姚朝峰，王長(zhǎng)松，王 鋒

ASPP1、ASPP2和 ASPP家族抑制成員 （inhibitory member of the ASPP family，iASPP）均屬于p53凋亡刺激蛋白 （apoptosis－stimulating protein of p53，ASPP）家族成員［1］，ASPP1／ASPP2 主要與 p53結(jié)合共同調(diào)節(jié)p53蛋白的生物學(xué)活性，促使細(xì)胞在發(fā)生DNA損傷后進(jìn)入凋亡程序；iASPP的功能則截然相反，它主要競(jìng)爭(zhēng)性地與p53蛋白結(jié)合，抑制野生型p53蛋白的促細(xì)胞凋亡活性，具有癌基因的特點(diǎn)。鑒于iASPP的生物學(xué)活性，深入研究iASPP在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)模式及對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，則有可能改變腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)，為高表達(dá)iASPP腫瘤的治療和預(yù)后提供一種新的思路。本文分析了iASPP在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)，同時(shí)對(duì)iASPP陽(yáng)／陰性乳腺癌患者的生存時(shí)間進(jìn)行了分析。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集解放軍第150醫(yī)院1999年01月—2010年12月收治的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的臨床資料，選取其中具有完整臨床和隨訪資料的89例作為研究對(duì)象。采用電話隨訪形式，隨訪至患者病死或截止日期（2010年12月）。術(shù)后2年內(nèi)隨訪 1次／3個(gè)月，3～5年隨訪 1次／6個(gè)月，5年后隨訪1次／12個(gè)月。隨訪內(nèi)容包括患者術(shù)后治療經(jīng)過(guò)，復(fù)查時(shí)間及結(jié)果，腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時(shí)間、部位，最終生存狀況?；颊呔鶠榕越?rùn)性導(dǎo)管癌，年齡27～79歲，中位年齡53．2歲。所有患者均接受了乳腺癌改良根治術(shù)。除7例難以耐受化療不良反應(yīng)外，其余均按照臨床標(biāo)準(zhǔn)化化療方案完成了6～9個(gè)療程的化療。中位隨訪時(shí)間為29個(gè)月（3～96個(gè)月）。

1．2 免疫組化檢測(cè) 標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛液固定，常規(guī)HE切片染色。免疫組化采用EnVision二步法，濃縮型抗iASPP抗體購(gòu)自Abcam公司，經(jīng)1∶100稀釋后應(yīng)用。加入稀釋的iASPP多抗10 μl，置37℃孵箱中孵化30 min，以生理鹽水代替一抗作陰性對(duì)照；用 0．01M PBS 漂洗 3 次，加入二抗工作液 10 μl，室溫下孵化 30 min；用 0．01M PBS漂洗 3次，加入DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察，待出現(xiàn)特異性的棕色顆粒后終止顯色，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性、陰性對(duì)照。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件中的Kaplan－Meier進(jìn)行生存分析，以 P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中iASPP的表達(dá) 89例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中有76例表達(dá)iASPP（85．4%），13 例不表達(dá)（14．6%），見圖1。

圖1 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者iASPP的表達(dá)

2．2 生存分析 至隨訪結(jié)束，iASPP陽(yáng)性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者病死17例（33．3%），iASPP陰性乳腺癌患者死亡 4 例（10．5%）。通過(guò) Kaplan－Meier法計(jì)算生存率得 χ2＝4．627，P＝0．031，兩組的生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 iASPP陽(yáng)／陰性乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者生存時(shí)間比較

3 討 論

野生型p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是機(jī)體對(duì)抗腫瘤的一種重要防御機(jī)制。細(xì)胞DNA損傷后，野生型p53基因的表達(dá)會(huì)大幅度增加，產(chǎn)生較多的p53蛋白，促進(jìn)受損細(xì)胞發(fā)生凋亡或停滯于S期進(jìn)行修復(fù)。野生型p53蛋白是如何決定DNA受損細(xì)胞進(jìn)入修復(fù)程序或凋亡程序的？ASPP家族成員的發(fā)現(xiàn)則很好地回答了此問(wèn)題［1］。ASPP家族成員包括ASPP1、ASPP2和iASPP，三者在結(jié)構(gòu)上極為相似，即都具有3個(gè)典型的特征性結(jié)構(gòu)：4個(gè)錨蛋白重復(fù)序列，SH3結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域［2］，其中SH3是其與p53結(jié)合的必需結(jié)構(gòu)；缺少SH3結(jié)構(gòu)域和／或錨蛋白重復(fù)序列的截?cái)嘈蚷ASPP都不能與p53蛋白結(jié)合，因此也不具有抑制細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能。盡管三者均可與p53蛋白結(jié)合，但作用卻截然不同。在 ASPP1／ASPP2 存 在 時(shí) ，ASPP1／ASPP2 首 先 與p53結(jié)合，誘導(dǎo)p53蛋白與凋亡基因啟動(dòng)子的親和性發(fā)生改變，使DNA受損細(xì)胞走向凋亡。ASP1／ASPP2結(jié)構(gòu)的微小變化即可引起p53蛋白的功能發(fā)生顯著變化，進(jìn)而影響p53蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。iASPP則主要抑制p53蛋白的促細(xì)胞凋亡活性，抑制瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

ASPP蛋白家族的發(fā)現(xiàn)對(duì)腫瘤的發(fā)病機(jī)制、治療和預(yù)后有著重要影響，通過(guò)抑制iASPP的表達(dá)可大幅度提高腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡；同時(shí)阻斷iASPP后也將促使p53蛋白與ASPP1／ASPP2結(jié)合，促進(jìn)DNA受損細(xì)胞凋亡。研究顯示在淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞株MCF－7中采用siRNA技術(shù)抑制iASPP的表達(dá)可以顯著增加瘤細(xì)胞的凋亡率［3－5］。iASPP 對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖和生存是必需的，可能會(huì)成為前列腺癌治療的靶標(biāo)［6］，iASPP 在肝細(xì)胞肝癌［7］和膠質(zhì)瘤細(xì)胞［8］的增殖中也起關(guān)鍵性的作用，iASPP可能是這些腫瘤治療的潛在靶標(biāo)。通過(guò)下調(diào)內(nèi)源性iASPP的表達(dá)能增加白血病細(xì)胞依賴 p53的凋亡發(fā)生率［9，10］。

150醫(yī)院課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，iASPP－mRNA在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者中的表達(dá)率為87．9%（51／58）；免疫組化染色結(jié)果顯示 iASPP 在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)率為 91．4%（53／58）。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在乳腺浸潤(rùn)性小葉癌組織中也有iASPP的表達(dá)。不同的年齡組iASPP－mRNA的表達(dá)差異也有顯著性；iASPP的表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)；但與雌、孕激素受體的表達(dá)無(wú)關(guān)［11－13］。在本研究中筆者針對(duì) iASPP 在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者中的表達(dá)差異，研究了陽(yáng)性患者和陰性患者的生存時(shí)間，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)29～96個(gè)月的隨訪，iASPP表達(dá)陽(yáng)性患者的中位生存時(shí)間為（65．4±5．54） 個(gè)月，陰性患者的中位生存時(shí)間為（82．1±7．76）個(gè)月，二者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此提示有必要檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者中iASPP的表達(dá)情況，并加強(qiáng)隨訪，以期早發(fā)現(xiàn)其復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，針對(duì)iASPP高表達(dá)患者采取必要的靶向治療，以提高患者的生存時(shí)間和生存率。

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