劉相佟 王友信 楊興華 董 晶 王 嵬 郭秀花*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系，北京100069;2.臨床流行病學(xué)北京市重點實驗室，北京100069;3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院健康體檢科，北京100053;4.埃迪斯科文大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，珀斯6027，澳大利亞)

糖基化(glycosylation)是指蛋白質(zhì)或脂質(zhì)在酶的作用下被連接上糖鏈的過程。作為生物體內(nèi)最為重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式之一，糖基化調(diào)控了蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞中的定位、功能、活性、壽命和多樣［1-2］。細(xì)胞內(nèi)超過50%的蛋白質(zhì)都修飾有糖鏈，它們參與細(xì)胞識別、細(xì)胞分化、發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等在內(nèi)的各種重要的生命活動。多種疾病如腫瘤、代謝性疾病、心血管病、免疫性疾病及感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程均伴隨著蛋白質(zhì)糖基化異常的發(fā)生［3-4］。所以，針對糖鏈形成、糖鏈結(jié)構(gòu)和糖鏈功能的糖生物學(xué)研究有助于深入認(rèn)識生命現(xiàn)象的本質(zhì)、闡明疾病發(fā)生機(jī)制、以及為疾病的早期診斷和治療提供指導(dǎo)，已成為當(dāng)前生命科學(xué)不可忽視的領(lǐng)域。

根據(jù)結(jié)合位點和結(jié)構(gòu)的差異，糖鏈分為以下幾種類型:N-連接糖鏈、O-連接糖鏈、C-連接糖鏈等。其中，N-連接糖鏈最為常見，在真核生物中廣為存在，值得深入研究。N-連接糖蛋白主要定位于細(xì)胞膜表面，其合成在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中進(jìn)行。糖鏈中寡糖殘基的種類和個數(shù)、糖基鍵的類型構(gòu)成了糖鏈的長度和構(gòu)型差異，從而形成了糖鏈的多樣性。國外已有研究［5］顯示人體血漿N-糖基濃度可能存在性別及年齡決定性，但國內(nèi)當(dāng)前對此研究較少，尤其缺乏一般人群的基礎(chǔ)信息數(shù)據(jù)。因此，本研究檢測了首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院進(jìn)行健康體檢212名研究對象的N-糖基的結(jié)構(gòu)譜型，并對不同年齡進(jìn)行比較分析，為深入開展疾病與糖基化的關(guān)聯(lián)性研究提供基礎(chǔ)資料。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象

以2009年4至7月在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院進(jìn)行健康體檢調(diào)查的212名居民為研究對象，嚴(yán)格按照納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，最終篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的的212名居民為研究樣本，收集人口學(xué)信息、體格檢查和實驗室檢查結(jié)果，并進(jìn)行實驗室糖基組學(xué)檢測。

1.2 方法

1.2.1 體格檢查

由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員按照統(tǒng)一的方法，測量入選者血壓、身高、體質(zhì)量。血壓按照美國心臟聯(lián)合會推薦的方法采用同一水銀柱血壓計測量2次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。被測者測量前1 h內(nèi)避免劇烈運動以及進(jìn)食、喝含咖啡因的刺激性飲料，測量前30 min停止吸煙，精神放松，排便、排尿。被測者休息至少5 min后坐位，雙足平放地上，暴露右側(cè)手臂，平置在桌上，使得肘窩與心臟基本等高。袖帶緊貼被測者右臂上纏繞，袖帶中心的高度與心臟基本平起，袖帶下緣應(yīng)等高于被測者肘窩上方1～2 cm，進(jìn)行測量。2次測量中間間隔不少于30 s。被測者脫去鞋、帽，取立正姿勢，雙眼平視前方，頸部、軀干、胯部和膝關(guān)節(jié)要充分伸直，兩臂自然下垂，腳跟并攏，腳尖分開約60度。測試者站在側(cè)面，將身高計的水平板輕輕沿著立柱下滑直到接觸受試者頭頂，這時水平板所指的刻度，即為身高。記錄身高和體質(zhì)量的結(jié)果，分別精確到1 cm和0.5 kg。

1.2.2 樣品采集及處理方法

研究對象晨起空腹抽外周靜脈進(jìn)行血常規(guī)、血糖、血脂等項目的檢查。使用乙二胺四乙酸二鈉(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)真空采血管采集肘部外周靜脈血液樣本用于N-糖基組學(xué)分析。血液樣本采集后置于冰盒中進(jìn)行樣本的運送。到達(dá)實驗室后，將采血管從冰盒中取出，按照樣本編號順序、平穩(wěn)地置于1.5 mL離心管架上，在室溫下靜置10 min左右。然后，進(jìn)行血漿樣本分離，常溫3 000 r/min離心10 min，迅速吸取上層血漿樣本100 μL左右(根據(jù)離心后，上層血漿量而定)，分裝于3個1.5 mL離心管，置于-80℃低溫冰箱中保存。

1.2.3 血漿N-糖基結(jié)構(gòu)檢測方法

本研究采用高效液相色譜儀Alliance 2695(美國Waters公司)對血漿N-糖基進(jìn)行高通量檢測，該方法的簡要流程為:5 μL的血漿樣本置于96孔板中，采用多肽 N-糖苷酶(peptide N-glyeosidase F，PNGase F)將與蛋白質(zhì)結(jié)合的糖鏈消化下來。然后，采用2-氨基苯甲酰胺(2-aminobenzamide，2-AB)進(jìn)行熒光標(biāo)記，標(biāo)記的糖鏈真空干燥，在使用前用水溶解;標(biāo)記的樣本使用親水相互作用色譜在30℃、進(jìn)行60 min的分析，可以得到16個包含糖鏈結(jié)構(gòu)的色譜峰區(qū)域。根據(jù)色譜峰內(nèi)包含糖基結(jié)構(gòu)的GU(glycan unit)單位與數(shù)據(jù)庫(http:∥glycobase.nibrt.ie)比對后確定糖基組組成和含量。然后，2-AB標(biāo)記的N-糖鏈通過唾液酸酶處理，切除α2-3、α2-6和α2-8連接的唾液酸，然后用親水相互作用色譜進(jìn)行分析，最終得到13個去唾液酸的糖鏈色譜峰。N-糖鏈采用弱陰離子交換色譜(weak anion exchange-HPLC，WAX-HPLC)的方法進(jìn)行檢測:糖鏈經(jīng)Prozyme GlycoSep C 75 mm×7.5 mm色譜柱(美國Anachem公司)進(jìn)行分析，N-糖鏈按照含有唾液酸的數(shù)量而分離出4種糖基結(jié)構(gòu)(包括monosialylated，disialylated，trisialylated，tetrasialylated 糖基化修飾的糖基結(jié)構(gòu))。

1)正相高效液相色譜分析:(1)色譜柱:TSKgel Amide-80 5 μm 250 mm × 4.6 mm 色 譜 柱(美 國Anachem公司)，用于180、120或60 min的分析。(2)條件:分析溫度為30℃。(3)試劑:pH 4.4 50 mmol/L蟻酸(美國Merck公司)與氨水(美國Sigma公司)混合，作為溶劑A;乙腈(美國J.T.Baker公司)作為溶劑B。(4)儀器:180、120或30 min分析采用的是具有吸收、激發(fā)波長分別為330 nm和420 nm熒光探測儀(美國Waters公司)的Alliance 2695分離系統(tǒng)。

2)弱陰離子交換色譜分析:(1)色譜柱:糖鏈經(jīng)Prozyme GlycoSep C 75 mm×7.5 mm色譜柱(美國Anachem公司)進(jìn)行分析。(2)條件:分析溫度為30℃。(3)試劑:20%乙腈(美國J.T.Baker公司)作為溶劑A，Ph7.0 0.1 mmol/L蟻酸(美國Merck公司)與氨水(美國Sigma公司)混合，溶于20%乙腈(美國J.T.Baker公司)作為溶劑B。

最終，每一個色譜峰(glycan peak，GP)所對應(yīng)的面積采用所占全部糖基組色譜面積的相對百分?jǐn)?shù)表示，如GP1至 GP16的16個色譜峰面積的總和是100%，每個色譜峰的面積是該色譜峰占總色譜峰面積的百分?jǐn)?shù)。將具有相同特點的色譜峰進(jìn)行合并計算，得到特定N-糖基結(jié)構(gòu)的血漿含量［6］。

1.3 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡在18歲以上;② 自愿參加此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn):①婦女妊娠期;②查體者近期曾服用甲狀腺素、雌激素、噻嗪類利尿藥、β-受體阻斷劑、苯妥英鈉以及口服避孕藥等影響血脂的藥物;③患有甲狀腺功能亢進(jìn)或減退、皮質(zhì)醇增多癥、垂體瘤等內(nèi)分泌疾病可影響血脂者;④腎功能不全者。

1.4 質(zhì)量控制

①嚴(yán)格按照研究對象的納入、排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究對象的選擇;②調(diào)查前，血壓計、身高、體質(zhì)量計的校正;③ 研究人員統(tǒng)一培訓(xùn)，包括血壓測量方法、身高、體質(zhì)量的檢查方法等;④ 采集的血液樣本及時采用干冰進(jìn)行冷藏運送，取回后在實驗室進(jìn)行及時處理，置于-80℃低溫冰箱保存;⑤所有數(shù)據(jù)進(jìn)行雙錄入，檢查數(shù)據(jù)的邏輯錯誤、異常值及缺失值等。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，由于樣本含量n≤2 000，正態(tài)性檢驗采用Shapiro-Wilk(W檢驗)，正態(tài)分布資料以均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差描述，不同年齡的比較采用兩獨立樣本t檢驗;非正態(tài)分布資料以中位數(shù)(Median)、四分位數(shù)間距描述，不同年齡的比較采非參檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)指標(biāo)

212名體檢者的平均年齡為(37.78±17.89)歲。其中，男性99人(46.70%)，平均年齡為(34.10±14.37)歲;女性 113人(53.30%)，平均年齡為(41.01±19.99)歲。

2.2 不同年齡人群N-糖基的結(jié)構(gòu)譜型分布

分年齡對血漿N-糖基含量的分布進(jìn)行正態(tài)性檢驗，結(jié)果顯示，兩年齡組均符合正態(tài)分布的為:二半乳糖聚糖(digalactosylated glycans，G2)、四半乳糖聚糖(tetragalactosylated glycans，G4)、單唾液酸化雙觸角聚糖(monosialylated biantennary glycans，BAMS)、二唾液酸化雙觸角聚糖(disialylated biantennary glycans，BADS)、單唾液酸聚糖(monosialylatedglycans，Monosialo)、二唾液酸聚糖(disialylatedglycans，Disialo)、核心巖藻糖化聚糖(core-fucosylated glycans，F(xiàn)UC_C)、雙觸角聚糖(biantennary glycans，BA)、四觸角聚糖(tentraantennary glycans，TA)(P ＞0.05)。對總體進(jìn)行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的為:單半乳糖聚糖(monogalactosylated glycans，G1)、四半乳糖聚糖(G4)、單唾液酸化雙觸角聚糖(BAMS)、二唾液酸化雙觸角聚糖(BADS)、單唾液酸聚糖(Monosialo)、二唾液酸聚糖(Disialo)、核心巖藻糖化聚糖(FUC_C)、雙觸角聚糖(BA)、四觸角聚糖(TA)(P＞0.05)，不服從正態(tài)分布的有:非半乳糖聚糖(non-galactosylated glycans，G0)、二半乳糖聚糖(G2)、三半乳糖聚糖(trigalactosylated glycans，G3)、雙觸角非半乳糖聚糖(biantennary nongalactosylated glycans，A2)、三唾液酸聚糖(Trisialylatedglycans，Trisialo)、四唾液酸聚糖(tetrasialylatedglycans，Tetrasialo)、核心巖藻糖化聚糖(antennary fucosylated glycans，F(xiàn)UC_A)、三觸角聚糖(triantennary glycans，TRIA)(P ＜0.05，表1)。

2.3 同性別不同年齡的N-糖基結(jié)構(gòu)比較

對于男性，年齡＜35歲男性，N-糖基含量最大者為雙觸角聚糖(BA)(81.01±2.17)，最小者為四半乳糖聚糖(G4)(1.29±0.31);對于年齡≥35歲組，N-糖基含量最大者為雙觸角聚糖(BA)(82.15±2.05)，最小者為四半乳糖聚糖(G4)(1.23±0.25)。不同年齡組比較，＜35歲男性血漿二唾液酸化雙觸角聚糖(BADS)、四觸角聚糖(TA)、雙觸角非半乳糖聚糖(A2)、三唾液酸(Trisialo)和三觸角聚糖(TRIA)含量較高(P＜0.05);≥35歲男性者血漿二半乳糖聚糖(G2)、單唾液酸(Monosialo)、核心巖藻糖化聚糖(FUC_C)和雙觸角聚糖(BA)含量較高(P﹤0.05)(表2、3)。

對于女性，年齡＜35歲組，N-糖基含量最大者為雙觸角聚糖(BA)(81.77±1.74)，最小者為四半乳糖聚糖(G4)(1.31±0.28);對于年齡≥35歲女性，N-糖基含量最大者為雙觸角聚糖(BA)(82.74±2.03)，最小者為四半乳糖聚糖(G4)(1.26±0.24)。不同年齡組比較，＜35歲組女性的血漿二唾液酸化雙觸角聚糖(BADS)、四觸角聚糖(TA)、非半乳糖聚糖(G0)、三

半乳糖聚糖(G3)、雙觸角非半乳糖聚糖(A2)、三唾液酸(Trisialo)和三觸角聚糖(TRIA)含量較高(P＜0.05);≥35歲組女性的血漿二半乳糖聚糖(G2)、單唾液酸化雙觸角聚糖(BAMS)、單唾液酸(Monosialo)、核心巖藻糖化聚糖(FUC_C)和雙觸角聚糖(BA)含量較高(表4、5)。

表1 17種N-糖基結(jié)構(gòu)的含量分布正態(tài)性檢驗結(jié)果Tab.1 Results of normality test for 17 N-glycans distribution

表2 男性不同年齡的正態(tài)分布血漿N-糖基結(jié)構(gòu)的比較Tab.2 Comparison of normal distribution plasma N-glycans between age groups for males

表3 男性不同年齡的偏態(tài)分布血漿N-糖基結(jié)構(gòu)的比較Tab.3 Comparison of non-normal distribution plasma N-glycans between age groups for males

表4 女性不同年齡的正態(tài)分布血漿N-糖基結(jié)構(gòu)的比較Tab.4 Comparison of normal distribution plasma N-glycans between age groups for females

表5 女性不同年齡的偏態(tài)分布血漿N-糖基結(jié)構(gòu)的比較Tab.5 Comparison of non-normal distribution plasma N-glycans between age groups for female

3 討論

21世紀(jì)，作為一個全球面臨的重大挑戰(zhàn)，人口的老齡化引起了越來越多的關(guān)注。隨之，與老齡化相關(guān)的病理生理學(xué)進(jìn)展、遺傳學(xué)機(jī)制研究應(yīng)運而生［5］。并且，糖基組學(xué)研究已經(jīng)成為繼基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)后的新興研究熱點。肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤標(biāo)志物的糖基組學(xué)尤其以 N-糖基化研究［7-12］較多，但國內(nèi)的研究［13-16］相對較少，對健康人群糖基組學(xué)的研究探索更是罕見。因此，糖生物學(xué)與年齡的關(guān)聯(lián)研究逐漸成為熱點。

本研究顯示，對于血漿N-糖基分布的分析顯示，總體符合正態(tài)分布的有:單半乳糖聚糖、四半乳糖聚糖、單唾液酸化雙觸角聚糖、二唾液酸化雙觸角聚糖、單唾液酸、二唾液酸、三唾液酸、核心巖藻糖化聚糖、雙觸角聚糖和四觸角聚糖。兩年齡組均符合正態(tài)分布的為:二半乳糖聚糖、四半乳糖聚糖、單唾液酸化雙觸角聚糖、二唾液酸化雙觸角聚糖、單唾液酸、二唾液酸、核心巖藻糖化聚糖、雙觸角聚糖和四觸角聚糖。這提示在實際臨床應(yīng)用中，醫(yī)學(xué)參考值范圍的計算方法應(yīng)由某種糖基含量在具體人群的分布決定。

不論是總體，還是2年齡組，N-糖基相對含量最高均為雙觸角聚糖，最低為四半乳糖聚糖。這說明，研究對象血漿四半乳糖聚糖糖基化相對含量最低，而雙觸角聚糖則為最普遍的糖基，這與之前的研究［17］結(jié)果相似。

無論男性女性，半乳糖基化水平，≥35歲組二半乳糖聚糖含量較高、雙觸角非半乳糖聚糖含量較低;在兩分支糖基的唾液酸化水平，＜35歲組二唾液酸化雙觸角聚糖含量較高;在唾液酸化水平，≥35歲組單唾液酸含量高、三唾液酸較低?！?5歲組巖藻糖基化位置，核心巖藻糖化聚糖含量高。以上結(jié)果說明血漿N-糖基結(jié)構(gòu)水平可能與年齡有關(guān)，與國內(nèi)外研究［18-21］相似，這提示不論種族，相應(yīng)糖基結(jié)構(gòu)應(yīng)納入到老齡化的機(jī)制研究中。而在分支水平，≥35歲組雙觸角聚糖含量較高，三觸角聚糖和四觸角聚糖含量較低，這與Ding等［5］對中國北方人群的研究結(jié)果相似，可以開展大樣本隊列或縱向研究進(jìn)一步探討。

通過對血漿N-糖鏈的結(jié)構(gòu)檢測發(fā)現(xiàn)17個糖基結(jié)構(gòu)，這些糖基結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)為下一步特異糖鏈的結(jié)構(gòu)解析奠定了基礎(chǔ)，并為糖鏈的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能的研究提供了新的思路。而不同年齡的糖基結(jié)構(gòu)差異提示蛋白質(zhì)的糖基化修飾水平可能與年齡有關(guān)，這也為大量開展蛋白質(zhì)糖基化水平檢測提供基礎(chǔ)信息，從而為疾病的診斷預(yù)測提供科學(xué)依據(jù)。

［1］ Parodi A J.Reglucosylation of glycoproteins and quality control of glycoprotein folding in the endoplasmic reticulum of yeast cells［J］.Biochim Biophys Acta，1999，1426(2):287-295.

［2］ Arnold J N，Wormald M R，Sim R B，et al.The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins［J］.Annu Rev Immunol，2007，25:21-50.

［3］ Litynska A，Przybylo M，Pochec E，et al.Comparison of the lectin-binding pattern in different human melanoma cell lines［J］.Melanoma Res，2001，11(3):205-212.

［4］ Krishnan V，Bane S M，Kawle P D，et al.Altered melanoma cell surface glycosylation mediates organ specific adhesion and metastasis via lectin receptors on the lung vascular endothelium［J］.Clin Exp Metastasis，2005，22(1):11-24.

［5］ Ding N，Nie H，Sun X，et al.Human serum N-glycan profiles are age and sex dependent［J］.Age Ageing，2011，40(5):568-575.

［6］ Knezevic A，Gornik O，Polasek O，et al.Effects of aging，body mass index，plasma lipid profiles，smoking on human plasma N-glycans［J］.Glycobiology，2010，20(8):959-969.

［7］ Ahn J M，Sung H J，Yoon Y H，et al.Integrated glycoproteomics demonstrates fucosylated serum paraoxonase 1 alterations in small cell lung cancer［J］.Mol Cell Proteomics，2014，13(1):30-48.

［8］ Ruhaak L R，Nguyen U T，Stroble C，et al.Enrichment strategies in glycomics-based lung cancer biomarker development［J］.Proteomics Clin Appl，2013，11(3):1-20.

［9］ Zhao Y P，Ruan C P，Wang H，et al.Identification and assessment of new biomarkers for colorectal cancer with serum N-glycan profiling［J］.Cancer，2012，118(3):639-650.

［10］ Saeland E，Belo A I，Mongera S，et al.Differential glycosylation of MUC1 and CEACAM5 between normal mucosa and tumour tissue of colon cancer patients［J］.Int J Cancer，2012，131(1):117-128.

［11］Saldova R，Reuben J M，Abd Hamid U M，et al.Levels of specific serum N-glycans identify breast cancer patients with higher circulating tumor cell counts［J］.Ann Oncol，2011，22(5):1113-1119.

［12］Saldova R，F(xiàn)an Y，F(xiàn)itzpatrick J M，et al.Core fucosylation and alpha2-3 sialylation in serum N-glycome is significantly increased in prostate cancer comparing to benign prostate hyperplasia［J］.Glycobiology，2011，21(2):195-205.

［13］何椿鵬，華玲，楊小盼，等.不同腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白N-糖基化修飾糖鏈的初步分析［J］.國際藥學(xué)研究雜志，2013，3:344-349，364.

［14］徐秀英.低糖基化E-鈣粘蛋白對舌癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響［D］.濟(jì)南:山東大學(xué)，2012.

［15］姚媛菲.乳腺癌細(xì)胞系 N-糖基化特征性糖鏈的分析［D］.哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2009.

［16］丁寧.乳腺癌患者與健康人血清N-糖基化糖鏈差異的比較分析［D］.哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2009.

［17］Knezevic A，Polasek O，Gornik O，et al.Variability，heritability and environmental determinants of human plasma N-glycome［J］.J Proteome Res，2009，8(2):694-701.

［18］Byerley L O，Leamy L，Tam S W，et al.Development of a serum profile for healthy aging［J］.Age:Dordr，2010，32(4):497-507.

［19］Vanhooren V，Laroy W，Libert C，et al.N-glycan profiling in the study of human aging［J］.Biogerontology，2008，9(5):351-356.

［20］Vanhooren V，Liu X E，F(xiàn)ranceschi C，et al.N-glycan profiles as tools in diagnosis of hepatocellular carcinoma and prediction of healthy human ageing［J］.Mech Ageing Dev，2009，130(1-2):92-97.

［21］Lu J P，Knezevic A，Wang Y X，et al.Screening novel biomarkers for metabolic syndrome by profiling human plasma N-glycans in Chinese Han and Croatian populations［J］.J Proteome Res，2011，10(11):4959-4969.