何平，李紅，李德天，馮國和

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1.腎內(nèi)科；2.心內(nèi)科；3.感染科，沈陽 110004）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)估計(jì)全球范圍內(nèi)有3.5億人是慢性HBV攜帶者［1］。長期以來中國、東南亞和熱帶非洲為高流行區(qū)。自1971年Combes等首先描述了第1例具有持續(xù)HBsAg血癥的患者發(fā)生了膜性腎?。∕N）以來，腎小球腎炎已被公認(rèn)為是HBV感染引起的最常見肝外病變，又稱乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎（HBV?associated glomerulo?nephritis，HBVGN）。既往認(rèn)為，HBVGN的發(fā)病機(jī)制是HBV抗原和抗體形成的循環(huán)免疫復(fù)合物和原位免疫復(fù)合物在腎組織的沉積。但目前認(rèn)為，HBV因其泛嗜性而直接感染腎組織細(xì)胞，產(chǎn)生病毒的殺細(xì)胞效應(yīng)，也是HBVGN重要的發(fā)病機(jī)制之一，同時(shí)也是使用核苷類藥物的理論基礎(chǔ)［2］。

既往認(rèn)為，HBVGN以腎小球損害為主，但近年腎小管—間質(zhì)損害也日益引起重視。腎小管上皮細(xì)胞凋亡與增殖之間的不平衡可能是導(dǎo)致HBVGN中腎小管萎縮和腎功能惡化的重要機(jī)制之一［3］。在針對(duì)HBVGN患者腎穿刺病理研究中，發(fā)現(xiàn)HBVGN患者腎組織中凋亡細(xì)胞明顯增多。腎小管的凋亡細(xì)胞明顯多于腎小球，多數(shù)分布于近端、遠(yuǎn)端腎小管及集合管上皮細(xì)胞，腎間質(zhì)也有少量凋亡細(xì)胞分布。同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl?2也發(fā)生了相應(yīng)的變化［4，5］。證實(shí)了腎小管上皮細(xì)胞凋亡也是HBVGN重要的病理改變之一。但HBVGN中腎小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制并不明確。HBx基因是HBV基因組中最小的開放性編碼框，編碼長度為154個(gè)氨基酸的蛋白?，F(xiàn)已知HBx是一種多功能蛋白，具有反式激活功能，在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)后，它可在細(xì)胞質(zhì)刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子起到轉(zhuǎn)錄激活作用參與宿主細(xì)胞增殖或凋亡過程［6～9］。HBx在HBVGN發(fā)病中的作用和機(jī)制目前已成為HB?VGN發(fā)病機(jī)制研究中的熱點(diǎn)問題之一［10～12］。張瑜等［13］將HBx真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至足細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HBx基因可抑制足細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。但HBx基因?qū)δI小管上皮細(xì)胞增殖及凋亡的影響，國內(nèi)尚未見報(bào)道。

在本研究中，我們通過構(gòu)建HBx基因真核表達(dá)載體，研究其對(duì)體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞（HK?2）的生物學(xué)行為的影響及可能機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究HBx基因在HBVGN發(fā)病機(jī)制中的作用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及細(xì)胞株

質(zhì)粒pCDNA3.1?HBx由本室構(gòu)建、保存。HK?2細(xì)胞株購自北京中原公司（美國ATCC中國大陸總代理）。

1.2 主要試劑

兔抗HBx單克隆抗體購自Chemicon公司；Bcl?2、Bax多克隆抗體購自Santa Cruz公司。CCK8及AnnexinV/PI雙染試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、實(shí)驗(yàn)分組

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，應(yīng)用Li PofectamineTMLTX＆PLUSTM轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司），按照說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用與PcDNA3.1（+）HBx大小接近的PEGFP?C1熒光質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，評(píng)估目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。將培養(yǎng)瓶中生長處于對(duì)數(shù)生長期的腎小管上皮細(xì)胞接種在24孔培養(yǎng)板中，每孔500 μL，細(xì)胞數(shù)約1×105μL。次日清晨觀察培養(yǎng)板中的細(xì)胞生長良好，達(dá)到80%～90%融合。根據(jù)質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑比例不同，設(shè)置3個(gè)組別。第1組：1 μ g質(zhì)粒+2 μL PLUS∶2 μL LTX；第2組：1 μg質(zhì)粒+2 μ L PLUS∶3 μL LTX；第3組：1 μg質(zhì)粒+2 μL PLUS∶4 μ L LTX。24 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。每孔隨即取10個(gè)視野，在同個(gè)視野內(nèi)通過將熒光跟白光對(duì)比，然后細(xì)胞計(jì)數(shù)，按熒光/白光細(xì)胞數(shù)×100%得出轉(zhuǎn)染效率。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分5組：（1）對(duì)照組（control）；（2）轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒PCDNA3.1（+）組（PCDNA3.1+）；（3）轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PCDNA3.1（+）HBx 24 h組（24 h）；（4）轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PCDNA3.1（+）HBx 48 h組（48 h）；（5）轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PCD?NA3.1（+）HBx 72 h組（72 h）。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)

各組細(xì)胞在蓋玻片上生長融合達(dá)到85%～95%時(shí)，從孵箱中取出。用PBS洗后，4%的甲醛固定。0.5%Triton X?100 37℃溫箱透化20 min。血清封閉后，分別加一抗 Bcl?2（1∶160）、Bax（1∶320）濕盒里，4℃過夜。PBS洗后，加相應(yīng)二抗。滴加生物素酶后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)。脫水、透明、封片、觀察。

1.5 Western印跡

實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞胰酶消化，收獲細(xì)胞后，用含有PMSF的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。細(xì)胞提取物用BCA法測(cè)定濃度。等量上樣，用12%的SDS?PAGE凝膠電泳分離。之后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉后，分別加入一抗：HBx（1∶1 000，Chemicon公司）、Bcl?2（1∶500，Santa Cruz公司）、Bax（1∶1 000，Santa Cruz公司），4℃搖床孵育過夜。加入相應(yīng)二抗，進(jìn)行ECL反應(yīng)。一次性完成定影、顯形、圖像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶的灰度值。

1.6 細(xì)胞增殖測(cè)定

CCK8法檢測(cè)HBx基因?qū)K?2細(xì)胞增殖的抑制作用。消化收集細(xì)胞并接種于3張96孔板。接種過夜后，分別為對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染PCD?NA3.1（+）HBx組。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。結(jié)束培養(yǎng)前2 h每孔加CCK8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)波長450 nm的每孔光密度值（OD值）。細(xì)胞生存率、增殖抑制率按如公式計(jì)算：生存率=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%，抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.7 細(xì)胞凋亡測(cè)定

對(duì)數(shù)生長期HK?2細(xì)胞接種于6孔板，后轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及PCDNA3.1（+）HBx，分別于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，直接在倒置顯微鏡下觀察。

應(yīng)用AnnexinV?FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。用無EDTA胰酶消化收集各組細(xì)胞。離心、PBS洗滌細(xì)胞3次。用500 μL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×106/mL。在細(xì)胞懸浮液中加入5 μL AnnexinV?FITC輕輕混勻，4℃冰箱避光孵育30 min。加入5 μL PI后輕輕混勻4℃避光條件下孵育5 min。隨即用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)（最遲1 h內(nèi)）。結(jié)果用Cellquest專業(yè)軟件獲取分析數(shù)據(jù)。AnnexinV?FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)可將實(shí)驗(yàn)樣本中正常、壞死、凋亡細(xì)胞區(qū)分開。以FITC和PI熒光作雙參數(shù)點(diǎn)圖，細(xì)胞分為4個(gè)象限，左下象限：AnnexinV?FITC?、PI?，代表正?；罴?xì)胞；左上象限：AnnexinV?FITC?、PI+，代表機(jī)械損傷細(xì)胞；右下象限：AnnexinV?FITC+、PI?，代表早期凋亡細(xì)胞；右上象限：AnnexinV?FITC+、PI+，代表晚期凋亡/壞死細(xì)胞。分別計(jì)數(shù)各組細(xì)胞凋亡率并進(jìn)行組間比較。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

2 結(jié)果

2.1 目的質(zhì)粒PCDNA3.1（+）HBx的轉(zhuǎn)染效率評(píng)估

通過PEGFP?C1的轉(zhuǎn)染效率評(píng)估PCDNA3.1（+）HBx的轉(zhuǎn)染效率，可見第3組轉(zhuǎn)染效率最高，大概為40%～60%，后續(xù)實(shí)驗(yàn)按照此孔量進(jìn)行轉(zhuǎn)染。結(jié)果見圖1。

圖1 各組轉(zhuǎn)染效率比較 ×100Fig.1 Comparison of transfection efficiency in each group×100

2.2 HBx基因轉(zhuǎn)染后在HK?2細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染PCDNA3.1（+）HBx 24 h、48 h及72 h組在預(yù)期的17 kDa出現(xiàn)一條明顯條帶。表明HBx基因在HK?2細(xì)胞得到了表達(dá)。轉(zhuǎn)染目的基因24 h及48 h，蛋白表達(dá)量無明顯區(qū)別（P＆gt;0.05）。轉(zhuǎn)染目的基因72 h后，蛋白表達(dá)水平最高，與24 h、48 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）?？蛰d體轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染組未見相應(yīng)蛋白條帶，結(jié)果見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染HBx基因后，凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl?2比值顯著增高

細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl?2、Bax表達(dá)。Bcl?2在各組細(xì)胞中均有表達(dá)。在對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組均呈高水平表達(dá)，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＆gt;0.05）。轉(zhuǎn)染Pc?DNA3.1（+）HBx 24 h后，Bcl?2表達(dá)水平開始下降，Bax表達(dá)水平明顯上升，Bax/Bcl?2比值顯著增高，至轉(zhuǎn)染后72 h，升至最高。轉(zhuǎn)染Pc?DNA3.1（+）HBx各組間及與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05），見圖3，圖4。

WB方法檢測(cè)Bcl?2、Bax表達(dá)。在對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組均呈較高水平表達(dá)，2組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

異（P＆gt;0.05）。轉(zhuǎn)染Pc?DNA3.1（+）HBx 24 h后，Bcl?2表達(dá)水平開始下降，Bax表達(dá)水平開始增加，Bax/Bcl?2比值顯著增高，至轉(zhuǎn)染后72 h，升至最高。轉(zhuǎn)染Pc?DNA3.1（+）HBx各組間及與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05），見圖5、圖6。

圖3 對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染HBx 24 h、48 h、72 h后各組細(xì)胞免疫化學(xué)Bcl?2表達(dá) ×200Fig.3 Immunohistochemical analysis of Bcl?2 expression in the each group ×200

圖4 對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染HBx 24 h、48 h、72 h后各組細(xì)胞免疫化學(xué)Bax表達(dá) ×200Fig.4 Immunohistochemical analysis of Bax expression in each group×200

2.4 轉(zhuǎn)染HBx基因后，對(duì)HK?2細(xì)胞增殖抑制作用

轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞存活率與對(duì)照組無明顯差別（P＆gt;0.05），提示對(duì)細(xì)胞無明顯增殖抑制作用。轉(zhuǎn)染PCDNA3.1（+）HBx24 h后，對(duì)細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，達(dá)到（14.08±2.14）%，與對(duì)照組相比，差異具有顯著性（P＆lt;0.05）。轉(zhuǎn)染PCDNA3.1（+）HBx 48 h后，細(xì)胞的增殖抑制率顯著增加，達(dá)到（31.33±2.24）%，與對(duì)照組、轉(zhuǎn)染PCDNA3.1（+）HBx24 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）。轉(zhuǎn)染72 h后，細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（35.27±1.10）%，與對(duì)照組、轉(zhuǎn)染PCDNA3.1（+）HBx 24 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）；但與轉(zhuǎn)染48 h比較無明顯差異（P＆gt;0.05）。

2.6 轉(zhuǎn)染HBx基因后，引起HK?2細(xì)胞凋亡

倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。對(duì)照組細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞密度較大，形態(tài)基本正常；而轉(zhuǎn)染PCDNA3.1（+）HBx后各時(shí)間點(diǎn)各組出現(xiàn)細(xì)胞增殖受抑，細(xì)胞密度變??；凋亡細(xì)胞的體積變小、變圓，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、脫落，見圖7。

圖5 各組細(xì)胞Bcl?2、Bax的Western?blot條帶Fig.5 Western blot bands of Bcl?2 and Bax in each group

圖6 各組細(xì)胞Bax/Bcl?2比值Fig.6 The ratio of Bax/Bcl?2 in each group

圖7 倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài) ×100Fig.7 Cell morphology in each group using inverted microscope×100

流式細(xì)胞儀檢測(cè)HBx基因?qū)?xì)胞凋亡的影響。對(duì)照組HK?2細(xì)胞凋亡率為（5.82±1.62）%；轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率為（5.91±1.09）%；轉(zhuǎn)染PCD?NA3.1（+）HBx 24 h組細(xì)胞的凋亡率為（15.12±1.98）%；轉(zhuǎn)染PCDNA3.1（+）HBx 48 h組細(xì)胞的凋亡率（21.62±2.23）%；PCDNA3.1（+）HBx 72 h組細(xì)胞的凋亡率為（23.80±2.16）%。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組凋亡率較對(duì)照組無明顯變化。轉(zhuǎn)染PCDNA3.1（+）HBx后各組細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組凋亡率均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）。轉(zhuǎn)染48 h較轉(zhuǎn)染24 h組凋亡率顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）。但轉(zhuǎn)染48 h與轉(zhuǎn)染后72 h無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖8、圖9。

圖8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率Fig.8 Apoptosis rates in each group as determined by flow cytometry

圖9 各組細(xì)胞凋亡率比較柱狀圖Fig.9 Comparison of the apoptosis rates in each group

3 討論

HBVGN是中國兒童繼發(fā)性腎臟損害最常見的病因［14］，近年來研究報(bào)道HBV相關(guān)核酸分子在腎組織的存在和意義，發(fā)現(xiàn)HBVGN患者腎臟中存在HBV?DNA，HBV?RNA 和閉合環(huán)狀雙鏈DNA（cccD?NA），甚至完整的病毒顆粒［15～17］，進(jìn)一步支持了HBV可直接感染腎臟并原位復(fù)制而致病的觀點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了HBx基因的真核表達(dá)載體PCDNA3.1（+）HBx，為進(jìn)一步研究HBx對(duì)腎臟固有細(xì)胞的作用及其在HBVGN發(fā)病中的作用和意義奠定了重要基礎(chǔ)。

現(xiàn)有的研究表明，HBx蛋白與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。然而，針對(duì)不同種類的細(xì)胞及不同的外界條件，HBx調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制也各不相同［18］。HK?2細(xì)胞是正常人近端腎小管上皮細(xì)胞株，具有人類腎小管上皮細(xì)胞的標(biāo)志及生理、生化特性本研究以體外培養(yǎng)的HK?2細(xì)胞株為研究對(duì)象，通過應(yīng)用CCK8、透射電鏡及流式細(xì)胞儀等檢測(cè)方法探討HBx基因?qū)K?2增殖和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HBx基因后，抑制了HK?2細(xì)胞的增殖、促進(jìn)了其凋亡。在轉(zhuǎn)染后72 h，HK?2細(xì)胞凋亡率最高。我們的研究證明了HBx基因可以導(dǎo)致體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而更深入研究凋亡相關(guān)蛋白Bax及Bcl?2的表達(dá)。

細(xì)胞凋亡是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞程序性死亡，是從細(xì)胞外信號(hào)—細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路—凋亡相關(guān)基因和酶的復(fù)雜過程［19］。研究表明，多種腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展除與細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系外，還伴隨著凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化［20，21］，Bcl?2家族的成員是細(xì)胞凋亡整合期決定細(xì)胞生存和死亡信號(hào)至關(guān)重要的整合因子，其中Bcl?2是一種抗凋亡蛋白；而Bax與Bcl?2的作用相反，是一個(gè)典型的促凋亡蛋白。因此Bax和Bcl?2二者的表達(dá)水平及Bax/Bcl?2比值則成為影響細(xì)胞生存的重要因素。Bax/Bcl?2比值增高決定了細(xì)胞走向死亡并進(jìn)入細(xì)胞凋亡的執(zhí)行期，通過一系列復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)及細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［22］。在糖尿病腎病和梗阻性腎病動(dòng)物模型中已檢測(cè)到凋亡蛋白Bax/Bcl?2的異常表達(dá)。在原發(fā)性腎臟疾病患者的腎組織中也發(fā)現(xiàn)Bax的表達(dá)隨腎小管間質(zhì)病變的加重而增加。環(huán)孢素A所致腎毒性機(jī)制研究及實(shí)驗(yàn)性腎小管壞死（ATN）模型中，發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞Bax表達(dá)增加［23］。在急性腎小管排異的研究中發(fā)現(xiàn)小管上皮細(xì)胞Bcl?2表達(dá)水平下降，Bax表達(dá)水平上升，同時(shí)伴隨細(xì)胞凋亡的增加。提示凋亡相關(guān)基因Bcl?2和Bax在原發(fā)和繼發(fā)性腎臟疾病的進(jìn)展中起著重要作用。孫莉靜等［4］分析HBV?GN患者腎臟病理資料時(shí)發(fā)現(xiàn)，HBV?GN患者較對(duì)照組腎細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加，凋亡細(xì)胞多分布于近端、遠(yuǎn)端腎小管及集合管上皮細(xì)胞。HBV?GN患者Bcl?2主要在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)；Bax在腎小球、腎小管均有表達(dá)，與對(duì)照組相比，Bax表達(dá)水平明顯上升。提示在HBVGN中，伴隨著凋亡細(xì)胞增加，凋亡相關(guān)蛋白Bax及Bcl?2表達(dá)水平也發(fā)生了相應(yīng)的變化。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBx基因24 h后，Bcl?2表達(dá)水平顯著下降，Bax水平顯著增加，Bax/Bcl?2比值明顯增高，細(xì)胞凋亡率顯著增加，與孫莉靜［4］等人的HBVGN臨床病理研究結(jié)果是一致的。本實(shí)驗(yàn)有助于對(duì)HBVGN中腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡相關(guān)作用機(jī)制的闡明；進(jìn)一步證明了HBx基因通過上調(diào)Bax/Bcl?2比值，引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡；同時(shí)豐富了HBVGN發(fā)病機(jī)制中HBV直接損傷的致病理論。本實(shí)驗(yàn)是以永生細(xì)胞株為研究對(duì)象，故進(jìn)一步深入研究仍待繼續(xù)。

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