glucose uptake through the PI3K/Akt pathway and improves insulin resistance in 3T3?L1 ad?ipocytes［J］.Mol Cell Biochem，2011，353（1?2）：305-313.

［10］Li L，Yang G，Li Q，et al.Changes and relations of circulating visfa?tin，apelin，and resistin levels in normal，impaired glucose toler?ance，and type 2 diabetic subjects［J］.Exp Clin Endocrinol Diabe?tes，2006，114（10）：544-548.

［11］Erdem G，Dogru T，Tasci I，et al.Low plasma apelin levels in new?ly diagnosed type 2 diabetes mellitus［J］.Exp Clin Endocrinol Dia?betes，2008，116（5）：289-292.