關(guān)寧，王超，霍曉川，顧立學(xué)，羅俊生

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，遼寧 錦州 121001）

膽固醇脂水解酶（human cholesteryl ester hydro?lase，hCEH）存在于人體的各種組織中（肝臟、心臟、肺臟、小腸、脾臟等），以肝臟中含量最多，主要用于水解膽固醇酯為游離膽固醇，并通過細(xì)胞表面通道蛋白將游離釋放，減少膽固醇酯在細(xì)胞內(nèi)的蓄積，而ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ATP?binding cassette transporter A1，ABCA1）和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1（ATP?binding cassette transporter G1，ABCG1）是細(xì)胞膜上兩種主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中ABCA1能促進(jìn)膽固醇和磷脂從細(xì)胞釋放到載脂蛋白A?Ⅰ（apolipopro?tein A?Ⅰ，apoA?Ⅰ），而ABCG1可以促進(jìn)膽固醇外流至細(xì)胞外高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）受體［1］，從而借助受體蛋白將肝外游離膽固醇運(yùn)送回肝臟進(jìn)行最終的清除。本實(shí)驗(yàn)通過先前構(gòu)建的hCEH重組腺病毒載體［2］，轉(zhuǎn)染RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞，觀察hCEH對(duì)泡沫細(xì)胞的影響及hCEH上調(diào)ABCA1和ABCG1表達(dá)的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，Lenti?hCEH?IRES?EGFP慢病毒載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，氧化型低密度脂蛋（ox?LDL）購(gòu)自北京協(xié)生生物科技有限公司，RIPA裂解液、BCA、PMSF蛋白濃度測(cè)定試劑盒，內(nèi)參照β?actin購(gòu)自Santa Cruz公司，ABCA1兔多克隆一抗、ABCG1兔多克隆一抗、羊抗人CEH一抗均購(gòu)自Abcam公司。

1.2 單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒轉(zhuǎn)染

將RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞株置于無菌培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%分別加入100 μL目的及對(duì)照病毒液，同時(shí)加入終濃度為8 μg/mL的佛波酯促進(jìn)感染。同時(shí)設(shè)立hCEH組（vector組）作為對(duì)照。

1.3 細(xì)胞泡沫化

取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106/mL，加入6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。加入ox?LDL，濃度為100 mg/L，與單核巨噬細(xì)胞共同孵育，誘導(dǎo)其泡沫化。

1.4 油紅O染色和脂質(zhì)染色的半定量分析

分別于4 h、8 h、12 h和16 h用10%甲醛將細(xì)胞固定細(xì)胞，再用油紅O方法染色10 min，蘇木素染色5 min，1%HC1分色及返藍(lán)后，水洗5 min水性封片劑封片并照相。按Wads［3］方法進(jìn)行脂質(zhì)染色的半定量分析，即細(xì)胞內(nèi)脂滴面積＆lt;細(xì)胞核面積記為“-”，細(xì)胞內(nèi)脂滴面積≥細(xì)胞核面積記為“+”，每孔計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。

1.5 高效液相色譜（high performance liquid chro?matography，HPLC）法

各組細(xì)胞處理結(jié)束后去除培養(yǎng)基，PBS液沖洗3遍，反復(fù)凍融細(xì)胞，并在冰浴中用超聲裂解。膽固醇使用外標(biāo)法峰面積定量細(xì)胞蛋白（mg/g）。色譜條件為色譜柱：C18；流動(dòng)相：異丙醇∶正庚烷∶乙腈（35∶12∶52，v/v），非梯度洗脫，流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，檢測(cè)到第8分鐘，柱溫保持20℃。用CEH水解膽固醇酯得總膽固醇量，以HPLC測(cè)定膽固醇并定量，以“總膽固醇量-游離膽固醇量”代表膽固醇酯的含量（mg/g）。

1.6 Western blot檢測(cè)CEH、ABCA1、ABCG1蛋白質(zhì)的表達(dá)

經(jīng)泡沫化處理后，將細(xì)胞用細(xì)胞刮刀刮下，收集至EP管內(nèi)。用TBS漂洗后加入RIPA緩沖液（1%NP40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，0.1%PMSF）裂解細(xì)胞。于4℃離心10 min，棄除沉淀，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。加熱使蛋白質(zhì)變性，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果，并確定蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)位置。5%脫脂奶粉封閉過夜，分別加入1∶200稀釋的羊抗人CEH一抗、1∶500 ABCA1兔多克隆一抗、1∶2 500 ABCG1兔多克隆一抗，β?actin作為內(nèi)參，4℃培育過夜。TBST洗膜后加入FITC一標(biāo)記的羊抗兔二抗或辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊二抗。溫育l h，TBST洗膜后進(jìn)行BCIP/NBT顯色，采用Chemi?genius凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 hCEH在RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞中的表達(dá)

Lenti?hCEH?IRES?EGFP慢病毒轉(zhuǎn)染RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞后，在24 h便可以觀察到少量的細(xì)胞有熒光表達(dá)，48 h后明顯增加，72 h接近50%，熒光細(xì)胞數(shù)最多。我們應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后hCEH mRNA在巨噬細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果可見，hCEH蛋白大量表達(dá)，而vector組無條帶（圖1）。

圖1 Western blot分析hCEH蛋白質(zhì)的表達(dá)Fig.1 Protein expression of hCEH by Western blot

2.2 hCEH對(duì)細(xì)胞膽固醇代謝的影響

油紅O染色結(jié)果顯示：0 h，陽(yáng)性染色細(xì)胞遍布，細(xì)胞質(zhì)紅染，細(xì)胞核呈藍(lán)染，且細(xì)胞體積增大，呈圓形或不規(guī)則形；4 h，胞質(zhì)紅染變淡；8 h，油紅O染色陽(yáng)性細(xì)胞大量減少，細(xì)胞核藍(lán)染，隨后陽(yáng)性細(xì)胞越來越少，逐漸消失，見圖2。油紅O染色0 h、4 h、8 h、12 h、16 h陽(yáng)性細(xì)胞分別為（86.70±3.19）%、（46.50±1.62）%、（15.64±2.57）%、（13.68±2.60）%、（12.73±1.47）%。與4 h比較，8 h、12 h和16 h陽(yáng)性細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）；而12 h和16 h比較陽(yáng)性細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆gt;0.05）。

圖2 油紅O染色示不同時(shí)間段ABCA1和ABCG1表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響 ×400Fig.2 The change of foam cells were detected at 0，4，8，12，16 hour after the formation of foam cell，Oil Red O stain was used to visualize lipid droplets in foam cells×400

HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示：隨著時(shí)間增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯、游離膽固醇和總膽固醇含量逐漸下降，與4 h比較，8 h、12 h、16 h膽固醇酯、游離膽固醇和總膽固醇含量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05），而12 h、16 h指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆gt;0.05），見表2。

表2 高效液相色譜分析不同時(shí)間段游離膽固醇、膽固醇酯和總膽固醇含量（mg/g）Tab.2 The cellular free cholesterol，total cholesterol and cholesterol ester by HPLC（mg/g）

2.3 ABCA1和ABCG1對(duì)細(xì)胞膽固醇代謝的影響

Western blot結(jié)果顯示：ABCA1和ABCG1表達(dá)逐漸增加，8 h達(dá)高峰，之后逐漸減少，見圖3。

圖3 Western blot分析不同時(shí)間段ABCA1和ABCG1蛋白質(zhì)的表達(dá)Fig.3 Protein expression of ABCA1 and ABCG1 by Western blot

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化的防治從宏觀角度看，膽固醇逆行轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport，RCT）過程將肝外游離膽固醇運(yùn)送回肝臟并最終清除；從微觀角度看，細(xì)胞表面通道蛋白（如ABCA1和ABCG1）的表達(dá)，在不同程度上也促進(jìn)了RCT的進(jìn)程。然而，膽固醇穩(wěn)態(tài)的維持是通過許多途徑來調(diào)節(jié)的，清道夫受體CD36和SR?A相關(guān)聯(lián)的膽固醇內(nèi)流起到很重要的作用，但維持這種穩(wěn)態(tài)最重要的途徑是膽固醇外流，包括水溶擴(kuò)散和細(xì)胞膜微溶解，內(nèi)生的載脂蛋白E，細(xì)胞外膽固醇受體apoA?Ⅰ和HDL，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCA1和ABCG1均有效地增加了膽固醇外流［4］。這種膽固醇攝取和排出的平衡一旦打破，泡沫細(xì)胞就會(huì)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展中大量產(chǎn)生［5］。

ABCA1和ABCG1都是LXR轉(zhuǎn)錄因子的作用靶點(diǎn)，均需要消耗ATP作為能量運(yùn)輸血脂和其他代謝產(chǎn)物。有研究表明，用米非司酮（ABCA1的激動(dòng)劑）處理轉(zhuǎn)染ABCA1細(xì)胞后，膽固醇的流出會(huì)顯著增加，而沒有加入apoA?Ⅰ或者未經(jīng)過米非司酮處理的細(xì)胞膽固醇流出無明顯增加［6］，說明ABCA1通過apoA?Ⅰ發(fā)揮作用。OX?LDL能使巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出增多，而HDL是清除過多膽固醇的重要受體。使用3H?膽固醇與轉(zhuǎn)染ABCG1的細(xì)胞和血漿膽固醇共孵育，發(fā)現(xiàn)這一過程中，膽固醇不是流出到apoA?Ⅰ，而是流出到HDL上［7，8］，說明ABCG1是通過HDL起作用。

ABCA1和ABCG1在巨噬細(xì)胞的RCT過程中起重要的作用。增加巨噬細(xì)胞的ABCA1和ABCG1蛋白表達(dá)水平后，在糞便和血漿中的膽固醇有明顯增加。用藥物抑制ABCAl介導(dǎo)的膽固醇流出途徑，膽固醇流出量下降了40%；檢測(cè)敲除ABCG1基因的小鼠，膽固醇流出量比正常下降 15%［9，10］。

本實(shí)驗(yàn)成功將hCEH轉(zhuǎn)染入RAW 264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)到轉(zhuǎn)染Lenti?hCEH?IRES?EGFP后hCEH蛋白在小鼠單核巨噬細(xì)胞的表達(dá)。泡沫化的hCEH組隨著時(shí)間增加油紅O染色陽(yáng)性細(xì)胞比例逐漸減少，HPLC顯示細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯、游離膽固醇和總膽固醇含量逐漸下降，在8 h，游離膽固醇含量由4 h的（27.46±1.32）mg/g降至（19.59±2.96）mg/g，膽固醇酯含量由4 h的（31.31±4.26）mg/g降至（9.34±1.35）mg/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05），說明在8 h，膽固醇酯降解、游離膽固醇流出增加。然而，Western blot結(jié)果顯示：在8 h，AB?CA1和ABCG1的表達(dá)顯著增加，說明ABCA1和ABCG1可以有效減少膽固醇酯在細(xì)胞內(nèi)聚集并加強(qiáng)游離膽固醇的流出，抑制細(xì)胞泡沫化。

本實(shí)驗(yàn)表明，ABCA1和ABCG1是炎癥和RCT之間的分子基礎(chǔ)，而hCEH mRNA的表達(dá)對(duì)這一過程起到了激活作用，不斷促進(jìn)膽固醇外流，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成，從而減少心腦血管梗死的發(fā)生。

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